三角帆蚌dPGAM基因的克隆與表達分析

應晨怡 謝陳南 張根芳 周 淼 許海方 黃蕓潔 陳旭旭 楊受保,*

(1 紹興文理學院生命科學學院，浙江 紹興 312000；2 金華職業(yè)技術學院農業(yè)與生物工程學院，浙江 金華 321007；3 諸暨市水產技術推廣站，浙江 諸暨 311800)

磷酸甘油酸變位酶(phosphog1ycerate mutase, PGAM)是糖酵解和糖異生途徑中催化3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸之間相互轉化反應的一種糖酵解酶[1]。根據催化反應中對輔因子2,3-二磷酸甘油酸的依賴關系，PGAM可分為輔因子依賴型(cofactor-dependent PGAM, dPGAM)和非依賴型(cofactor independent PGAM，iPGAM)，其中dPGAM屬于酸性磷酸酶超家族，通常以單體、二聚體或四聚體的形式存在于脊椎動物、大部分無脊椎動物、某些真菌和細菌中；其單體分子由近250個氨基酸組成，分子量近27 kDa；iPGAM屬于堿性磷酸酶超家族，以約500個氨基酸組成的近60 kDa的單體形式存在于植物、部分無脊椎動物、某些真菌和細菌中[2-4]。研究發(fā)現，PGAM與碳水化合物轉運、新陳代謝調節(jié)和生長發(fā)育等有關[5]。如豬的PGAM2基因定位于染色體18 q11.3-q12[6]，該區(qū)域存在與瘦肉率、肌纖維直徑、肌肉的產量及質量相關的數量性狀定位(quantitative trait locus，QTL)[7-8]；豬PGAM2主要在骨骼肌、心肌等肌肉組織中表達，且在肌肉發(fā)育的各個階段均呈高水平表達，在肌肉發(fā)育和生長過程中有重要作用[9]；豬PGAM2在細胞質和細胞核內均有定位，參與胞質和胞核內的糖代謝過程[6]。而人PGAM在多種腫瘤細胞中高表達，PGAM基因沉默可有效抑制乳腺癌、前列腺癌等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[10-12]。此外，PGAM在弓形蟲侵入的過程中，不僅與弓形蟲的新陳代謝及生長發(fā)育呈正相關，在宿主中的表達水平也明顯增強[13-15]。上述研究表明，PGAM在有機體能量代謝中發(fā)揮著重要作用，廣泛參與新陳代謝、生長發(fā)育、腫瘤、病原與宿主相互作用等生物學過程。

目前在細菌、真菌、無脊椎動物吸蟲、脊椎動物等不同進化地位的生物中，已有關于PGAM及其功能的研究報道[15-21]，但在無脊椎動物貝類中僅有太平洋牡蠣PGAM的序列相關信息(GenBank序列號：EKC26210)[22]，關于PGAM基因在貝類生物生長發(fā)育、免疫防御反應過程中功能的研究尚未見報道。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國特有的淡水珍珠養(yǎng)殖蚌種[23]，其生產的珍珠占世界淡水珍珠總產量的80%以上，但由于淡水無核珠大多為個體小、形狀不規(guī)則、顏色各異的劣質珠，導致我國淡水珍珠產值僅占國際總貿易額的5%左右[24-26]。因此，利用經選育的產純色珍珠的育珠蚌，結合分子標記開展輔助育種，選育生長快、產純色珍珠的育珠蚌，能有效促進我國淡水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究從三角帆蚌中克隆了PGAM基因的全長cDNA序列，并對該基因在紫色家系三角帆蚌和黃色家系三角帆蚌不同組織中的轉錄表達以及在貝類抗感染免疫反應中的功能作用進行分析，以期為深入探討PGAM基因在三角帆蚌生長發(fā)育中的功能，并以該基因為分子標記，為開展三角帆蚌的選擇育種提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

三角帆蚌為經選育的產紫色珍珠家系(紫色蚌)和黃色珍珠家系(黃色蚌)個體，平均體重約50 g，取自浙江省金華市威旺養(yǎng)殖新技術有限公司。試驗前在經曝氣的水族箱中養(yǎng)殖7 d，養(yǎng)殖期間投喂小球藻。每箱水的體積為100 L，水溫為22.0±1.0℃。

以紫色家系三角帆蚌蚌為材料，5只蚌為1組，每組設3次生物學重復，分別用注射器自閉殼肌注射100 μL嗜水氣單胞菌懸液(5×107cfu·mL-1)，對照注射100 μL 0.6%生理鹽水[23-24]。于誘導刺激0(CK)、12、24、48和72 h后，分別用一次性注射器從三角帆蚌圍心腔中抽取血淋巴液，轉入無菌、經焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理并預冷的1.5 mL離心管中，于4℃條件下800 r·min-1離心5 min，得到三角帆蚌血淋巴細胞。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和反轉錄 分別取紫色系和黃色系三角帆蚌的鰓、外套膜、閉殼肌、消化腺、性腺組織、血淋巴細胞。按照TRIzol試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]說明書抽提各組織的總RNA；參照反轉錄試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]說明書進行反轉錄，獲得cDNA模板。

1.2.2 全長序列克隆 以紹興文理學院貝類育種實驗室之前構建的三角帆蚌全長cDNA文庫中獲得的PGAM基因部分cDNA序列(未發(fā)表)為基礎，設計5′RACE引物HCPGAM5′R(5′-C T C A G A C T G T T A C C A T G T G C A G CA-3′)和3′RACE引物HCPGAM3′F (5′-C T C C A C C A C C A C T G G A G C C T AC-3′)，利用HCPGAM5′R和HCPGAM3′F分別和試劑盒(Clontech，USA)自帶的通用引物(universal primer，UPM)分別配對，用于擴增三角帆蚌PGAM基因的5′和3′端序列。5′和3′-RACE PCR操作步驟與參數參照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit [Clontech，USA]說明書進行。擴增得到的片段經回收純化后與pGM-T載體[天根生化科技(北京)有限公司]連接，然后轉化至大腸桿菌JM109[TAKARA(日本)]感受態(tài)細胞中，經PCR鑒定為陽性克隆后送至杭州擎科生物公司測序；所得序列經BLAST在線比對確認為所需的PGAM基因cDNA序列。

1.2.3 序列比對與進化分析 利用NCBI數據庫中的BLAST(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast)和Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行HcdPGAM基因的序列比對和同源性分析[27]；利用NCBI數據庫中的ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)和Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan)進行開放閱讀框和功能域預測；利用Mega 7.0軟件中的鄰接(Neighbor-joining)法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 組織分布與表達 利用實時熒光定量PCR檢測各組織中PGAM基因的表達情況[24]。反應體系為25 μL，其中含SYBRPremixExTaq(2×) 12.5 μL，cDNA 模板1.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min，95℃變性20 s， 56℃退火40 s。以β-actin基因作為內參基因(GenBank序列號：HM045420.1)。所用引物為: PGqf (5′-G T G G C T G G T T T G A T G C A GA-3′)和PGqr (5′-T C T T T A C T T G T G C T T C T C CA-3′)；ActRT-f (5′-G A T G A T A T G G A G A A G A T C TG-3′)和ActRT-r (5′-C A T C A C C A G A G T C T A A G A CA-3′)，采用2-ΔΔCt法[28]計算基因相對表達量。

1.3 數據分析

采用軟件SPSS 20.0對試驗數據進行單因素方差分析(one-way，ANOVA)，結果以mean±SD表示，P<0.05表示存在顯著性差異，P<0.01表示存在極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 三角帆蚌HcdPGAM的克隆、序列特征與系統(tǒng)進化分析

利用獲得的三角帆蚌PGAM基因部分cDNA序列，經PCR擴增，獲得長度約750 bp片段(圖1)。經克隆、測序比對，三角帆蚌PGAM基因的cDNA全長為1 470 bp (GenBank序列號：MH410486)，含有1個長度為750 bp的開放閱讀框，編碼250個氨基酸的假定蛋白，該蛋白的預測等電點和相對分子質量分別為7.10和28.66 kDa，屬于dPGAM，因此命名為HcdPGAM。在起始密碼子ATG的上游為16 bp非翻譯區(qū)，終止密碼子TGA的下游為701 bp的非編碼區(qū)(圖2)，并含有1個由226個氨基酸組成的組氨酸磷酸酶結構域(histidine phosphatase domain，5～230 aa)。

注：L1: 5′端擴增產物；L2: 3′端擴增產物。Note: L1: Product of 5′RACE-PCR products. L2: Product of 3′RACE-PCR products.圖1 HcdPGAM基因5′和3′RACE-PCR產物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis pattern of 5′ and 3′ RACE-PCR products of HcdPGAM gene

同源性比對結果顯示，三角帆蚌HcdPGAM的氨基酸全序列總體上與所選取的各種生物PGAM蛋白的相似性在58.8%～82.0%之間(圖3、圖4)，其中與太平洋牡蠣(Crassosteagigas，GenBank序列號：EKC26210)的相似性最高，為82.0%；其次為加利佛利亞海兔(Aplysiacalifornica，GenBank序列號：XP_005089803)，相似性為73.6%；與中華蜜蜂(Apiscerana，GenBank序列號：NP_012770.1)相似性最低，為58.8%。同時，三角帆蚌HcdPGAM與其他生物的組氨酸磷酸酶結構域的序列相似性均在58.7%以上，總體上與全序列相似性數值相近(圖3)。

利用MEGA 7.0軟件構建PGAM蛋白的系統(tǒng)進化樹，結果表明，三角帆蚌HcdPGAM與太平洋牡蠣的dPGAM蛋白進化關系最近，并與海兔等無脊椎動物dPGAM蛋白聚為一支(圖4)，而與脊椎動物及昆蟲的dPGAM蛋白序列的進化關系較遠。綜上，本研究所獲得的三角帆蚌HcdPGAM為dPGAM蛋白亞家族的一個新成員。

注：左側數字為核苷酸和氨基酸的數量。3′端含有的多腺苷酸加尾信號用下劃線標出。Note：The nucleotides and amino acids are numbered along the left margin. The classical polyadenylation signals in the 3′ UTR is underlined.圖2 三角帆蚌HcdPGAM基因的核苷酸和氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HcdPGAM gene from H.cumingii

圖3 HcdPGAM氨基酸序列的比對分析Fig.3 Multiple alignment of the amino acid sequences for HcdPGAM

圖4 HcdPGAM氨基酸序列的進化分析Fig.4 Multiple alignment of the amino acid sequences for HcdPGAM

2.2 三角帆蚌HcdPGAM基因的組織表達分析

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，HcdPGAM在紫色系和黃色系三角帆蚌鰓、外套膜、閉殼肌、消化腺、性腺和血淋巴6種組織中均有表達，但同一家系的不同組織間，以及不同家系之間的表達水平均存在差異。紫色系三角帆蚌中，HcdPGAM在性腺(8.10倍)中表達水平最高，其次為閉殼肌(6.28倍)和腮(4.11倍)，在消化腺(2.66倍)、外套膜(1.63倍)和血淋巴細胞(1.23倍)中表達水平相對較低；而黃色系蚌中，HcdPGAM在性腺(7.78倍)中表達水平也最高，其次為閉殼肌(3.54倍)和腮(3.30倍)，在消化腺(2.47倍)、外套膜(2.05倍)和血淋巴細胞(1.35倍)中表達水平相對較低。紫色系和黃色系三角帆蚌相同組織間的比較結果顯示，紫色系蚌的性腺、閉殼肌、腮和消化腺中HcdPGAM表達水平均高于黃色系，尤其是閉殼肌中，紫色系蚌的HcdPGAM的表達水平顯著高于黃色系(P<0.05)；而外套膜和血淋巴細胞中HcdPGAM的表達水平則低于黃色系蚌，2個家系其他相同組織之間表達水平的差異均不顯著(圖5)。

注：*表示在0.05水平差異顯著。**表示在0.01水平差異顯著。下同。Note: * indicates significant difference at 0.05 level. ** indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.圖5 HcdPGAM在三角帆蚌不同組織中的表達Fig.5 Expression of HcdPGAM in various tissues of H.cumimgii

2.3 嗜水氣單胞菌誘導刺激下三角帆蚌HcdPGAM基因的表達量

為分析三角帆蚌血細胞中HcdPGAM基因在抗病原菌感染的天然免疫反應中的功能作用，以紫色家系三角帆蚌為材料，在嗜水氣單胞菌誘導刺激不同處理時間分別取樣，進行實時熒光定量PCR分析。由圖6可知，隨著處理時間的延長，HcdPGAM的表達水平呈先升高后降低的趨勢，嗜水氣單胞菌誘導刺激12 h后，HcdPGAM表達水平明顯升高，至24和48 h時，均極顯著高于CK，隨后其表達水平下降，至72 h時表達量與CK間無顯著差異。由此可見，嗜水氣單胞菌誘導刺激可調節(jié)三角帆蚌HcdPGAM的表達水平，即HcdPGAM基因在三角帆蚌抗細菌感染的天然免疫相關能量代謝過程中可能發(fā)揮重要作用。

圖6 嗜水氣單胞菌誘導對三角帆蚌HcdPGAM基因表達的影響Fig.6 Effect of Aeromonas hydrophila challenge on the expression of HcdPGAM

3 討論

PGAM是糖酵解和糖異生途徑中的關鍵酶系之一，在碳水化合物轉運、新陳代謝調節(jié)和生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用[5,29]。本研究克隆了三角帆蚌的PGAM基因的cDNA序列，分析發(fā)現該序列包括1個750 bp的開放閱讀框，編碼1個含250個氨基酸、分子質量近28.66 kDa的假定蛋白，并含有1個保守的由247個氨基酸組成的組氨酸磷酸酶結構域。三角帆蚌PGAM的全長氨基酸序列或組氨酸磷酸酶結構域，與各種不同進化地位動物中該蛋白的氨基酸序列相似性均在53%以上。系統(tǒng)進化分析結果也顯示，三角帆蚌PGAM與無脊椎動物PGAM蛋白聚為一支，而與脊椎動物進化上相距較遠。上述結果均表明，本研究所克隆的HcdPGAM具有與其他生物dPGAM蛋白高度相似的分子量大小、序列與結構特征。

前人研究表明，在芽孢桿菌等細菌和秀麗線蟲中，通過RNAi技術降低PGAM的活性，會導致機體出現形態(tài)異常、發(fā)育異常等現象[17-18,21]。豬PGAM2主要在骨骼肌和心肌等肌肉組織中表達，在豬胚胎骨骼肌發(fā)育過程中(妊娠33～90 d)呈差異性表達，與骨骼肌的發(fā)育有關；且在通城豬(中國地方豬種)和長白豬(瘦肉型豬)骨骼肌發(fā)育的不同時期呈規(guī)律性表達，說明PGAM2可能與豬的產肉性狀有關[9]。此外，PGAM在多種人類來源的腫瘤細胞中也高水平表達，是1個潛在的腫瘤標志物及治療靶點[30-32]。綜上表明，PGAM可作為在機體能量代謝、細胞增殖、骨骼肌及個體生長發(fā)育等研究中的分子標記。

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，HcdPGAMmRNA在紫色蚌和黃色蚌的6種組織(鰓、外套膜、閉殼肌、消化腺、性腺和血淋巴細胞)中呈組成性表達；2個家系中性腺、閉殼肌和腮組織均呈現較高的表達水平，表明HcdPGAM在這3個組織中具有重要作用。

腮是參與貝類代謝與免疫的主要器官之一，在攝食、代謝和防御外界異物入侵等方面發(fā)揮著重要的作用，本研究中HcdPGAM的高水平表達說明HcdPGAM在腮攝食、代謝和免疫防御等過程中發(fā)揮重要作用。而閉殼肌不僅與貝殼的開張有關，還可以借其有節(jié)律的收縮控制外套腔內水的交換，HcdPGAM的表達量可能與三角帆蚌閉殼肌生長發(fā)育以及運動過程中能量代謝有關。2個家系蚌相同組織間比較結果顯示，紫色蚌性腺、腮和消化腺中的HcdPGAM基因表達水平明顯高于黃色蚌，這可能與2個家系蚌的性腺發(fā)育不同步，對能量需求高低不一致有關。紫色蚌中閉殼肌組織的表達水平顯著高于黃色蚌，表明紫色蚌中具有更高的能量代謝水平，即紫色蚌可能比黃色蚌更具生長優(yōu)勢，這一點在育珠生產實踐已被證實。研究表明，閉殼肌是貝類選擇育種及定向培育中常用的指標之一[33]，HcdPGAM基因在三角帆蚌閉殼肌中的表達模式，表明HcdPGAM不僅與三角帆蚌上述3個組織中高水平的能量代謝需求有關，同時也與其生長發(fā)育有關，該基因可以作為貝類分子輔助育種的潛在的標記。下一步的研究方向可結合其他生長、生產性狀，對育珠蚌同一家系不同世代及不同家系相同世代之間，進行HcdPGAM基因的表達情況分析。

有研究發(fā)現在寄生蟲侵入過程中不僅寄生蟲中PGAM的表達水平增強，宿主PGAM基因的表達水平也明顯提高[14-15]。本研究也發(fā)現，嗜水氣單胞菌誘導刺激處理可極顯著上調HcdPGAM基因的表達水平，證明HcdPGAM基因在三角帆蚌抗細菌感染的天然免疫相關能量代謝過程中也發(fā)揮著重要的作用。

4 結論

本研究結果表明，HcdPGAM與三角帆蚌的能量代謝和生長發(fā)育有關，且在三角帆蚌抗細菌感染的天然免疫相關能量代謝過程中也發(fā)揮著重要作用，但將其作為分子標記運用于貝類輔助育種仍有待進一步研究。本研究結果為深入探討PGAM基因在三角帆蚌中的功能，以及為篩選三角帆蚌不同顏色家系間的特異性分子標記提供了一定的理論依據。