二步法制備稀有人參皂苷Rh1組異構(gòu)體

金豆豆,劉春瑩,徐龍權(quán),宋建國,魚紅閃,*

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034;2.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116622)

人參(PanaxginsengC.A. Meyer)屬五加科(Araliaceae)多年生草本植物[1],是一種名貴中藥,分布于中國東北,俄羅斯東部,朝鮮等地[2]。人參皂苷Re,Rg1和Rh1是三醇類皂苷[3-5],現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,人參皂苷Re具有抗溶血作用[6-7];人參皂苷Rg1具有抗疲勞作用,可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)興奮度并能改善記憶力[8-9];人參皂苷Rh1屬于稀有皂苷,具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用,但在人參植物中含量極少,與Rg1相比更易被人體吸收,并且具有更好的生理活性[10-11],如何高利用低廉的皂苷有效地制備人參皂苷Rh1是近年來的研究目標(biāo)。

在Rg1的制備方面,金贊敏等[12]發(fā)現(xiàn)微生物sp.G9(即為本文的Absidiasp.P39r菌種)產(chǎn)皂甙α-鼠李糖苷酶具有專一性,能夠水解人參皂甙Re的C-6位末端上的一個(gè)α-鼠李糖基制備人參皂甙Rg1,且酶反應(yīng)的最佳溫度是40 ℃,最適pH為5.0。在稀有人參皂苷Rh1的制備方面,Cao等[13]以原人參三醇組皂苷為底物,采用弱酸(冰醋酸)水解法制備出Rh1,由于該方法副產(chǎn)物較多,后續(xù)采用硅膠柱層析法才能進(jìn)一步制備出純度達(dá)90%的Rh1。目前關(guān)于轉(zhuǎn)化人參皂苷的文獻(xiàn)報(bào)告很多,大多數(shù)情況下使用酸、堿水解法轉(zhuǎn)化人參皂苷,但這種方法反應(yīng)劇烈,產(chǎn)生的產(chǎn)物復(fù)雜,并且強(qiáng)酸和強(qiáng)堿會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[14-15]。

在前期研究中發(fā)現(xiàn),酶法催化轉(zhuǎn)化人參皂苷反應(yīng)條件溫和,反應(yīng)過程容易控制,在常溫下即可進(jìn)行,底物特異性強(qiáng)且產(chǎn)物單一,對(duì)環(huán)境沒有污染[16-18]。在人參皂苷的催化轉(zhuǎn)化研究中也發(fā)現(xiàn),過渡態(tài)金屬離子如Fe3+可以催化人參皂苷的糖基水解,反應(yīng)具有定向性,且產(chǎn)物分離相對(duì)容易并能夠?qū)⒔饘匐x子進(jìn)行回收,從而有效地降低其對(duì)環(huán)境的污染。

本文采用二步法,首先以Re為底物通過酶催化反應(yīng)制備Rg1,再以制備出的Rg1為底物,Fe3+為催化劑進(jìn)行反應(yīng),以得到包含20(S)-Rh1和20(R)-Rh1在內(nèi)的異構(gòu)體組合物為目的,實(shí)現(xiàn)用廉價(jià)人參皂苷制備稀有人參皂苷的目標(biāo),為其進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Absidiasp.P39r(犁頭霉)菌株 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏所;人參皂苷Re、Rg1樣品以及Re、Rg1、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4對(duì)照品 實(shí)驗(yàn)室自制,HPLC純度達(dá)到95%以上;AB-8大孔吸附樹脂 南開大學(xué)化工廠;人參粉 北京同仁堂大連分店;麥芽汁 實(shí)驗(yàn)室自制;透析袋(0.1～0.5 kDa) 上海新睿生物科技有限公司;硫酸銨、無水乙酸鈉、冰醋酸、無水乙醇、乙二醇、甲醇、正丁醇、異丁醇、正丙醇、1,2-丙二醇、異丙醇、異戊醇、聚乙二醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、環(huán)己醇、丙三醇、環(huán)戊醇、苯甲醇、1,3-丙二醇 Sigma-Aldrich;娃哈哈純凈水 大連娃哈哈飲用水有限公司;HPLC試劑 色譜純；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

Waters 2695-2424高效液相色譜儀 美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的液體培養(yǎng) 固體斜面培養(yǎng)基:采用麥芽汁培養(yǎng)基,此培養(yǎng)基配方為:5 °麥芽汁+2%瓊脂。將Absidiasp.P39r菌株接種在此培養(yǎng)基上,在29 ℃條件下培養(yǎng)6 d,之后用牛皮紙包好,放在4 ℃下保藏備用。

人參浸出液的制備:將100 g人參粉與600 mL水在燒杯中混合均勻,小火煎煮7 h,(煎煮的過程中注意補(bǔ)水和攪拌,防止糊化);冷卻,用四層紗布過濾掉殘?jiān)臑V液,將濾液在8000 r/min條件下離心10 min,取上清液,即是誘導(dǎo)物浸出液,補(bǔ)水至300 mL,高壓滅菌,于4 ℃保藏備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:取12 mL的人參浸出液加入48 mL的麥芽汁,再加入40 mL自來水補(bǔ)齊至100 mL,配制成液體發(fā)酵培養(yǎng)基(麥芽汁的最終濃度為5°)。蒸汽滅菌(121 ℃,1 MPa)21 min,冷卻至室溫。

1.2.2 酶液的制備 根據(jù)李明華等[19]研究的霉菌液體菌種的方法培養(yǎng)菌種,取活化好的Absidiasp.P39r菌株斜面,用移液槍取5 mL菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基后置于振蕩培養(yǎng)箱中。再將發(fā)酵培養(yǎng)好的100 mL發(fā)酵液進(jìn)行高速離心,轉(zhuǎn)速為8000 r/min,時(shí)間是15 min(去除菌體),取上清液。在上清液中緩慢加入硫酸銨粉末(在磁力攪拌條件下)進(jìn)行鹽析,直至加入的硫酸銨飽和度為85%,之后在4 ℃下靜置、過夜。再在13000 r/min條件下離心20 min,收集沉淀,即為酶蛋白。用10 mL 0.02 mol/L pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖液將酶蛋白沉淀溶解,轉(zhuǎn)入透析袋用相同的緩沖溶液進(jìn)行透析48 h,透析過程中每隔2 h換一次透析袋。透析結(jié)束后,用高速冷凍離心機(jī)在13000 r/min下離心10 min,除去不溶性雜蛋白[20]。所得上清液即為酶液。

1.2.3 酶轉(zhuǎn)化生成Rg1最佳反應(yīng)條件的確定 底物Re的配制:取1 mg Re對(duì)照品加入到200 μL無水乙醇和800 μL pH5.0醋酸鈉-醋酸緩沖液中完全溶解,取1 mL底物Re溶液加入1 mL酶液進(jìn)行酶反應(yīng)。對(duì)Absidiasp.P39r菌產(chǎn)酶液催化轉(zhuǎn)化Re的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行確定(表2),固定反應(yīng)條件為:反應(yīng)溫度40 ℃,底物濃度1 mg/mL,乙醇濃度10%,反應(yīng)時(shí)間20 h,考察不同緩沖液pH(3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2)對(duì)產(chǎn)物中Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;固定反應(yīng)條件為:緩沖液pH5.0,底物濃度1 mg/mL,乙醇濃度10%,反應(yīng)時(shí)間20 h,考察不同反應(yīng)溫度(25、30、35、40、45、50、55、60 ℃)對(duì)產(chǎn)物中Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;固定反應(yīng)條件為:緩沖液pH5.0,反應(yīng)溫度40 ℃,乙醇濃度10%,反應(yīng)時(shí)間20 h,考察不同底物濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL)對(duì)產(chǎn)物中Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;固定反應(yīng)條件為:緩沖液pH5.0,反應(yīng)溫度40 ℃,底物濃度1 mg/mL,反應(yīng)時(shí)間20 h,考察不同乙醇濃度(0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%)對(duì)產(chǎn)物中Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;固定反應(yīng)條件為:緩沖液pH5.0,反應(yīng)溫度40 ℃,底物濃度1 mg/mL,乙醇濃度10%,考察不同反應(yīng)時(shí)間(6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 h)對(duì)產(chǎn)物中Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),分別對(duì)每個(gè)反應(yīng)取樣,加入2 BV水飽和正丁醇終止酶反應(yīng),振蕩,分層,吸走下層液體,將上層液體蒸干得到粉末樣品。粉末樣品用色譜純甲醇溶解,通過HPLC-PDA檢測(cè)分析,根據(jù)催化反應(yīng)得到的Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來確定最佳反應(yīng)條件。

表2 酶催化轉(zhuǎn)化Re生成Rg1反應(yīng)條件

1.2.4 Fe3+催化生成Rh1組異構(gòu)體最適有機(jī)溶劑體系的確定 底物Rg1的配制:取1 mg Rg1對(duì)照品加入到500 μL不同的有機(jī)醇試劑(選用無水乙醇、乙二醇、甲醇、正丁醇、異丁醇、正丙醇、1,2-丙二醇、異丙醇、異戊醇、聚乙二醇400、正戊醇、正己醇、正庚醇、環(huán)己醇、丙三醇、環(huán)戊醇、苯甲醇、和1,3-丙二醇)和500 μL去離子水中完全溶解,再選取純凈水為對(duì)照組。分別取1 mL底物Rg1溶液加入1 mL 1.5 mol/L FeCl3溶液進(jìn)行金屬離子催化反應(yīng),在40 ℃下反應(yīng) 15 h后,2 BV水飽和正丁醇萃取,取正丁醇層加3 BV水繼續(xù)萃取以除去Fe3+,水洗正丁醇層3遍,蒸干正丁醇層得到粉末樣品。用色譜純甲醇溶解,經(jīng)HPLC-PDA檢測(cè)分析,通過催化反應(yīng)得到的20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來確定最佳有機(jī)溶劑體系。

1.2.5 Fe3+催化生成Rh1組異構(gòu)體最佳反應(yīng)條件的確定 底物Rg1的配制:取1 mg Rg1對(duì)照品加入到500 μL無水乙醇和500 μL去離子水中完全溶解,取1 mL底物Rg1溶液加入1 mL FeCl3溶液進(jìn)行金屬離子催化反應(yīng)。用Fe3+作為催化反應(yīng)中的金屬離子,以酶反應(yīng)得到的Rg1為底物(表3),反應(yīng)條件為:固定反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度50 ℃,底物濃度1 mg/mL,FeCl3溶液濃度1.5 mol/L,反應(yīng)時(shí)間15 h,考察不同乙醇濃度(30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%)對(duì)產(chǎn)物中20(S,R)-Rh1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;固定反應(yīng)條件為乙醇濃度50%,底物濃度1 mol/L,FeCl3溶液濃度1.5 mol/L,反應(yīng)時(shí)間15 h,考察不同反應(yīng)溫度(25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃)對(duì)產(chǎn)物中20(S,R)-Rh1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;固定反應(yīng)條件為乙醇濃度50%,反應(yīng)溫度50 ℃,FeCl3溶液濃度1.5 molL,反應(yīng)時(shí)間15 h,考察不同底物濃度(0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0、2.3、2.6、3.0 mg/mL)對(duì)產(chǎn)物中20(S,R)-Rh1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;固定反應(yīng)條件為乙醇濃度50%,反應(yīng)溫度50 ℃,底物濃度1 mol/L,反應(yīng)時(shí)間15 h,考察不同F(xiàn)eCl3溶液濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mol/L)對(duì)產(chǎn)物中20(S,R)-Rh1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響;固定反應(yīng)條件為乙醇濃度50%,反應(yīng)溫度50 ℃,底物濃度1 mol/L,FeCl3溶液濃度1.5 mol/L,考察不同反應(yīng)時(shí)間(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28 h)對(duì)產(chǎn)物中20(S,R)-Rh1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),分別對(duì)每個(gè)反應(yīng)取樣,分別加入2 BV水飽和正丁醇萃取,取正丁醇層加3 BV水繼續(xù)萃取以除去Fe3+,水洗正丁醇層3遍,蒸干正丁醇層得到粉末樣品。用色譜純甲醇溶解,經(jīng)HPLC-PDA檢測(cè)分析,通過催化反應(yīng)得到的20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來確定Fe3+催化的最佳反應(yīng)條件。

1.2.6 酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和Fe3+催化反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC-PDA檢測(cè) 色譜柱:中匯達(dá)C18色譜柱(φ250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流速1.0 mL/min;載氣壓力30 psi;漂移管溫度80 ℃;流動(dòng)相為乙腈(A)和水(B);流動(dòng)相洗脫梯度:0～20 min,20% A;20～31 min,20%～32% A;31～40 min,32%～43% A;40～70 min,43%～100% A[21]。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取人參皂苷Rg1,20(S)-Rh1,20(R)-Rh1,Rk3和Rh4對(duì)照品10 mg溶于5 mL色譜甲醇中,配成濃度為2 mg/mL的對(duì)照品溶液,然后分別取1 mL加入色譜甲醇稀釋成濃度2.0、1.6、1.2、0.8、0.4 mg/mL的對(duì)照品溶液,過膜備用。分別取上述制備的不同濃度對(duì)照品溶液10 μL按上述色譜條件進(jìn)樣分析,以測(cè)得的峰面積的自然對(duì)數(shù)對(duì)進(jìn)樣濃度的自然對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得到各個(gè)成分的回歸方程[22],結(jié)果見表1。

表1 人參皂苷Rg1和Rh1組的線性回歸方程

1.2.7 催化反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算 催化反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC-PDA測(cè)定后,參照上述回歸方程分別計(jì)算Rg1、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4的質(zhì)量。將Rg1歸為一組,20(S)-Rh1+20(R)-Rh1歸為一組稱為20(S,R)-Rh1,由于Rk3、Rh4與20(S)-Rh1、20(R)-Rh1類似,均為一組手性對(duì)稱三醇類人參皂苷,相對(duì)分子質(zhì)量相同,故將Rk3+Rh4歸為一組,Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(ω1)計(jì)算方法如下:

20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(ω2):

Rk3和Rh4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(ω3):

表3 Fe3+催化轉(zhuǎn)化Rg1生成Rh1組異構(gòu)體反應(yīng)條件

式中:m1指酶催化反應(yīng)得到的粉末狀樣品1的質(zhì)量,m2指金屬離子催化反應(yīng)得到的粉末狀樣品2的質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酶轉(zhuǎn)化法制備Rg1的催化反應(yīng)條件選擇

采用1.2.3的方法對(duì)Absidiasp. P39r菌產(chǎn)粗酶液催化Re的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,得到人參皂苷Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)折線圖。圖1A表明,隨著pH的增加,Rg1的量先增加再減少,pH為4.6時(shí),Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為68.5%[23];圖1B表明,隨著溫度的增加,Rg1的量先增加再減少,當(dāng)溫度為40 ℃時(shí),Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為71.5%;圖1C表明,底物濃度為1.2%時(shí),Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為70.3%;圖1D表明,隨著時(shí)間的增加,反應(yīng)時(shí)間為16 h時(shí),Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為68.4%。圖1E表明,乙醇濃度為0%時(shí)Re仍有剩余,隨著乙醇濃度的增加,Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后緩慢減少,當(dāng)乙醇濃度在10%時(shí)Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為69.4%。最終確定最佳反應(yīng)條件為:緩沖液pH5.0,反應(yīng)溫度40 ℃,底物濃度1.2%,反應(yīng)時(shí)間16 h,乙醇濃度10%。

圖1 不同反應(yīng)條件下Rg1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)折線圖

2.2 Fe3+催化法制備Rh1組異構(gòu)體的最佳有機(jī)溶劑體系

采用1.2.4的方法得到的結(jié)果如圖2所示,在19種有機(jī)醇體系中,均有20(S,R)-Rh1生成,但質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同,由于人參皂苷Rg1和Rh1是低極性化合物[24],水溶性不好,醇溶性較好,并且在乙醇體系中Fe3+催化人參皂苷Rg1生成的20(S,R)-Rh1含量最多,因此選擇乙醇-水作為溶劑體系考察其對(duì)催化反應(yīng)的影響。

圖2 不同有機(jī)醇體系下Rh1組各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3 Fe3+催化法制備Rh1組異構(gòu)體的最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)1.2.5的試驗(yàn)條件對(duì)Fe3+催化Rg1生成Rh1組異構(gòu)體的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,得到20(S,R)-Rh1,Rk3和Rh4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)折線圖。圖3A表明,隨著乙醇濃度的增加,20(S,R)-Rh1的量先增加再減少,乙醇濃度為50%時(shí),20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大為52.7%[25];圖3B表明,當(dāng)反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí),Rg1有較多剩余,50 ℃時(shí)Rg1基本都催化轉(zhuǎn)化為Rh1組異構(gòu)體,其中20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)63.2%;圖3C表明,底物Rg1濃度為1.7%時(shí),20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為60.3%;圖3D表明,隨著Fe3+濃度的增加,20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后減少,FeCl3溶液濃度為1.4 mol/L時(shí),20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)60.3%。

圖3 不同反應(yīng)條件下Rh1組化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)折線圖

圖3E表明,在乙醇-水體系下,Fe3+催化人參皂苷Rg1的反應(yīng)發(fā)生的很快,在2 min時(shí)就已經(jīng)有20(S,R)-Rh1、Rk3和Rh4的生成,說明在C-20糖苷鍵裂解的同時(shí)進(jìn)行脫水反應(yīng);當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到14 h和16 h時(shí),20(S,R)-Rh1、Rk3和Rh4的含量相繼達(dá)到最高,分別為63.4%和14.5%。隨后20(S,R)-Rh1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始下降,Rk3和Rh4趨于平衡。從上述結(jié)果可以看出,Fe3+直接催化裂解了人參皂苷Rg1 C-20上的葡萄糖苷鍵,在生成20(S)-Rh1和20(R)-Rh1的同時(shí)發(fā)生脫水反應(yīng)生成Rk3和Rh4。由此得出Fe3+催化轉(zhuǎn)化人參皂苷Rg1的反應(yīng)過程,結(jié)果如圖4所示。最終確定最佳反應(yīng)條件為:乙醇濃度50%,Fe3+溶液的反應(yīng)濃度1.4 mol/L,反應(yīng)溫度50 ℃,底物濃度1.7%,反應(yīng)時(shí)間14 h。

圖4 Fe3+催化人參皂苷Rg1的反應(yīng)過程

2.4 二步法催化轉(zhuǎn)化制備Rh1組異構(gòu)體

根據(jù)2.1～2.3得出的最佳反應(yīng)條件,以Re為底物,Absidiasp.P39r菌株產(chǎn)酶液為催化劑進(jìn)行反應(yīng),采用10%乙醇作為溶劑體系,稱取20.0 g Re溶于200 mL無水乙醇,待底物完全溶解后,加入0.02 mol/L pH為5.0的醋酸鈉-醋酸緩沖液,定容至1 L,加入1 L酶液,在40 ℃下反應(yīng)14 h后,將反應(yīng)液用去離子水稀釋5倍,并快速經(jīng)提前處理好的AB-8大孔吸附樹脂[24]進(jìn)行脫糖處理,并將溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粉末狀。最終得到催化產(chǎn)物粗品質(zhì)量14.1 g,得率為70.5%。制備得到的粗品經(jīng)HPLC-PDA測(cè)定,結(jié)果如圖5所示。發(fā)現(xiàn)粗品中含有1種催化反應(yīng)產(chǎn)物Rg1純度達(dá)94%以上。

圖5 Rg1的HPLC檢測(cè)圖

然后以Rg1為底物,FeCl3為金屬離子催化劑進(jìn)行反應(yīng),采用50%乙醇作為溶劑體系,稱取10.2 g Rg1和68.12 g FeCl3溶劑于300 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇中,在50 ℃下反應(yīng)14 h后,將反應(yīng)液用去離子水稀釋5倍,并快速經(jīng)提前處理好的AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行脫鐵脫糖處理[25-26],并將溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粉末狀。最終得到催化產(chǎn)物粗品質(zhì)量8.18 g,得率為80.2%。制備得到的粗品經(jīng)HPLC-PDA測(cè)定,結(jié)果如圖6所示。發(fā)現(xiàn)粗品中含有4種催化反應(yīng)產(chǎn)物,分別為20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4。其中20(S,R)-Rh1的含量為61.83%,Rk3、Rh4的含量總和為27.34%。其中20(S)-Rh1的含量為37.71%,20(R)-Rh1的含量為24.12%,Rk3的含量為7.27%,Rh4的含量為20.07%。20(S,R)-Rh1、Rk3和Rh4的含量之比為62∶27。

圖6 Rh1組化合物的HPLC檢測(cè)圖

3 結(jié)論

Absidiasp.P39r菌株產(chǎn)酶可催化Re轉(zhuǎn)化為Rg1,在緩沖液pH5.0,底物濃度1.2%,反應(yīng)時(shí)間16 h,乙醇濃度10%,反應(yīng)溫度40 ℃下Rg1的產(chǎn)率最高。以20 g Re為底物,在最佳條件下制備Rg1,得率為70.5%;在乙醇-水體系中,Fe3+催化人參皂苷Rg1生成的20(S,R)-Rh1含量最多,該溶媒體系下催化反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果為:乙醇濃度50%,反應(yīng)溫度50 ℃,底物濃度1.7%,Fe3+溶液反應(yīng)濃度1.4 mol/L,反應(yīng)時(shí)間14 h。在 乙醇-水體系的最佳條件下考察Fe3+催化反應(yīng)產(chǎn)物隨時(shí)間的變化,發(fā)現(xiàn)在C-20葡萄糖苷鍵裂解生成20(S,R)-Rh1的同時(shí),脫水反應(yīng)生成Rk3和Rh4。以10.2 g Rg1為底物,50%乙醇-水體系中催化反應(yīng)14 h制備得到粗品,得率為80.2%,其中20(S)-Rh1的含量為37.71%,20(R)-Rh1的含量為24.12%,Rk3的含量為7.27%,Rh4的含量為20.07%。20(S,R)-Rh1、Rk3和Rh4的含量之比為62∶27。

酶轉(zhuǎn)化法和金屬離子催化法均具有條件溫和,產(chǎn)物單一,對(duì)環(huán)境沒有污染;反應(yīng)特異性強(qiáng),目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高,周期短的特點(diǎn),易于工業(yè)化放大生產(chǎn)。本論文通過兩種方法聯(lián)用,為稀有人參皂苷Rh1組異構(gòu)體的催化制備提供了新方法。