西藏林芝地區(qū)五種野生食用菌氨基酸主成分分析與綜合評價

楊 林,池福敏,馮建英,張小栓,吳志剛,*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)院,西藏林芝 860000;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)成人教育學(xué)院,北京 100083)

西藏地處青藏高原西南部,海拔高,氣壓低,空氣稀薄,富氧量少,紫外線照射作用強,屬于極端氣候類型。

西藏獨特的自然地理條件為野生食用菌生長和繁衍創(chuàng)造了優(yōu)質(zhì)的生態(tài)環(huán)境,使該地區(qū)成為野生真菌資源的巨大基因庫[1]。野生食用菌味道鮮美、質(zhì)地脆嫩、熱量低,蛋白質(zhì)和氨基酸含量豐富,風(fēng)味物質(zhì)組成獨特且具有潛在的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降膽固醇、增強免疫力等生物功效,因此受到消費者的廣泛喜愛[2-5]。

氨基酸是一種在人體新陳代謝活動中起到重要作用的生物活性物質(zhì),其組成及含量是評價食用菌營養(yǎng)價值的重要指標(biāo),同時作為呈味物質(zhì)對食用菌的風(fēng)味發(fā)揮著重要作用[6-7]。目前對于野生食用菌中氨基酸營養(yǎng)價值評價的方法有很多種,于文清等[8]采用氨基酸評分、化學(xué)評分、必需氨基酸指數(shù)和等鮮濃度等評價方法比較分析了五種食用菌子實體中的蛋白質(zhì)氨基酸、游離氨基酸和呈味核苷酸的組成及含量,發(fā)現(xiàn)白蘑的營養(yǎng)和鮮味最好,肉蘑較差。楊旭昆等[9]通過氨基酸比值系法對產(chǎn)自云南本地的7種野生食用菌中的氨基酸進行營養(yǎng)價值評價,發(fā)現(xiàn)雞樅的氨基酸營養(yǎng)價值最高,并提出野生食用菌中的氨基酸含量差異較大,有必要對更多種類、不同產(chǎn)地食用菌的氨基酸組成進行深入研究。馬長中等[10]研究得出采自西藏林芝地區(qū)的橙黃疣柄牛肝菌是一種高蛋白、高膳食纖維、低脂肪的健康食用菌。西藏林芝地區(qū)野生食用菌資源豐富,且味道鮮美可口,營養(yǎng)價值豐富,在當(dāng)?shù)貍涫芟M者喜愛,具有極大的開發(fā)利用潛力。但是目前對于該地區(qū)野生食用菌中氨基酸營養(yǎng)價值評價的報道還較少,尚缺乏系統(tǒng)的基礎(chǔ)理論研究。

因此,本文采用鄰苯二甲醛(OPA)和9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)柱前衍生化高效液相色譜法測定了采自林芝巴宜區(qū)比日神山的五種野生食用菌的氨基酸組成及含量,采用氨基酸比值系數(shù)法、主成分分析及聚類分析等方法評價了五種野生食用菌氨基酸的營養(yǎng)價值,旨在更好地開發(fā)利用西藏地區(qū)的野生食用菌資源,并為其深加工技術(shù)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

五種野生食用菌 均于2017年9月12日采摘自林芝巴宜區(qū)比日神山,由西藏農(nóng)牧學(xué)院何建清教授鑒定,詳細信息如表1所示;鹽酸(優(yōu)級純) 洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司;17種氨基酸標(biāo)品(色譜純) 上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙腈 均為色譜純,迪馬科技有限公司。

表1 五種野生食用菌的基本信息

ML204型萬分之一天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;Ag1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野生食用菌待測樣品的制備 將新鮮采摘的野生食用菌樣品采用液氮冷研磨處理,研磨好的樣品于-80 ℃保存待用。準(zhǔn)確稱取200 mg野生食用菌樣品于水解管中,隨后加入10 mL 6 mol/L的鹽酸(含有0.5%巰基乙酸),以氮氣吹掃封口,將密封后的水解管置于烘箱中(110±1) ℃水解22 h,水解結(jié)束后,取出水解管冷卻。從冷卻后的水解管中取出水解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,并用去離子水多次沖洗水解管后合并清洗液,定容,濾膜過濾,取濾液1 mL再次用去離子水定容于10 mL容量瓶中,濾膜過濾并轉(zhuǎn)移樣品于進樣瓶中,備用。

1.2.2 氨基酸含量的測定 采用OPA-FMOC柱前衍生化高效液相色譜法測定五種野生食用菌中氨基酸的組成及含量。色譜柱為Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A液:準(zhǔn)確稱取結(jié)晶乙酸鈉6.5 g完全溶解于1000 mL水中,加入三乙胺200 μL,并用5%的冰乙酸調(diào)pH至7.20,再加入四氫呋喃5 mL,濾膜抽濾后備用。流動相B液:準(zhǔn)確稱取結(jié)晶乙酸鈉6.5 g與400 mL水完全溶解后采用5%的冰乙酸調(diào)節(jié)PH為7.20,將此溶液與乙腈(800 mL)和甲醇(800 mL)混合后,濾膜抽濾后備用;柱溫:40 ℃;紫外檢測器:338 nm,262 nm(Pro,Hypro);梯度洗脫程序如下(表2)。本文根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對樣品中氨基酸定性,并使用外標(biāo)法計算樣品中各氨基酸的含量,每個樣品分別測定三次重復(fù)。

表2 氨基酸分析梯度洗脫表

1.2.3 野生食用菌營養(yǎng)價值評價 五種野生食用菌營養(yǎng)價值的評價以WHO/FAO提出的標(biāo)準(zhǔn)模式譜為參考,根據(jù)楊旭昆等[9]的方法分別計算五種野生食用菌中必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氨基酸比值(Ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系數(shù)(Ratio coefficient of amino acid,RCAA)和氨基酸比值系數(shù)分(Score of ratio coefficient of amino acid,SRCAA)。

1.2.4 多元數(shù)據(jù)分析 采用相關(guān)性分析、主成分分析(PCA)、聚類分析(HCA)綜合評價五種野生食用菌中氨基酸的營養(yǎng)價值[11-12]。首先根據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣中相關(guān)系數(shù)的大小判斷五種野生食用菌中氨基酸組成及含量的相關(guān)性。降維處理后對數(shù)據(jù)進行主成分分析,獲得特征值及方差貢獻率,抽取特征值大于1的成分作為主成分,以每個主成分所對應(yīng)的方差貢獻率作為權(quán)重,構(gòu)建綜合評價模型并分別計算五個野生食用菌樣品的綜合得分,所得分值越高,樣品氨基酸品質(zhì)越好。聚類分析被用來評判五種野生食用菌的差異性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析,氨基酸含量以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示,差異分析采用Duncan多重比較,“p<0.05”視為樣品間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種野生食用菌氨基酸組成及含量的比較分析

五種野生食用菌中氨基酸種類及含量的測定結(jié)果見表3。由表3可知,五種野生食用菌均含有17種氨基酸,其含量分布為0.016～3.205 mg/g,其中必需氨基酸7種,非必需氨基酸10種,且均以谷氨酸(Glu)含量為最高。五種樣品的總氨基酸含量及必需氨基酸含量均存在顯著差異(p<0.05),牛肝菌中總氨基酸含量最高,達到17.947 mg/g,白青桿菌中必需氨基酸含量最高,達6.924 mg/g,而楊樹菌中總氨基酸含量和必須氨基酸的含量均為最低,分別為3.926和1.334 mg/g。馬長中等[10]發(fā)現(xiàn)采自林芝地區(qū)的兩種橙黃疣柄牛肝菌樣品中含量最高的氨基酸也是谷氨酸。此外,五種野生食用菌中必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)范圍為0.515～0.701,白青桿菌、牛肝菌和松茸的EAA/NEAA值均高于WHO/FAO理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求的0.6。五個野生食用菌中必需氨基酸與總氨基酸含量的比值(EAA/TAA)范圍為0.340～0.421,僅有白青桿菌的EAA/TAA值(0.412)大于WHO/FAO理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求的0.4。顯然,白青桿菌可作為理想蛋白的來源。兒童必需氨基酸在兒童生長發(fā)育過程中扮演著重要的作用[12]。紅青岡菌中兒童必需氨基酸含量顯著高于其它四個野生食用菌(p<0.05),其CEAA/TAA值也最高,達到0.064。

表3 五種野生食用菌中氨基酸的組成及含量

2.2 五種野生食用菌營養(yǎng)價值評價

食物中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值與其氨基酸組成密切相關(guān),食物蛋白質(zhì)氨基酸與人體蛋白質(zhì)氨基酸組成越接近,并為人體消化吸收時,其營養(yǎng)價值越高[13]。氨基酸比值系數(shù)法是食品中氨基酸營養(yǎng)評價的常用方法[14]。本文以WHO/FAO所提出的氨基酸模式譜理論為對照對五種野生食用菌營養(yǎng)價值進行評價。圖1為五種野生食用菌必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與WHO/FAO的氨基酸模式比例的比較圖。如圖1所示,五種野生食用菌中纈氨酸(Val)和異亮氨酸(Ile)比例均明顯高于模式譜。松茸、紅青岡菌和白青桿菌的蘇氨酸(Thr)比例也均高于模式譜。松茸的亮氨酸(Leu)比例高于模式譜,其余四個樣品的亮氨酸(Leu)比例均低于模式譜。

圖1 五種野生食用菌必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與WHO/FAO的氨基酸模式比例的比較圖

表4為五種野生食用菌中必需氨基酸的RAA、RCAA和SRCAA的比較分析表。RAA為一定量食物中某種必需氨基酸的含量與WHO/FAO氨基酸模式譜中必需氨基酸含量的比值。RCAA的意義為與氨基酸模式譜相當(dāng)量的一份食物中必需氨基酸的比值,RCAA值最小的氨基酸可被視為第一限制性氨基酸。根據(jù)RCAA值可進一步計算得到SRCAA值,其值越接近100,說明野生食用菌中蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值越高[9,12-14]。由表4可知,松茸和紅青岡菌的RAA值和RCAA值更接近WHO/FAO氨基酸模式譜。五種野生食用菌的第一限制氨基酸均為蛋氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)。五種野生食用菌的SRCAA值差異顯著(p<0.05),其中最高的為紅青岡菌,達到77.267,然后依次是松茸、楊樹菌、白青桿菌和牛肝菌。顯然,紅青岡菌和松茸的營養(yǎng)價值較高,可作為優(yōu)質(zhì)的食物蛋白來源。

表4 五種野生食用菌中必需氨基酸的RAA、RCAA和SRCAA的比較分析

2.3 五種野生食用菌中呈味氨基酸的含量分析

野生食用菌的蛋白質(zhì)含量高、風(fēng)味化合物組成豐富,烹飪或加工可使食用菌蛋白降解為短肽和氨基酸[15],從而獲得更加營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特、味道鮮美的食用品質(zhì)。食品中的氨基酸按照不同的呈味特征可分為呈鮮、呈甜、呈苦和無味四大類,呈鮮味氨基酸包括天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu),呈甜味氨基酸包括絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)和脯氨酸(Pro),呈苦味氨基酸包括異亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)[16]。五種野生食用菌樣品中呈味氨基酸含量見圖2。由圖2可知,牛肝菌中呈鮮氨基酸的含量顯著高于其它野生食用菌樣品(p<0.05)。對于呈甜氨基酸含量而言,白青岡菌的含量顯著高于其它四個樣品(p<0.05)。而牛肝菌和白青桿菌中呈苦氨基酸的含量均高于其它樣品。王逍君等[17]通過對五種云南野生食用菌中主要呈味氨基酸的比較分析得出雞樅菌的呈甜氨基酸和呈鮮氨基酸含量最高,認為雞樅是一種香甜可口、清香宜人的野生食用菌。對于本研究的五種野生食用菌樣品而言,紅青岡菌、牛肝菌和白青桿菌整體的呈味氨基酸含量較高,其食用品質(zhì)更好。

圖2 五種野生食用菌中呈味氨基酸含量分析

2.4 五種野生食用菌中氨基酸的主成分分析與綜合評價

2.4.1 相關(guān)性分析 表5為五種野生食用菌中氨基酸種類間的相關(guān)性分析表,如表5所示,野生食用菌中17種氨基酸間均呈正相關(guān)關(guān)系,并且大多數(shù)氨基酸間的相關(guān)系數(shù)大于0.7,表明野生食用菌中17種氨基酸間存在較強的相關(guān)關(guān)系,因此可通過主成分分析進一步研究。

表5 五種野生食用菌中氨基酸種類間的相關(guān)性分析

2.4.2 主成分分析及聚類分析 本文通過考察特征值λ大于1并綜合考慮累計貢獻率確定主成分?jǐn)?shù)[11-12]。如表6所示,本文共提取得到兩個主成分,累計貢獻率達95.531%,可以反應(yīng)全部樣品信息。如圖3所示,第一主成分(PC1)的方差貢獻率為87.656%,其代表性氨基酸主要包括丙氨酸(Ala)、組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)等。第二主成分(PC2)的方差貢獻率為7.876%,代表性氨基酸為纈氨酸(Val)。纈氨酸(Val)是人體必需的限制性氨基酸,是常見的營養(yǎng)劑和代謝改善劑,具有治療營養(yǎng)不良癥,調(diào)節(jié)血糖,刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[18]。

表6 主成分的初始特征值

圖3 主成分的因子載荷圖

如圖4所示,五種野生食用菌按照其氨基酸組成及含量基本可分為2大類,即牛肝菌、白青桿菌和紅青岡菌歸為第一類,表明這三種野生食用菌的氨基酸組成及含量最為接近,其氨基酸品質(zhì)也較高。第二類包含了松茸和楊樹菌,其氨基酸品質(zhì)相對較差。聚類分析可以將關(guān)系更接近的樣本合并為一類,重在區(qū)分類別內(nèi)和類別間元素組成,以明確分類界限。與主成分分析相比,聚類分析不會區(qū)分元素重要性,且不會對原始數(shù)據(jù)信息進行刪減,具有等同的類別間重要性[19]。因此,本研究借助聚類分析對五種野生食用菌氨基酸品質(zhì)差異進行分析,如圖5所示,聚類分析與主成分分析得出了一致的結(jié)果,這兩種分析方法很好地說明了五種野生食用菌氨基酸組成及含量的差異性。

圖4 主成分的因子得分圖

圖5 聚類分析圖

2.4.3 綜合評價 主成分分析是通過幾個較少的綜合指標(biāo)反映整體數(shù)據(jù)樣本的一種統(tǒng)計方法,基于主成分分析的綜合評價模型已被廣泛應(yīng)用于食品品質(zhì)的分析與評價[19-20]。利用綜合評價指標(biāo)F1、F2替代試驗所測17種氨基酸,以每個主成分所對應(yīng)的方差貢獻率建立綜合評價模型,即F=0.877F1+0.079F2,結(jié)果見表7。通過計算綜合得分發(fā)現(xiàn)五種野生食用菌中牛肝菌的綜合得分最高,然后依次是白青桿菌、紅青岡菌、松茸和楊樹菌。陳萬超等[21]采用主成分分析和聚類分析成功構(gòu)建出了準(zhǔn)確、可靠,同時又可甄別香菇與其它食用菌風(fēng)味差異程度的特征指紋圖譜。Wang等[22]采用主成分分析和味覺活性值分析了褐蘑菇在不同生長階段菌柄和菌蓋中的呈味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)5′-鳥苷酸、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)等是褐蘑菇子實體的特征性呈味物質(zhì)。冮潔等[23]全面評價了美味牛肝菌深層發(fā)酵菌絲體和子實體蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值,發(fā)現(xiàn)其子實體的營養(yǎng)價值高于菌絲體,鑒于該菌野生產(chǎn)量不能滿足消費者的需求,因此該作者建議采用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)美味牛肝菌菌絲體,以此作為原料生產(chǎn)功能食品以滿足市場需求。此外,馬長中等[10]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自林芝覺木和百巴兩地的橙黃疣柄牛肝菌中氨基酸種類齊全,不僅含有人體所必需的8種氨基酸,而且含有多種非必需氨基酸。

表7 五種野生食用菌的綜合得分

3 結(jié)論

本文對采自西藏林芝地區(qū)的松茸、紅青岡菌、牛肝菌、白青桿菌和楊樹菌中氨基酸種類和含量進行了主成分分析與綜合評價。結(jié)果表明,五種野生食用菌中均含有17種氨基酸,谷氨酸和丙氨酸含量尤其豐富。五種野生食用菌的第一限制氨基酸均為蛋氨酸和半胱氨酸。此外,紅青岡菌和松茸的氨基酸比值系數(shù)分最高,分別達到77.267和72.040,均可作為優(yōu)質(zhì)的食物蛋白來源。通過主成分分析建立氨基酸綜合評價模型得出牛肝菌中氨基酸綜合品質(zhì)最好,然后依次是白青桿菌、紅青岡菌和松茸,楊樹菌中氨基酸綜合品質(zhì)較差。本文目前僅研究了采自西藏林芝巴宜區(qū)比日神山五種野生食用菌的氨基酸種類及含量,進一步研究將在西藏地區(qū)收集更多的野生食用菌樣品,測定其氨基酸組成和含量,以建立更為詳細的野生食用菌品質(zhì)評價體系,為西藏地區(qū)豐富的食用菌資源開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。