高活性副干酪乳桿菌凍干菌粉的制備及工藝優(yōu)化

張雅碩,侯一超,張紫薇,滿朝新,姜毓君

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

近年來,隨著乳酸菌作用機(jī)制的不斷研究,乳酸菌被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、輕工業(yè)及畜禽生產(chǎn)業(yè)等眾多領(lǐng)域,這也促進(jìn)了發(fā)酵劑種類的更新。目前制作乳酸菌發(fā)酵劑的方法有很多,主要有真空干燥、噴霧干燥、真空冷凍干燥和流化床干燥等,但應(yīng)用較為廣泛和有效的是真空冷凍干燥技術(shù)。真空冷凍干燥主要分為三步,首先是產(chǎn)品的預(yù)凍,讓發(fā)酵劑中的水分凍結(jié)成冰,但預(yù)凍的速度和時(shí)間因菌種而異;其次是升華干燥,也稱為第一階段干燥,通過降低真空度,使環(huán)境中水的蒸汽壓降低,冰晶直接轉(zhuǎn)化為水蒸氣從制品中溢出;最后是解析干燥階段,主要是除去產(chǎn)品中結(jié)合水,使制品的水分含量達(dá)到要求,利于儲(chǔ)藏。

在真空冷凍干燥過程中,乳酸菌主要經(jīng)受兩種刺激,即冷凍和干燥,為了減少這兩個(gè)過程對(duì)微生物造成的損傷,必須采取有效的措施。其中,保護(hù)劑的應(yīng)用是第一保護(hù)策略[1]。乳酸菌凍干保護(hù)劑可按照不同的方式進(jìn)行分類,按相對(duì)分子量大小可分為兩類[2-3],一類是低分子量化合物(如糖類、醇類和抗氧化劑等),這類物質(zhì)在冷凍干燥過程中能夠進(jìn)入細(xì)胞,與水分子相互作用,增加溶液的黏度,弱化水的結(jié)晶過程,從而減少細(xì)胞損傷;另一類是高分子量化合物(如脫脂奶粉、可溶性淀粉和聚合物類等),這類物質(zhì)能夠在凍干時(shí)使溶液呈過冷狀態(tài),降低細(xì)胞外溶質(zhì)濃度,避免由于鹽類濃縮而使細(xì)胞脫水,從而減少細(xì)胞發(fā)生滲透性休克、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜塌陷、蛋白質(zhì)鹽析變性等不良后果。在真空冷凍干燥過程中,低分子量保護(hù)劑發(fā)揮直接作用,高分子量保護(hù)劑起到促進(jìn)前者的保護(hù)作用,因此高分子和小分子保護(hù)劑配合使用,會(huì)使乳酸菌在凍干期間維持較高的活性。由于微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大小有差異,因此需要根據(jù)菌株的特異性而選擇合適的凍干保護(hù)劑[4]。此外,改變工藝參數(shù),如預(yù)凍溫度、預(yù)凍時(shí)間等也可以減少真空冷凍干燥對(duì)細(xì)胞造成的損傷[5]。本研究以副干酪乳桿菌為研究對(duì)象,對(duì)保護(hù)劑配方和真空冷凍干燥工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以確定制備副干酪乳桿菌凍干菌粉的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) 分離自我國傳統(tǒng)發(fā)酵稀奶油,本實(shí)驗(yàn)室保存;MRS液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,牛肉浸粉8 g,乙酸鈉5 g,酵母浸粉4 g,磷酸氫二鉀2 g,檸檬酸氫二鉀2 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸錳0.04 g,吐溫-80 1 mL,加蒸餾水至1000 mL,調(diào)pH為7.0～7.2,于121 ℃下滅菌15 min;MRS計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:向MRS液體培養(yǎng)基中加入1.5%～2.0%(w/v)瓊脂粉;海藻糖 Sigma生物試劑有限公司;乳糖 北京索來寶科技有限公司;蔗糖 上海楷洋生物技術(shù)有限公司;麥芽糊精 上海瑞永生物科技有限公司;酵母粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;可溶性淀粉 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(PVP K-30)、谷胱甘肽(GSH) 生工生物工程(上海)股份有限公司;明膠 天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心;維生素C 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;脫脂奶粉 市售。

3K15型高速離心機(jī) 美國SIGMA公司;ALPHA 1-4 LSC plus型真空冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡、E-1010型離子濺射鍍膜儀 日本日立公司;酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司;BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;PL2002型電子天平(0.01 g)、MS-TS型分析天平(0.0001 g)、Delta320型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 菌種活化→擴(kuò)大培養(yǎng)→菌體收集→洗滌→離心收集→菌體懸浮液配制(添加凍干保護(hù)劑溶液)→活菌計(jì)數(shù)→真空冷凍干燥→存活因子的測(cè)定。

1.2.2 工藝操作要點(diǎn)

1.2.2.1 菌體的活化、生長曲線的測(cè)定及擴(kuò)大培養(yǎng) 將副干酪乳桿菌以2%的接種量接種到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,用接種環(huán)蘸取少量菌液于MRS固體平板上三區(qū)劃線,37 ℃培養(yǎng)48 h,挑取典型的單菌落接種于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h,以此反復(fù)3次,第三代得到的菌液作為工作液。

將活化好的副干酪乳桿菌按2%的接種量接種至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h。每隔2 h測(cè)定一次菌液的OD620值,以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD620值為縱坐標(biāo)建立菌株的生長曲線。

將活化三次后的菌液,以2%的接種量接種至錐形瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)[6]。

1.2.2.2 菌體的收集 將培養(yǎng)好的菌液置于離心機(jī)中,5000×g 4 ℃條件下離心10 min,棄上清液,用0.85%無菌生理鹽水洗滌菌體兩次后,再以同樣的條件離心即得菌體沉淀。

1.2.2.3 菌體細(xì)胞的真空冷凍干燥法制備 保護(hù)劑溶液的配制:將大分子保護(hù)劑、糖類、聚合物類中的一種或幾種保護(hù)劑按一定的濃度用蒸餾水溶解,攪拌均勻,于115 ℃下滅菌15 min,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?維生素C、谷胱甘肽采用膜孔徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌。

真空冷凍干燥:在5000×g 4 ℃條件下離心10 min收集菌體沉淀,按菌液(未離心前體積)與保護(hù)劑比例(v/v)為1∶1加入不同配方的保護(hù)劑溶液,計(jì)算初始細(xì)胞活菌數(shù)后分裝進(jìn)行冰箱預(yù)凍(-80 ℃,2 h),凍結(jié)完全后將預(yù)凍好的樣品放入冷阱溫度為-53.2 ℃,真空度為0.162 mbar的真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24 h,然后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 凍干保護(hù)劑種類的選擇 單一凍干保護(hù)劑的選擇:分別選用以下保護(hù)劑[7-9]與菌體充分混勻,觀察菌體的存活情況。

大分子保護(hù)劑:分別選用脫脂奶粉、酵母粉、可溶性淀粉、麥芽糊精進(jìn)行試驗(yàn),濃度均為10%。

糖類保護(hù)劑:分別選用海藻糖、蔗糖、乳糖進(jìn)行試驗(yàn),濃度均為10%。

聚合物類保護(hù)劑:分別選用PVP K-30、明膠進(jìn)行試驗(yàn),濃度均為5%。

抗氧化劑類保護(hù)劑:分別選用維生素C、GSH進(jìn)行試驗(yàn),濃度均為1%。

1.2.3.2 凍干保護(hù)劑濃度的選擇 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,以凍干菌粉的菌體存活因子為指標(biāo),選擇保護(hù)效果最好的四種保護(hù)劑,分別設(shè)置不同的濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn),以確定其加入的最適濃度。其中脫脂奶粉、蔗糖濃度為0、5%、10%、15%、20%;PVP K-30濃度為0、1%、3%、5%、7%、9%;GSH濃度為0、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%。

1.2.4 復(fù)合凍干保護(hù)劑濃度的篩選 選擇單因素優(yōu)化后的真空冷凍干燥保護(hù)劑及其相應(yīng)濃度,以存活因子為指標(biāo),通過正交試驗(yàn)L9(34)選出效果最佳的凍干保護(hù)劑配方,試驗(yàn)因素水平如表1。

表1 保護(hù)劑正交因素水平表

1.2.5 預(yù)冷溫度的確定 取生長到指數(shù)中期的菌液,用無菌生理鹽水洗兩次,重懸于等體積新鮮的MRS肉湯中,分別放置于4、10、15、20 ℃溫度下處理2 h,再置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至穩(wěn)定期。對(duì)照組為培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液。收集各處理?xiàng)l件下的樣品,按照1.2.2.3進(jìn)行真空冷凍干燥處理,并計(jì)算菌體的存活因子。

1.2.6 真空冷凍干燥保護(hù)劑pH的選擇 將篩選出來的復(fù)合保護(hù)劑用滅菌的乙酸或氨水分別調(diào)pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,在37 ℃下與菌體平衡20 min后進(jìn)行真空冷凍干燥,計(jì)算出菌體的存活因子。

1.2.7 菌液和保護(hù)劑比例的確定 按照上述優(yōu)化的試驗(yàn)方法,以菌液/保護(hù)劑為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3 (v/v)的比例,研究其對(duì)菌體凍干存活因子的影響。

1.2.8 凍干厚度的確定 在上述菌液和保護(hù)劑添加比例的基礎(chǔ)上,對(duì)凍干厚度進(jìn)行研究。將菌泥和保護(hù)劑振蕩混勻后,以不同的厚度(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 cm)裝入玻璃平皿中,置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行凍干,計(jì)算其存活因子,確定出最佳的凍干厚度。

1.2.9 預(yù)凍方式的選擇 按照上述優(yōu)化的試驗(yàn)方法,將樣品分別置于-20 ℃冷凍2 h,-80 ℃冷凍2 h,-196 ℃冷凍15 min,然后真空冷凍干燥24 h,測(cè)菌體存活因子[10-11]。

1.2.10 菌粉電鏡觀察 將未添加保護(hù)劑組菌粉和添加復(fù)合保護(hù)劑組菌粉粘貼在樣品臺(tái)上,采用E-1010型離子濺射鍍膜儀鍍一層厚度約為150 ?的金屬鉑膜,使用S-3400N型掃描電鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.11 測(cè)定方法 副干酪乳桿菌活菌數(shù)測(cè)定:將凍干前副干酪乳桿菌菌液及凍干后復(fù)水恢復(fù)活性的樣品進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋,取10-6、10-7、10-8之間稀釋梯度進(jìn)行平板涂布,37 ℃培養(yǎng)48 h,選擇菌落數(shù)在30～300 CFU/mL之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。

凍干存活因子的測(cè)定:用上述平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定凍干前和凍干后的活菌數(shù),計(jì)算菌體的凍干存活因子[12]。凍干前活菌數(shù)為菌液中的活菌數(shù);凍干后活菌數(shù)為凍干菌粉懸浮于10%的蔗糖溶液中,于37 ℃復(fù)水30 min后,恢復(fù)活性后的活菌數(shù)。

凍干存活因子=[1-(lg凍干前活菌數(shù)-lg凍干后活菌數(shù))/lg凍干前活菌數(shù)]

凍干前活菌數(shù)(CFU)=凍干前菌濃(CFU/mL)×v

凍干后活菌數(shù)(CFU)=凍干后菌濃(CFU/g)×m

式中:v代表凍干前菌液體積,mL; m代表凍干后菌粉質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010(Microsoft office 2010)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS statistic 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌生長曲線的繪制

由圖1可知,副干酪乳桿菌生長過程中,0～4 h為延遲期,4～16 h為對(duì)數(shù)期,16～24 h為穩(wěn)定期。菌體進(jìn)入穩(wěn)定期,結(jié)構(gòu)和生理都發(fā)生了很大變化,包括應(yīng)激蛋白、膜組成和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的表達(dá)水平的變化,使菌抗性增加[7],因此,選擇16 h為收獲期。

圖1 副干酪乳桿菌生長曲線

2.2 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

2.2.1 不同類型保護(hù)劑對(duì)副干酪乳桿菌的凍干保護(hù) 圖2為不同種類保護(hù)劑對(duì)副干酪乳桿菌凍干存活因子的影響，從圖2可以看出,所選擇的大分子物質(zhì)能夠顯著(p<0.05)提高菌體的存活因子,但不同的保護(hù)劑保護(hù)效果不同。其中脫脂奶粉的保護(hù)效果最好,顯著(p<0.05)高于酵母粉、可溶性淀粉和麥芽糊精的保護(hù)作用。這可能是因?yàn)槊撝谭鄄粌H像其它大分子物質(zhì)一樣在菌體表面形成保護(hù)層,并且脫脂奶粉中的乳清蛋白在菌體外形成蛋白膜,對(duì)細(xì)胞加以保護(hù),并可以固定凍干的酶類,防止由于細(xì)胞壁蛋白質(zhì)損傷而引起的胞內(nèi)物質(zhì)滲漏[6];同時(shí),乳中其他成分(乳糖、鈣、磷等)也可以起到保護(hù)作用[12-13]。因此,本試驗(yàn)選擇脫脂奶粉為大分子保護(hù)劑。

圖2 不同類型保護(hù)劑對(duì)副干酪乳桿菌凍干菌粉存活因子的影響

糖類保護(hù)劑也能顯著提高菌體的存活因子,其中蔗糖保護(hù)效果最優(yōu)。在凍干過程中,蔗糖可以形成高粘度、低流動(dòng)性的玻璃態(tài)基質(zhì),將蛋白質(zhì)分子支撐起來,使之不易變性[14]。蔗糖分子的多個(gè)羥基,在凍干過程中可取代水分子與菌體表面的自由基聯(lián)結(jié)或與菌體蛋白質(zhì)形成氫鍵,從而對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的完整性起到保護(hù)作用[15]。此外蔗糖可以促進(jìn)菌體分散,還可以作為細(xì)胞今后生長用的碳源[16]。

聚合物類保護(hù)劑在凍結(jié)過程中優(yōu)先析出,可以提高溶液的粘度,抑制pH的降低。在聚合物類保護(hù)劑中PVP K-30保護(hù)效果最好。作為國家批準(zhǔn)的新型安全食品添加劑,PVP K-30可以用作保護(hù)劑、分散劑、粘合劑和給藥劑等[17]。在真空冷凍干燥過程中,PVP K-30可以提高蛋白質(zhì)和氨基酸的穩(wěn)定性。同時(shí),它也是一種非滲透性保護(hù)劑,可以與糖類間氫鍵作用,抑制糖類從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變成結(jié)晶態(tài),從而增加糖的物理穩(wěn)定性[18]。

抗氧化劑類保護(hù)劑在凍干過程中可以通過自身氧化而消耗環(huán)境中的氧,減少乳酸菌與氧的接觸,防止樣品氧化[19]。試驗(yàn)中GSH的保護(hù)效果較好。有研究表明,GSH作為凍干保護(hù)劑在保護(hù)細(xì)胞的同時(shí)減少了飽和脂肪酸的鏈長,進(jìn)而保持細(xì)胞流動(dòng)性。同時(shí)GSH減少細(xì)胞膜脂肪酸被氧化,并促使細(xì)菌有效地適應(yīng)凍干過程[20]。

綜上所述,本試驗(yàn)的單一保護(hù)劑確定為脫脂奶粉、蔗糖、PVP K-30和GSH。

2.2.2 凍干保護(hù)劑濃度篩選 分別考察了脫脂奶粉、蔗糖、PVP K-30、GSH 4種保護(hù)劑不同濃度對(duì)菌體凍干后細(xì)胞存活因子的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同濃度保護(hù)劑對(duì)乳酸菌凍干活力的影響

由圖3a可以看出,脫脂奶粉的添加提高了副干酪乳桿菌凍干菌粉的存活因子,其中濃度為15%時(shí)凍干效果最好,存活因子最高,繼續(xù)增大脫脂奶粉的濃度,保護(hù)效果逐漸減少。由圖3b可知,隨著蔗糖濃度的增加,菌體凍干存活因子也提高,但蔗糖濃度高于15%時(shí),凍干菌的存活因子出現(xiàn)下降趨勢(shì),因此蔗糖濃度為15%時(shí)存活因子最高,菌的活性最好。由圖3c可以看出,當(dāng)PVP K-30濃度低于7%時(shí),隨著PVP K-30濃度的增加,凍干菌體的存活因子也呈上升趨勢(shì),當(dāng)PVP K-30濃度為7%時(shí),保護(hù)效果最好。由圖3d可以看出,當(dāng)GSH濃度為0.4%～1.0%時(shí),凍干菌的存活因子隨濃度的增加而上升,當(dāng)GSH濃度為1.0%～1.6%時(shí),凍干菌的存活因子隨濃度的增加而下降,因此GSH濃度為1%時(shí)存活因子最高。由此可以看出,副干酪乳桿菌凍干存活因子與各保護(hù)劑濃度之間并不是線性增長關(guān)系,其趨勢(shì)為先升高后下降。保護(hù)劑濃度較低時(shí),隨著濃度的升高,細(xì)胞活力不斷提高,但到一定濃度后,隨著保護(hù)劑質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞活力反而下降。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)保護(hù)劑濃度過高時(shí),細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚合程度加劇,形成較強(qiáng)的玻璃化結(jié)構(gòu),對(duì)凍干菌粉的低溫儲(chǔ)藏不利,導(dǎo)致復(fù)水效果差[21]。因此,據(jù)圖中結(jié)果可知保護(hù)劑脫脂奶粉15%、蔗糖15%、PVP K-30 7%、GSH 1%為最佳濃度,以此作為正交試驗(yàn)的依據(jù)。

2.2.3 凍干保護(hù)劑正交試驗(yàn) 單獨(dú)使用某種保護(hù)劑的效果并不理想,為進(jìn)一步提高菌體存活因子,需對(duì)凍干保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。以上試驗(yàn)已確定4種最佳保護(hù)劑及其濃度,采用正交試驗(yàn)的優(yōu)化方式,進(jìn)行保護(hù)劑配方的確定。

由表2可知，四種保護(hù)劑對(duì)副干酪乳桿菌的極差R的大小順序?yàn)镽A>RD>RC>RB,由直觀分析可知,凍干存活因子最高的保護(hù)劑組合為A2B3C2D3,即脫脂奶粉15%,蔗糖20%,PVP-K30 7%,GSH 1.3%。為了驗(yàn)證由正交試驗(yàn)得到的最佳保護(hù)劑是否能得到最高的存活因子,按照直觀分析得到的保護(hù)劑組合(A2B3C2D3)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn),副干酪乳桿菌的凍干存活因子為(0.977±0.002),高于正交試驗(yàn)中得到的結(jié)果,因此認(rèn)為正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果有效[22]。

表2 副干酪乳桿菌凍干保護(hù)劑正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 預(yù)冷溫度對(duì)副干酪乳桿菌凍干活力的影響

國內(nèi)外研究表明,影響乳酸菌凍干存活的因素有很多,如菌株間的差異,培養(yǎng)方式的不同,凍干前的預(yù)處理,保護(hù)劑的選擇等都會(huì)影響乳酸菌活力。在凍干之前,對(duì)乳酸菌進(jìn)行脅迫處理,可以提高其對(duì)環(huán)境的抗性。各種脅迫包括溫度脅迫(熱脅迫和冷脅迫)、滲透壓脅迫、酸脅迫和饑餓脅迫等[23]。乳酸菌在生長過程中受到脅迫,會(huì)引起細(xì)胞的某種生理變化,這些變化可以促進(jìn)乳酸菌提前產(chǎn)生抵御冷凍干燥的細(xì)胞機(jī)制,適應(yīng)不良環(huán)境,從而提高干燥的活力。Shao等[24]通過冷脅迫提高了德氏乳桿菌亞種保加利亞乳桿菌ND02的凍干活性。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn),在冷凍干燥之前,對(duì)酒類酒球菌進(jìn)行冷脅迫、乙醇脅迫和酸脅迫后,菌體細(xì)胞膜不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸的比例上升,環(huán)丙烯脂肪酸含量增加,增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)激能力,提高了酒類酒球菌的冷凍干燥活性。

由圖4可以看出,經(jīng)過預(yù)冷處理后的細(xì)胞,真空冷凍干燥后存活因子都普遍升高。當(dāng)冷脅迫溫度為4 ℃時(shí),與未處理組相比,菌體存活因子升高幅度不大?？赡苁窃? ℃下,細(xì)胞的代謝遲緩,不會(huì)或很少產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。10 ℃冷激的菌體細(xì)胞存活因子較對(duì)照組提高0.003,效果比4 ℃稍好。15 ℃冷激效果最佳,菌體細(xì)胞凍干后存活因子達(dá)到0.984,但20 ℃時(shí)冷激產(chǎn)生效果有所下降,可能是預(yù)冷溫度升高,乳酸菌受到的刺激減小,從而產(chǎn)生抗冷凍干燥的物質(zhì)減少所造成的。所以選擇15 ℃ 2 h作為預(yù)冷處理。

圖4 不同預(yù)冷條件對(duì)副干酪乳桿菌凍干存活因子的影響

2.4 復(fù)合保護(hù)劑pH的選擇

保護(hù)劑的pH對(duì)乳酸菌的凍干存活有一定的影響,適宜的pH有利于菌體在凍干過程中保持較高活力[26]。如圖5所示,在pH為6.5時(shí),菌體凍干后存活因子最高,pH過低時(shí)不利于菌體保持活力,當(dāng)pH高于6.5時(shí),菌體存活因子下降,可能是因?yàn)槠x乳酸菌生長的最適pH,不利于菌體冷凍干燥,所以最終選擇保護(hù)劑pH為6.5。

圖5 保護(hù)劑pH對(duì)副干酪乳桿菌凍干存活的影響

2.5 菌液和保護(hù)劑比例對(duì)菌體凍干存活的影響

菌液和凍干保護(hù)劑比例會(huì)影響乳酸菌的凍干活性。由圖6可知,當(dāng)菌液和保護(hù)劑比例為1∶1.5 (v/v)時(shí),菌體的凍干存活因子最大,隨著保護(hù)劑比例的增加,菌體存活因子下降,一方面可能是因?yàn)楸Ｗo(hù)劑濃度過高,細(xì)胞的通透性下降,水分揮發(fā)受阻,導(dǎo)致較多冰晶生成,從而造成細(xì)胞死亡率增大;另一方面可能是因?yàn)楸Ｗo(hù)劑過多,單位體積或質(zhì)量菌粉活菌數(shù)減少。因此,選擇菌液和保護(hù)劑比例為1∶1.5 (v/v)時(shí)為最佳配比。

圖6 菌液和保護(hù)劑比例對(duì)副干酪乳桿菌凍干存活的影響

2.6 凍干物料厚度對(duì)菌體凍干存活因子的影響

如圖7所示,從凍干厚度來看,隨著厚度的增加,菌體存活因子不斷上升,當(dāng)厚度達(dá)到0.5 cm時(shí),存活因子達(dá)到最大值,為(0.994±0.004),但繼續(xù)增加厚度,菌體的凍干活性下降。當(dāng)物料厚度不足時(shí),冷凍的菌體從低溫冰箱中取出放入真空冷凍干燥機(jī)過程中容易融化,再重新凍結(jié)時(shí),造成菌體損傷,而物料厚度足夠厚時(shí),相對(duì)不易融化,減少了二次凍結(jié)對(duì)菌體的損傷。而當(dāng)物料厚度過厚時(shí),細(xì)胞失去結(jié)合水難度增加,菌粉的水分含量增加,不利于儲(chǔ)存。因此,選擇0.5 cm為最佳凍干厚度。

圖7 物料凍干厚度對(duì)菌體存活因子的影響

2.7 預(yù)凍方式的確定

預(yù)凍溫度是制作凍干菌粉的關(guān)鍵參數(shù)之一,細(xì)胞外冰晶的形成可能會(huì)破壞細(xì)胞膜,從而降低乳酸菌細(xì)胞的活力[1]。并且,冷凍速率會(huì)影響冰晶的成核,快速冷凍可以產(chǎn)生較小的冰晶,對(duì)細(xì)胞的不利影響減小[27]。所以,預(yù)凍溫度的確定對(duì)乳酸菌凍干發(fā)酵劑的制備有重要意義。由圖8結(jié)果顯示,當(dāng)用液氮預(yù)凍時(shí),副干酪乳桿菌的存活因子達(dá)到(0.998±0.001),顯著(p<0.05)高于-20 ℃預(yù)凍效果,也高于-80 ℃預(yù)凍(0.995±0.002)效果。這可能是因?yàn)樵?20 ℃條件下預(yù)凍,形成的冰晶大,在干燥階段,升華速度慢,從而導(dǎo)致菌體活力下降。此外,液氮預(yù)凍所需時(shí)間比-80 ℃短,因此選擇液氮下處理15 min為最佳預(yù)凍方式。

圖8 預(yù)凍方式對(duì)副干酪乳桿菌存活因子的影響

2.8 凍干菌粉微觀結(jié)構(gòu)的電鏡觀察

通過掃描電鏡圖9可知,未添加保護(hù)劑的菌粉部分細(xì)胞明顯破裂,變形嚴(yán)重,細(xì)胞之間相互堆積,胞間有絲狀物相互黏連,這可能是由于細(xì)胞變形或破裂后內(nèi)容物泄露所造成的。而添加保護(hù)劑的凍干菌粉中保護(hù)劑與菌體分布均勻,菌體清晰,形態(tài)飽滿,呈桿狀,菌體均被覆蓋在薄的涂層下,這在一定程度給細(xì)胞膜提供了保護(hù)效應(yīng),減少了與外界的接觸,避免了氧化損傷,從而維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

圖9 掃描電鏡圖(×200000)

3 結(jié)論

本研究以副干酪乳桿菌為對(duì)象,對(duì)其凍干菌劑的制備進(jìn)行探究。單一保護(hù)劑因其作用的局限性而不能滿足保護(hù)的要求,通過正交試驗(yàn),確定了副干酪乳桿菌凍干保護(hù)劑最佳配方為:脫脂奶粉15%,蔗糖20%,PVP K-30 7%,GSH 1.3%。單因素試驗(yàn)確定了副干酪乳桿菌真空冷凍干燥的工藝參數(shù)為:在15 ℃下預(yù)冷2 h,保護(hù)劑pH為6.5,菌液和保護(hù)劑的比例(v/v)為1∶1.5,凍干厚度為0.5 cm,預(yù)凍方式采用液氮(-196 ℃)冷凍15 min。在此條件下,副干酪乳桿菌經(jīng)真空冷凍干燥后存活因子達(dá)(0.998±0.001),活菌數(shù)為(2.35±0.02)×1011CFU/g。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),未添加保護(hù)劑的菌粉細(xì)胞表面褶皺破裂,造成細(xì)胞內(nèi)容物泄露,而添加了復(fù)合保護(hù)劑的細(xì)胞經(jīng)過真空冷凍干燥后,細(xì)胞仍保持完整結(jié)構(gòu),菌體結(jié)合相對(duì)疏松,有利于凍干菌粉復(fù)水。