葡萄海棠果酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化及體外抑菌與抗氧化活性的研究

劉維兵,王舸楠,2,王犁燁,武亞婷,殷 娜,程方方,馬玉麒,武 運(yùn),*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000;2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100000)

酵素產(chǎn)業(yè)是生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè),酵素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展符合國(guó)家產(chǎn)業(yè)政策要求,在國(guó)家重點(diǎn)發(fā)展大健康產(chǎn)業(yè)的環(huán)境下,酵素產(chǎn)業(yè)未來(lái)將會(huì)繼續(xù)保持較高的發(fā)展速度,發(fā)展空間也將更加廣闊。微生物酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果等為原料,經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而產(chǎn)生的微生物發(fā)酵產(chǎn)品,具有抗衰老、抗菌、消炎、凈化血液,增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等多種保健功能[1-2]。近年來(lái),食用酵素發(fā)展迅速,我國(guó)大陸地區(qū)食用酵素相關(guān)研究尚處于起步階段,與發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)相比,仍有較大差距,國(guó)外的食用酵素產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)的售價(jià)普遍昂貴。所以,自主研發(fā)的食用酵素產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)有廣闊市場(chǎng)前景[3]。但目前國(guó)內(nèi)酵素產(chǎn)業(yè)多以多原材料天然發(fā)酵為主,所以發(fā)酵周期長(zhǎng),生產(chǎn)成本較高。

葡萄,又名蒲桃,味甘酸、性平。葡萄果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,除含有豐富的糖、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸外,還富含花青素、多酚、維生素B(Vitamin B,VB)、維生素C(Vitamin C,VC)等多種維生素,黃酮類化合物、礦物質(zhì)和多種微量元素[4]。海棠果(CalophylluminophyllumL.),又名胡桐、海桐、紅厚殼、君子樹(shù)、海棠木、瓊州海棠,為藤黃科(Guttiferae)植物,海棠果味甘微酸、入脾、胃經(jīng)、性平[5]。

新疆葡萄種植面積廣、范圍大、產(chǎn)量多,新疆鮮食葡萄產(chǎn)區(qū)主要分布在以無(wú)核白和馬奶子為主的吐哈地區(qū),以及以阿圖什作為中心發(fā)展木納格鮮食葡萄的昌吉、伊犁、霍城、焉耆盆地等,主要種植全紅鮮食葡萄。國(guó)外80%的葡萄用于釀酒,而我國(guó)只有20%的葡萄用于釀酒,絕大多數(shù)葡萄用于鮮食,但由于鮮食葡萄受氣候和市場(chǎng)價(jià)格的影響較大,不易儲(chǔ)存和運(yùn)輸,并且對(duì)食用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求較高,從而制約了新疆鮮食葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。釀酒葡萄利潤(rùn)率低制約葡萄酒業(yè)發(fā)展[6]。另外，新疆海棠果種植面積正在逐漸增長(zhǎng),奇臺(tái)全縣海棠果種植面積已達(dá)2萬(wàn)畝,新疆伊犁也有海棠果的大面積種植。

本實(shí)驗(yàn)以新疆地產(chǎn)鮮食葡萄和海棠果為原料,酵母菌與乳酸菌先后發(fā)酵,縮短發(fā)酵時(shí)間,保證產(chǎn)品質(zhì)量。通過(guò)真空冷凍干燥等工藝,制成葡萄海棠果酵素粉成品,以提高新疆鮮食葡萄與海棠果的利用率,延伸葡萄與海棠果的深加工產(chǎn)業(yè)鏈。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄、海棠果 新疆烏魯木齊市九鼎農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng);馬克斯克魯維酵母、M40乳酸菌、大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院食品生物發(fā)酵與質(zhì)量安全研究室;纖維素酶(50000 U/g) 上海藍(lán)季生物有限公司;果膠酶(500000 U/g) 上海源葉生物有限公司;SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所;α,α-二苯基-β-苦苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS) Solarbio公司;其他試劑 均為分析純。

5417R高速冷凍離心機(jī) Eppendorf公司;LE2002E/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LDZX-50KBS立式高壓滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HR40-ⅡA2生物安全柜、DW-86W100J醫(yī)用低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司;Y15全自動(dòng)葡萄酒檢測(cè)儀 Biosystem公司;Elx50酶標(biāo)儀 BioTek Instruments公司;LGJ-25C四環(huán)凍干機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;MJX-100B-2霉菌培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;E200MV R顯微鏡 Nikon Corporation Tokyo Japan。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 葡萄、海棠果→榨汁→滅菌→酶解→酵母菌發(fā)酵→乳酸菌發(fā)酵→真空冷凍干燥→葡萄海棠果酵素粉

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 榨汁與滅菌 將紫外線照射1 h后的葡萄、海棠果(去籽)用榨汁機(jī)打碎,然后將葡萄海棠果果汁放入65 ℃水浴鍋中,30 min巴氏殺菌。

1.2.2.2 復(fù)合酶酶解 采用纖維素酶和果膠酶酶解葡萄海棠果果汁,酶解成使微生物和人體易于利用的小分子糖類[7]。復(fù)合酶酶解葡萄海棠果果汁的工藝為:pH3.8、溫度50 ℃、酶解時(shí)間180 min。加酶量按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加,纖維素酶0.4%、果膠酶0.2%[8-10]。

1.2.2.3 菌種的活化和培養(yǎng) 酵母菌:將斜面保藏的馬克斯克魯維酵母,接種在馬鈴薯葡萄糖(Potato Dextrose Broth,PDB)肉湯中進(jìn)行活化,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。然后將菌液在馬鈴薯葡萄糖(Potato Dextrose Agar,PDA)培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。菌種經(jīng)過(guò)冷凍后,生長(zhǎng)延遲期較長(zhǎng),故需經(jīng)過(guò)兩次繼代培養(yǎng),菌液待用[11-14]。

乳酸菌:采用MRS培養(yǎng)基,其他活化、培養(yǎng)方法同酵母菌。

1.2.2.4 接種和發(fā)酵 先在25 ℃、pH3.8條件下接種0.20%酵母菌到葡萄海棠果果汁中發(fā)酵24 h,后在37 ℃條件下,接種0.50%乳酸菌,靜置發(fā)酵28 h。

1.2.2.5 真空冷凍干燥 通過(guò)真空冷凍干燥得到水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于5%的葡萄海棠果酵素粉。真空冷凍干燥條件:冷凍溫度為-45 ℃,真空度為10～20 Pa,冷阱溫度為-80 ℃[15]。

1.2.3 酵母菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 最佳質(zhì)量比的確定 在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,控制發(fā)酵溫度為25 ℃,酵母菌接種量為0.20%,pH4.0,發(fā)酵時(shí)間為16 h,葡萄∶海棠果的質(zhì)量比分別設(shè)為3∶1、1∶1、1∶3、1∶5和1∶7。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最佳質(zhì)量比。

1.2.3.2 初始pH的確定 葡萄海棠果汁自身的pH在3.8左右。在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,控制發(fā)酵溫度為25 ℃,酵母菌接種量為0.20%,質(zhì)量比為1∶3,用CaCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸度,分別在pH3.6、3.8、4.0、4.2和4.4條件下進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間為16 h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最適的發(fā)酵初始pH。

1.2.3.3 發(fā)酵時(shí)間的確定 在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,控制發(fā)酵溫度為25 ℃,酵母菌接種量為0.20%,pH4.0,質(zhì)量比為1∶3,發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為8、16、24、32和40 h,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最適的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.3.4 接種量的確定 在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,控制發(fā)酵溫度為25 ℃,pH4.0,質(zhì)量比為1∶3,分別接種0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%酵母菌進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間為24 h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最適的酵母菌接種量。

1.2.3.5 發(fā)酵溫度的確定 在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,酵母菌接種量為0.20%,pH4.0,質(zhì)量比為1∶3,分別控制在22、25、28、31、34 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間為24 h,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最適的酵母菌發(fā)酵溫度。

1.2.4 酵母菌發(fā)酵正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,影響酵母菌發(fā)酵的主要因素有酵母菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始pH、質(zhì)量比。故以此五因素設(shè)計(jì)L16(45)正交試驗(yàn),以酵母菌數(shù)量和SOD酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定酵母菌發(fā)酵的最佳工藝條件。

1.2.5 乳酸菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 接種量的確定 為確定乳酸菌在葡萄海棠果發(fā)酵液中的最適接種量,控制發(fā)酵溫度為37 ℃,發(fā)酵時(shí)間為24 h,初始pH為3.5,接種量分別設(shè)為0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.25%,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定乳酸菌濃度和可滴定酸度。

1.2.5.2 發(fā)酵時(shí)間的確定 為確定乳酸菌在葡萄海棠果發(fā)酵液中的最適發(fā)酵時(shí)間,控制乳酸菌接種量為0.50%、發(fā)酵溫度為37 ℃,初始pH為3.5,發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為12、16、20、24、28和32 h,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定乳酸菌濃度和可滴定酸度。

1.2.5.3 發(fā)酵溫度的確定 為確定乳酸菌在葡萄海棠果發(fā)酵液中的最適發(fā)酵溫度,控制乳酸菌接種量為0.50%,初始pH為3.5,分別在35、37、39、41和43 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間為28 h,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定乳酸菌濃度和可滴定酸度。

1.2.5.4 起始pH的確定 控制發(fā)酵溫度為37 ℃,乳酸菌接種量為0.50%,采用CaCO3和NaOH調(diào)節(jié)葡萄海棠果發(fā)酵液酸度,調(diào)節(jié)pH在3.2、3.5、3.8、4.1和4.4條件下進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間為28 h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定葡萄海棠果發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量和可滴定酸度含量,以此確定乳酸菌的最適發(fā)酵起始pH。

1.2.6 二次發(fā)酵中乳酸菌最佳接種時(shí)間的確定 乳酸菌利用葡萄與海棠果營(yíng)養(yǎng)成分的速率快于酵母菌,所以先接種酵母菌進(jìn)行發(fā)酵,再接種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵[16-21]。根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際情況,因?yàn)槿樗峋鸀槎伟l(fā)酵,且在酵母菌發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生許多產(chǎn)物及各其他指標(biāo)數(shù)量會(huì)發(fā)生變化,如酵母菌數(shù)量、總糖含量、脂肪含量等,所以在二次發(fā)酵過(guò)程中,不對(duì)乳酸菌的二次發(fā)酵采取正交試驗(yàn)分析。

首次進(jìn)行的酵母菌發(fā)酵葡萄海棠果果汁,除發(fā)酵時(shí)間外,其他發(fā)酵工藝參數(shù)均用表1正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件,將發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為16、24、32 h。其次進(jìn)行乳酸菌二次發(fā)酵,根據(jù)乳酸菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn),選出的各個(gè)最佳單因素為最佳發(fā)酵工藝,來(lái)進(jìn)行二次發(fā)酵葡萄海棠果發(fā)酵液,總發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為52 h。通過(guò)測(cè)定酵母菌濃度、乳酸菌濃度、超氧化物歧化酶活力、花青素含量、多酚含量、DPPH自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力,從而確定乳酸菌的最佳接種時(shí)間。

表1 L16(45)正交試驗(yàn)的因素與水平

1.2.7 葡萄海棠果酵素粉體外抗氧化試驗(yàn) 取葡萄海棠酵素粉6.0 g,用無(wú)水乙醇定容到10 mL溶液,濃度為0.6 g/mL。取該溶液適量,分別稀釋到濃度為200.0、100.0、60.0、30.0、10.0和5.0 mg/mL的葡萄海棠酵素溶液,紫外分光光度計(jì)測(cè)定DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥基自由基清除率。

1.2.7.1 DPPH清除率測(cè)定 取葡萄海棠果酵素粉稀釋液4 mL、0.02 mg/mL DPPH溶液4 mL混勻;25 ℃的恒溫水浴鍋中放置30 min 后,紫外分光光度計(jì)在517 nm 處測(cè)定其吸光值?？瞻捉M以4 mL無(wú)水乙醇代替樣品。每組測(cè)定重復(fù)三次[22]。

式中:A0表示空白組的吸光度;A1表示樣品溶液的吸光度;A2表示用無(wú)水乙醇代替DPPH時(shí)測(cè)得對(duì)應(yīng)濃度的本底吸光度

1.2.7.2 ABTS+自由基清除率測(cè)定 用7 mmol/L ABTS(用5 mmol/L的PBS,pH7.4配制),加入過(guò)硫酸鉀使最終濃度為2.45 mmol/L,在室溫條件下黑暗放置12～16 h。使用前把ABTS+自由基用PBS稀釋成在734 nm波長(zhǎng)處吸光度為(0.7± 0.02)[23]。

取10 μL葡萄海棠果酵素粉稀釋液加入到5 mL上述稀釋液中,在30 ℃溫度下反應(yīng)5 min。以去離子水為參比溶液。在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

式中:A0表示空白對(duì)照液的吸光度;A1表示樣品測(cè)定管的吸光度;A2表示樣品本底管的吸光度。

1.2.7.3 羥基自由基清除率測(cè)定 135 μL葡萄海棠果酵素粉稀釋液加入到1.4 mL的6 mmol/L H2O2,然后加入0.6 mL的20 mmol/L水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵,37 ℃溫度下恒溫水浴1 h。以去離子水為參比溶液。在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[24]。

式中:A0表示空白對(duì)照液的吸光度;A1表示樣品測(cè)定管的吸光度;A2表示樣品本底管的吸光度。

1.2.8 葡萄海棠果酵素粉體外抑菌試驗(yàn) 酵母粉1 g、蛋白胨2 g、氯化鈉1 g,加蒸餾水定容至 200 mL,固體培養(yǎng)基加瓊脂粉4 g,121 ℃滅菌20 min。從經(jīng)過(guò)活化的菌液中移取100 μL接種于LB液體培養(yǎng)基中,放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,備用。紙片法測(cè)定抑菌活性。

用打孔器將定性濾紙制成直徑為0.6 cm的小圓紙片。分別吸取以上培養(yǎng)時(shí)間的供試菌液100 μL,均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基中。將滅菌濾紙片分別放入10、20、40、80、160、320 mg/mL的葡萄海棠酵素溶液中浸泡1 min,取出并貼在含菌平板上,每皿貼1片。用無(wú)菌水浸泡的濾紙片做空白對(duì)照。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,白色念珠菌培養(yǎng)14 h[25]。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定抑菌圈直徑,結(jié)果取3個(gè)平行試驗(yàn)測(cè)定的平均值。

1.2.9 其他指標(biāo)測(cè)定方法 酵母菌菌體濃度的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板法;乳酸菌菌體濃度的測(cè)定參GB 4789.35-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》;可滴定酸度測(cè)定參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》;水分含量的測(cè)定參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》;可溶性固形物含量采用手持折光儀測(cè)定;超氧化物歧化酶活力的測(cè)定采用SOD試劑盒;多酚含量、花青素含量的測(cè)定采用y15全自動(dòng)葡萄酒檢測(cè)儀。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 質(zhì)量比對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響 由圖1可知,海棠果與葡萄的質(zhì)量比在1∶3時(shí),酵母菌濃度和超氧化物歧化酶的活力達(dá)到最大值,分別為6.1×108CFU/mL和368.93 U/mL。將海棠果與葡萄的質(zhì)量比定為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7用于后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖1 質(zhì)量比對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.2 初始pH對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響 由圖2可知,隨著pH的升高,超氧化物歧化酶活力與酵母菌濃度不斷升高,當(dāng)pH超過(guò)4.0后,隨著pH的升高,酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力也逐漸降低。所以當(dāng)初始pH為4.0時(shí),超氧化物歧化酶活力達(dá)到最大值379.43 U/mL,酵母菌濃度也達(dá)到最大值6.2×108CFU/mL。將初始pH設(shè)為3.8、4.0、4.2、4.4用于后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖2 初始pH對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響 由圖3可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),葡萄海棠果果汁中酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力逐漸提高,24 h以后,酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力基本保持不變。將后續(xù)正交試驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為8～32 h。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.4 接種量對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響 由圖4可知,隨著酵母菌接種量的增加,葡萄海棠果果汁中的酵母菌濃度和SOD活力也隨之提高,當(dāng)接種量為0.2% 時(shí),酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力分別達(dá)到6.4×108CFU/mL 和409.25 U/mL,當(dāng)接種量超過(guò)0.2%后,酵母菌數(shù)量和超氧化物歧化酶活力基本保持不變。將酵母菌接種量設(shè)定為0.1%～0.25%用于后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖4 接種量對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響 由圖5可知,溫度在25 ℃時(shí),酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力分別達(dá)到6.5×108CFU/mL 和421.23 U/mL,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵速率明顯降低。將發(fā)酵溫度設(shè)定為22～31 ℃用于后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖5 溫度對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響

2.2 酵母菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

由表2極差值分析,影響酵母菌濃度的因素主次順序?yàn)锳>B>C>D>E,接種量酵母菌生長(zhǎng)的主要控制因素,其次是發(fā)酵時(shí)間,最優(yōu)組合是 A3B3C2D3E2。對(duì)超氧化物歧化酶活力而言,極差影響酵母菌產(chǎn)酶的活性的因素主次順序?yàn)锳>B>C>D>E,而且最優(yōu)組合也是A3B3C2D3E2。綜合來(lái)說(shuō),試驗(yàn)指標(biāo)越大越好,對(duì)因素A、B、C分析,確定優(yōu)水平為A3、B3、C2,因素D選擇D3,由于葡萄海棠果汁本身pH為3.8,從經(jīng)濟(jì)角度考慮,選擇E1。以配方A3B3C2D3E1設(shè)計(jì)試驗(yàn),得出超氧化物歧化酶活力為428.12 U/mL,酵母菌濃度為7.87×108CFU/mL。故選擇配方為A3B3C2D3E1為最佳配方,即接種量為0.20%,發(fā)酵時(shí)間為24 h,發(fā)酵溫度為25 ℃,質(zhì)量比為1∶5,初始pH3.8。

表2 L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 乳酸菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響 由圖6可知,隨著乳酸菌接種量的增加,葡萄海棠果果汁中的乳酸菌濃度和可滴定酸度隨之提高,當(dāng)接種量達(dá)到0.50%時(shí),乳酸菌濃度和可滴定酸度分別達(dá)到 5.10×108CFU/mL和0.759%,當(dāng)接種量超過(guò)0.50%后,乳酸菌濃度和可滴定酸度基本保持不變。故乳酸菌的最適接種量為0.50%。

圖6 接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響 如圖7所示,在葡萄海棠果果汁中接種乳酸菌后,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)可滴定酸度達(dá)到最大值,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),可滴定酸度基本保持不變,發(fā)酵時(shí)間達(dá)到28 h時(shí),乳酸菌活菌數(shù)是 5.31×108CFU/mL,此時(shí)乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到最大值,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌活菌數(shù)略微降低,故將發(fā)酵時(shí)間定為28 h。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響 由圖8可知,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵速率加快,當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí),乳酸菌濃度達(dá)到最大值5.40×108CFU/mL。溫度達(dá)到37 ℃以后,隨著溫度的升高,可滴定酸度變化不大,但乳酸菌濃度卻隨溫度的升高而逐漸降低,所以乳酸菌的最適發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響

2.3.4 初始pH對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響 由圖9可知,隨著初始pH的變化,乳酸菌濃度基本保持在5.3×108CFU/mL、可滴定酸度基本保持在0.76%,乳酸菌發(fā)酵的初始pH可以選擇為3.2～4.4。由于酵母菌發(fā)酵完葡萄海棠果果汁,得到的葡萄海棠果發(fā)酵液的pH為3.5,故選擇乳酸菌發(fā)酵的初始pH為3.5。

圖9 初始pH對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響

2.4 復(fù)合發(fā)酵中乳酸菌的最佳接種時(shí)間

根據(jù)試驗(yàn)的實(shí)際情況,因?yàn)槿樗峋l(fā)酵為二次發(fā)酵,且在酵母菌發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生許多產(chǎn)物以及其他指標(biāo)數(shù)量會(huì)發(fā)生變化,如酵母菌數(shù)量、可滴定酸等,所以在二次發(fā)酵過(guò)程中,不對(duì)乳酸菌的二次發(fā)酵采取正交試驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的方法,而是根據(jù)最優(yōu)單因素選出最佳組合進(jìn)行二次發(fā)酵。

由表3可知,當(dāng)酵母菌發(fā)酵16 h后再接種乳酸菌,發(fā)酵液中乳酸菌的濃度最高,但是酵母菌濃度、超氧化物歧化酶活力、多酚含量、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和花青素含量等指標(biāo)較低。當(dāng)酵母菌發(fā)酵24 h后再接種乳酸菌,發(fā)酵液中酵母菌濃度、乳酸菌濃度、超氧化物歧化酶活力、多酚含量、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和花青素含量等指標(biāo)較高。

表3 二次發(fā)酵中乳酸菌的最佳接種時(shí)間對(duì)發(fā)酵液的影響

當(dāng)酵母菌發(fā)酵32 h后再接種乳酸菌,雖然酵母菌濃度含量最高,但發(fā)酵液中乳酸菌濃度、超氧化物歧化酶活力、多酚含量、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和花青素含量等指標(biāo)都有所降低。綜合以上各因素,酵母菌發(fā)酵24 h時(shí)接種乳酸菌為乳酸菌最佳接種時(shí)間。然后在37 ℃條件下,靜置發(fā)酵28 h,在此條件下制得的發(fā)酵液中酵母菌濃度為7.7×108CFU/mL,乳酸菌濃度為5.2×108CFU/mL,超氧化物歧化酶活力為485.25 U/mL。

2.5 真空冷凍干燥制得葡萄海棠果酵素產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

2.5.1 感官指標(biāo) 葡萄海棠果酵素粉為淡紅色、有光澤、且顏色均勻,酵素香氣獨(dú)特且綿密,具有葡萄與海棠果特有的混合果香味,并伴有發(fā)酵香味,酸味純正、持久不刺激,組織形態(tài)松散無(wú)結(jié)塊，符合中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)、植物酵素行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。

2.5.2 理化指標(biāo) 水分含量≤5%;總酸≥0.9%，符合上述標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。

2.5.3 微生物指標(biāo) 乳酸菌濃度≥(5.1±0.5)×108CFU/g;酵母菌濃度≥(7.5±0.5)×108CFU/g:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、霉菌等有害微生物未檢出，符合上述標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。

2.6 葡萄海棠酵素粉的體外抗氧化試驗(yàn)

由圖10可知,葡萄海棠果酵素對(duì)DPPH、ABTS+、羥基自由基都具有一定的清除能力,而且其清除作用隨著酵素濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)濃度達(dá)到200 mg/mL時(shí),其抑制率分別可達(dá)到(85.22%±3.2%)、(67.71%±2.4%)和(72.08%±2.5%),其中對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng),其次是羥基自由基,對(duì)ABTS+自由基的清除作用相對(duì)弱一些。

圖10 不同濃度酵素對(duì)體外抗氧化能力的影響

2.7 葡萄海棠酵素粉的體外抑菌試驗(yàn)

由表4可以看出,葡萄海棠果酵素粉對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌三種致病菌均有抑制作用,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng),其次是大腸桿菌,對(duì)白色念珠菌的抑制作用稍弱,隨著葡萄海棠果酵素濃度的不斷升高,對(duì)三種致病菌的抑制作用也在不斷升高。

表4 不同濃度的葡萄海棠果酵素的抗菌活性

2.8 葡萄海棠果酵素的理化指標(biāo)及功能成分分析

2.8.1 葡萄海棠果酵素的理化指標(biāo)測(cè)試結(jié)果 對(duì) pH、可滴定酸度、多酚、花青素的理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表5。隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷增加,葡萄海棠果酵素的pH,從最初的pH3.84到發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH降低為3.45,發(fā)酵過(guò)程中益生菌發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、乙酸等代謝產(chǎn)物,使反應(yīng)體系逐漸走向成熟,多酚含量在52 h時(shí)達(dá)到(956±15) mg/L,比未發(fā)酵組的多酚含量有很大提升。發(fā)酵初期,由于葡萄與海棠果中本身富含葡萄糖、果糖,總糖含量較高,直至酵母菌發(fā)酵進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,耗糖量也隨之增加;發(fā)酵后期,乳酸菌代替酵母菌變?yōu)榘l(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌群,乙酸含量不斷增加,乙醇減少。

表5 發(fā)酵前后與制成粉制劑后理化指標(biāo)對(duì)比

2.8.2 葡萄海棠酵素功能成分的測(cè)試結(jié)果 酵母菌和乳酸菌互相利用產(chǎn)生次代謝產(chǎn)物,從而提高酶活力與益生菌活菌數(shù)量,結(jié)果如表6所示,發(fā)酵結(jié)束時(shí)SOD酶活達(dá)到(485.25±12.5) U/mL。葡萄因本身含有黃酮類化合物,是天然的抗氧化活性物質(zhì),葡萄中單聚體酚類物質(zhì)經(jīng)益生菌的轉(zhuǎn)化與利用,DPPH、ABTS+及羥基自由基清除率分別達(dá)到了84.68%、66.68%、71.94%。發(fā)酵時(shí)乳酸菌能為酵母菌提供碳源,如牛乳生產(chǎn)過(guò)程中添加的酵母菌和乳酸菌,酵母菌不能直接利用乳糖,而乳酸菌可將乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖和葡萄糖,因此乳酸菌也為酵母菌提供了碳源;乳酸菌還可通過(guò)丙酮酸鹽裂解酶將丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為甲酸鹽,或者將檸檬酸鹽分解為甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、雙乙酰、乙酰甲基原醇、2,3-丁二醇等芳香物質(zhì),為發(fā)酵體系增加風(fēng)味成分。有研究推測(cè)酵母菌與乳酸菌共生體系中存在一種適應(yīng)反應(yīng)機(jī)制,這種機(jī)制一旦被激活,酵母菌會(huì)產(chǎn)生“交叉保護(hù)”的現(xiàn)象,促使酵母菌對(duì)外界抵抗能力增強(qiáng),如高滲透壓、高溫、較低pH等環(huán)境。隨著發(fā)酵時(shí)間的推進(jìn),發(fā)酵體系中pH逐漸降低,而酵母菌活力并沒(méi)有因此走向自溶或衰亡,而是與乳酸菌互相利用、達(dá)到穩(wěn)定共生的平衡體系[28]。

表6 發(fā)酵前、后與制成粉制劑后功能成分指標(biāo)對(duì)比

3 結(jié)論

以葡萄、海棠果為原料,經(jīng)復(fù)合發(fā)酵得到最佳工藝條件為:葡萄∶海棠果質(zhì)量比5∶1,發(fā)酵液在溫度25 ℃,初始pH3.8的條件下接種0.20%酵母菌,發(fā)酵24 h,然后在37 ℃條件下,接種0.50%乳酸菌,靜置發(fā)酵28 h。得到的葡萄海棠果酵素SOD酶活力為485.25 U/mL,酵母菌濃度為7.7×108CFU/mL,乳酸菌濃度為5.2×108CFU/mL。發(fā)酵制得的酵素香氣清爽、有發(fā)酵香味、酸味純正、有淡紅色光澤,且富含花青素,多酚等,有很好的抗氧化性能,且具有一定的抑菌效果。ABTS+自由基清除能力與其他自由基清除能力相比,清除率相對(duì)較低。酵素對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。發(fā)酵工藝大大縮短了發(fā)酵時(shí)間,降低了生產(chǎn)成本,真空冷凍干燥使產(chǎn)品中益生菌有效保留,提高了產(chǎn)品品質(zhì)。