單因素法考察川牛膝多糖提取工藝

趙玥琪，郝婧瑋，王鏡哲

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江牡丹江157012)

川牛膝歸屬莧科多年生植物川牛膝(Radixcyathulae)的干燥根[1]。研究發(fā)現(xiàn)川牛膝中含有多種藥用成分，如皂苷類、甾酮類、多糖類、甜菜堿以及多種微量的元素[2-5]。其主要活性成分川牛膝多糖是一種高度分支的多糖，含有D-果糖、D-葡萄糖，可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)白細(xì)胞護(hù)肝功能[6-10]，廣泛用于機(jī)體免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤治療。本文采用單因素實(shí)驗(yàn)法，比較川牛膝多糖提取過程中，提取方式、提取溫度、提取時(shí)間、提取料液比對川牛膝多糖得率的影響，用硫酸苯酚顯色法與紫外分光光度法進(jìn)行最優(yōu)條件篩選，為后期工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)率提升提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥材。川牛膝(四川)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器。 紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，T6新世紀(jì))；臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)(貝克曼庫爾特，Microfuge 22R)；鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科學(xué)儀器有限公司，DHG-9140A)；分析天平(寬多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，BSA224S-CW)；智能控溫電熱套(金壇市榮華儀器制造有限公司，HDM-1000C)；數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-400DB)；電熱恒溫水浴鍋(上海-恒科技有限公司，HWS28型)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑。苯酚(AR)、濃硫酸(AR)、石油醚(AR)、無水葡萄糖(AR)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 川牛膝脫脂除水除雜

稱取3份1.0g粉碎后的川牛膝，放置烘箱內(nèi)，溫度調(diào)至50℃，烘干至恒重后放于分析天平中稱量，通過公式(1-1)計(jì)算出川牛膝的含水率，為稱取5.0g絕干重提供數(shù)據(jù)。

M絕干重=M實(shí)重×(1-含水率)

(1-1)

稱取3份1.0g粉碎后川牛膝，加入20mL石油醚(AR)進(jìn)行時(shí)間為6h的脫脂，放置24h待石油醚揮發(fā)后，通過公式(1-2)計(jì)算出川牛膝含脂率。

M脫脂重=M實(shí)重×(1-含脂率)

(1-2)

對所有粉碎過的川牛膝進(jìn)行脫脂處理，防止所含脂類影響多糖實(shí)驗(yàn)提取測定。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)中雖有多個(gè)(提取方式時(shí)間溫度料液比)影響因素，但在安排實(shí)驗(yàn)時(shí)只考慮一個(gè)影響因素，其它因素盡量保持不變的實(shí)驗(yàn)，即為單因素實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)中，提取方式、提取時(shí)間、提取溫度、料液比各因素間沒有交互作用，故可以采用此種方法。

1.2.3 提取方式對提取率的影響

稱取絕干重5.0g樣品，將樣品放入燒杯中加入蒸餾水，分別在超聲波震蕩器中進(jìn)行超聲波輔助提取和加熱套中進(jìn)行煎煮提取法提取。控制其他因素為：溫度50℃，提取時(shí)間1h，料液比1∶10。

1.2.4 提取溫度對提取率的影響

稱取絕干重5.0g樣品，分別在溫度為20、40、60、80℃條件下采用超聲波提取法提取多糖?？刂破渌蛩貫椋禾崛r(shí)間1h，料液比1∶10。

1.2.5 提取時(shí)間對提取率的影響

稱取絕干重5.0g樣品，溫度50℃，料液比1∶10，分別在超聲波震蕩0.5、1.0、1.5、2.0h進(jìn)行取樣。

1.2.6 提取料液比對提取率的影響

稱取絕干重5.0g樣品，加入樣品與蒸餾水采用超聲波提取法進(jìn)行料液比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶25、1∶30的多糖提取?？刂破渌蛩貫椋禾崛r(shí)間1h，提取溫度50℃。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn)處理

將1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6實(shí)驗(yàn)所得溶液各取2mL，離心機(jī)除雜。所得樣品，采用苯酚-硫酸法使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行多糖含量測定。

絕干重提取率=(C樣品多糖濃度×稀釋倍數(shù)×V體積)/M絕干重

(1-3)

1.2.8 硫酸苯酚法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測定多糖含量

稱取0.05g無水葡萄糖，加蒸餾水定容至500mL，配置為0.1g/L(0.1mg/mL)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加蒸餾水至每組2.0mL，加入5%苯酚溶液[現(xiàn)用現(xiàn)配：取苯酚(AR)0.05g至10mL的棕色容量瓶定容到10mL，放置于超聲波震蕩器中促使苯酚完全溶解]1.0mL，加入濃硫酸5.0mL，試劑添加完畢震蕩5min，室溫下靜置30min，(提前啟動(dòng)紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min)在波長為490nm進(jìn)行測量，橫坐標(biāo)X軸指示濃度，縱坐標(biāo)Y軸指示吸光度，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 多糖最優(yōu)條件下水提醇沉

川牛膝多糖最佳醇沉濃度為85%[11]。將最優(yōu)條件下的提取液，離心除雜后，加入少量無水乙醇，沉降12h后再加入無水乙醇使?jié)舛冗_(dá)到85%，沉降24h后除去不容雜質(zhì)，放置在恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)置為60℃，直至蒸干可刮下收集。

本次實(shí)驗(yàn)主要研究提取過程中提取方式、溫度時(shí)間、料液比對提取率的影響，不涉及多糖醇沉的濃度篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 川牛膝脫脂除水除雜結(jié)果與分析

表1 川牛膝含水率

表2 川牛膝含脂率

由表1和表2可見，川牛膝的含水率為7.97%，含脂率為0.022%，藥材轉(zhuǎn)移過程中有損耗，得出結(jié)論含脂率不影響脫水率計(jì)算，絕干重稱取按照含水率計(jì)算。每稱取5g絕干重的川牛膝藥材，根據(jù)公式(1-1)需稱取原重為5.43g的川牛膝藥材。

為防止雜質(zhì)中極少量脂類影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度，對所有川牛膝進(jìn)行脫脂處理，待石油醚全部揮發(fā)后繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)與多糖含量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作表

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度0.1mg/mL溶液各濃度吸光度數(shù)據(jù)做出圖1。

圖1 苯酚-硫酸法測葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品在490nm處的吸光度值，以濃度作為橫坐標(biāo)(X)，吸光度值作為縱坐標(biāo)(Y)繪制葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，得到線性回歸方程Y=1.2114X-0.0067 R2= 0.9976，在0.00～0.10(0.1mg/mL)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 提取方法的比較

圖2 提取方法對提取率的影響

由圖2可知在提取溫度為50℃、提取時(shí)間1h、提取料液比1∶10的情況下，超聲波提取法比煎煮法提取率更高，更適合川牛膝多糖的提取，確定后期提取溫度提取時(shí)間提取料液比時(shí)用超聲波提取法，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)在超聲波振蕩器中進(jìn)行。超聲波會(huì)產(chǎn)生高速且強(qiáng)烈的空化效應(yīng)與振動(dòng)攪拌的作用，可以破壞植物細(xì)胞壁，使溶劑快速進(jìn)入到藥材細(xì)胞中，加速溶液交換，可縮短提取時(shí)間，顯著提高提取率。

2.2.3 提取溫度的比較

由圖3可知在相同超聲波輔助、提取時(shí)間1h、提取料液比1∶10的情況下，提取溫度為60℃時(shí)提取率最高為24.6%，溫度過低細(xì)胞膜通透性較低，提取速度緩慢；溫度過高破壞川牛膝藥材中的多糖降低了提取率，故最優(yōu)提取溫度為60℃。

圖3 提取溫度對提取率的影響

2.2.4 提取時(shí)間的比較

圖4 提取時(shí)間對提取率的影響

由圖4可知在相同超聲波輔助、提取溫度50℃、提取料液比1∶10的情況下，提取時(shí)間短反應(yīng)提取不完全，導(dǎo)致提取率較低；提取時(shí)間較長時(shí)多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞提取率低且占用時(shí)間長效率低。故提取時(shí)間1.5h時(shí)提取率最高為25.4%，故最優(yōu)提取時(shí)間是1.5h。

2.2.5 提取料液比的比較

圖5 提取料液比對提取率的影響

由圖5可知在相同超聲波輔助、提取時(shí)間1h、提取溫度50℃的情況下，料液比過低時(shí)，提取出的多糖較少，在1∶20時(shí)提取率最高；料液比比例加大提取率降低。故提取料液比1∶20時(shí)提取率最高為41.5%，故最優(yōu)提取料液比為1∶20。

2.3 多糖最優(yōu)條件下水提醇沉

川牛膝多糖最佳醇沉濃度為85%[11]，將最優(yōu)條件下的提取液，提取溫度60℃提取時(shí)間1.5h提取料液比1∶20，離心除雜后，加入少量無水乙醇，沉降12h后再加入無水乙醇使?jié)舛冗_(dá)到85%，沉降24h后除去不容雜質(zhì)，放置在恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)置為60℃，直至蒸干可刮下。經(jīng)過稱量最終得率為47.12%。

本次實(shí)驗(yàn)主要研究提取過程中提取方式溫度時(shí)間料液比對提取率的影響，不涉及多糖醇沉的濃度篩選。

3 討論

3.1 溫度對實(shí)驗(yàn)的影響

溫度影響分子運(yùn)動(dòng)，超聲波輔助法提取時(shí)，超聲過程中，在超聲波的作用下，溫度持續(xù)上升，難以下降，實(shí)驗(yàn)開始前要嚴(yán)格控制溫度，溫度穩(wěn)定后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)是單因素實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)需嚴(yán)格控制溫度，防止溫度偏差導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

3.2 醇沉法獲取多糖工藝需改進(jìn)

醇沉過程中，溫度不宜控制，隨著溫度的升高，醇揮發(fā)的同時(shí)，多糖容易氧化，蒸干程度難以掌握。建議超聲波輔助提取法提取完成之后用真空冷凍干燥法進(jìn)行多糖收集。

3.2.1 提取溫度升高提取率下降。多糖是化學(xué)成分，隨著提取水浴溫度的升高，熱量不斷聚集導(dǎo)致分子運(yùn)動(dòng)加劇，更容易進(jìn)行多糖的提取，多糖得率亦隨之增加。而溫度達(dá)到60℃以上時(shí)，隨著熱量的吸收，川牛膝多糖中某一類糖類化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，所以川牛膝多糖提取率下降。提取溫度應(yīng)該設(shè)置在川牛膝多糖應(yīng)提糖類不被破壞的臨界溫度。

3.2.2 料液比過大過小時(shí)提取率低。料液比過低時(shí)，體積過小，多糖在提取液中有一定的溶解度，提取液體積過小，導(dǎo)致溶解出的多糖少，因此提取率比較低。料液比過高時(shí)，隨著多糖的析出，多糖濃度升高，提取液帶有極性與濃度差，因此提取液體積過大效果減弱，不能促進(jìn)多糖的析出。故應(yīng)選擇適當(dāng)料液比，滿足多糖的溶解度，利用濃度差析出更多的川牛膝多糖。

4 結(jié)論

4.1 超聲波輔助提取法的提取率較煎煮法高出一倍，且超聲波清洗儀具加熱功能，可降低成本。

4.2 提取溫度為60℃時(shí)提取率高，多糖不被破壞，且所需反應(yīng)溫度低。

4.3 提取時(shí)間為1.5h時(shí)提取率最高，耗時(shí)中等，反應(yīng)時(shí)間不長，效率高。

4.4 提取料液比為1∶20時(shí)提取率最高，提取完成后，要立即濃縮，避免后期收集多糖耗材耗時(shí)過多。

4.5 采用超聲波輔助提取法、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為1.5h、提取料液比為1∶20時(shí)、提取率最高，為47.12%。