野菊花水提物對(duì)胰島素通路突變體果蠅發(fā)育及代謝功能的影響

張?jiān)?，金麗華

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病是機(jī)體內(nèi)胰島素分泌或利用缺陷長(zhǎng)期使葡萄糖積累在循環(huán)血液中，機(jī)體代謝平衡被破壞所引起的一種慢性疾病[1]，伴有多種并發(fā)癥如視網(wǎng)膜、腎臟、血管、神經(jīng)等功能性病變[2]。其中2型糖尿病最為常見，且發(fā)病率逐年上升[3-4],已經(jīng)嚴(yán)重影響人們的健康。目前的治療手段主要是通過藥物控制血糖的升高，比如注射胰島素或口服降糖的藥物等，用于防治相關(guān)的并發(fā)癥。然而此類藥物存在一定的副作用[5-6]。

中草藥毒副作用小、成本低廉、應(yīng)用前景廣泛[7]。因此中醫(yī)藥對(duì)于糖尿病的治療越來越得到重視。野菊花為菊科多年生草本植物，以干燥頭狀花序入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物之一。主要化學(xué)成分包括萜類、黃酮類化合物、酚類等，具有抗炎、清熱解毒、降血壓等功效[8-9]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)野菊花水提物可以緩解果蠅中由高糖飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂及生長(zhǎng)缺陷[10]，但野菊花在治療糖尿病方面的作用仍知之甚少。

果蠅調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)的機(jī)制與人類非常相似，可作為研究2型糖尿病的重要模式生物，它的胰島素生理功能主要通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑發(fā)揮作用[11-12]。該途徑中的任何環(huán)節(jié)異常都可能導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而使機(jī)體糖代謝穩(wěn)態(tài)失衡[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)果蠅chico及S6k的突變均導(dǎo)致個(gè)體體質(zhì)量下降，并且影響細(xì)胞的代謝[15]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)chico和S6k突變體的蛹?xì)んw積、成蟲體質(zhì)量、脂肪體油滴大小、翅膀面積及單位面積內(nèi)翅膀細(xì)胞數(shù)方面的分析，研究喂食野菊花水提物對(duì)突變體果蠅生長(zhǎng)發(fā)育及代謝功能的影響，為開發(fā)治療2型糖尿病的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材與試劑

野菊花(FlosChrysanthemiIndici, CI)頭狀花序，購(gòu)買于黑龍江省哈爾濱市人民同泰大藥房，由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馮富娟教授鑒定。氟硼二吡咯(Boron-dipyrromethe, BODIPY)、鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)購(gòu)自于Life Technologies公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)w1118為本實(shí)驗(yàn)室保存，突變體果蠅chico1/CyO及S6kl-1/TM6B由Tian Xu教授提供。果蠅培養(yǎng)溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度60%～70%。

1.3 儀器

ALC-210.4型電子分析天平，北京賽多利斯公司；Elix5型純化水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；SZ51型顯微鏡，日本Olympus公司；Axioskop 2 plus型熒光顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司。

2 方法

2.1 野菊花水提液的制備

稱取20 g野菊花放入圓底燒瓶，加200 mL去離子水浸泡12 h，大火加熱煮沸后微火熬制3 h，紗布過濾收集濾液；濾渣再次加入200 mL去離子水同樣方法熬制3 h，收集兩次濾液濃縮至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.2 g/mL(20%)的野菊花水提液，室溫冷卻后置-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 果蠅培養(yǎng)基的配制

對(duì)照組(正常培養(yǎng)基)：培養(yǎng)基配制方法參照文獻(xiàn)方法[16]。

實(shí)驗(yàn)組(野菊花水提物培養(yǎng)基)：將對(duì)照組培養(yǎng)基中的去離子水替換成等體積的野菊花水提液，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中野菊花的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%(0.1 g/mL)。

2.3 果蠅蛹?xì)んw積及體質(zhì)量的測(cè)定

正常培養(yǎng)基中孵化的野生型果蠅和突變體果蠅作為對(duì)照組，10%野菊花水提物培養(yǎng)基中孵化的突變體果蠅作為實(shí)驗(yàn)組。將已經(jīng)孵化出成蟲果蠅的蛹?xì)し胖糜谳d玻片上，用毛刷蘸取甘油將其固定擺放整齊，每組分別收集30個(gè)蛹?xì)ぴ陲@微鏡下照相，利用ImageJ軟件測(cè)量蛹?xì)さ拈L(zhǎng)和寬后用公式計(jì)算體積并進(jìn)行比較。公式：4/3π(L/2)(l/2)2(L，長(zhǎng)度；l，寬度)[17]。隨機(jī)收集羽化24 h以內(nèi)的成蟲果蠅，雌雄分開，每組各30只，裝入已稱量好的EP管中在電子天平上稱量果蠅的體質(zhì)量。每組重復(fù)5次計(jì)算平均體質(zhì)量進(jìn)行比較。

2.4 BODIPY和Phalloidin染色

室溫下每組果蠅隨機(jī)提取15～20只三齡幼蟲脂肪體于4%多聚甲醛中固定30 min，用PBST(PBS+0.1% Tween20)將組織清洗3次，每次5 min，然后在分別在Phalloidin和BODIPY中各染色30 min，DAPI染色10 min，每次染色后分別用PBST將組織清洗3次，每次5 min，最后slowfade封片在熒光顯微鏡下觀察拍照。利用ImageJ軟件測(cè)量脂肪體細(xì)胞大小和脂滴面積。

2.5 成蟲翅膀面積的測(cè)定

每組隨機(jī)收集20只雄果蠅翅膀，用石蠟油將其固定于載玻片上擺放整齊，顯微鏡下照相后利用Image J軟件測(cè)量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)胰島素通路突變體果蠅個(gè)體大小的影響

為分析野菊花水提物對(duì)于突變體果蠅個(gè)體大小的影響，我們分別收集喂食不同培養(yǎng)基果蠅的蛹?xì)ぃ@微鏡下照相后計(jì)算其體積進(jìn)行比較。結(jié)果表明，與野生型果蠅相比，chico1/CyO突變體蛹?xì)んw積減少了27.7%，當(dāng)突變體果蠅喂食10%野菊花后蛹?xì)んw積顯著增加17%(圖1A-B)，說明喂食野菊花提取物可明顯緩解chico1/CyO突變體蛹?xì)んw積減小的情況。

另外，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中S6k是chico下游的基因，我們過去的研究發(fā)現(xiàn)野菊花水提物可以改善S6kl-1/TM6B突變體的生長(zhǎng)缺陷[10]，這里我們對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證。S6kl-1/TM6B突變體與野生型果蠅相比蛹?xì)んw積減少了21.9%，當(dāng)突變體喂食10%野菊花后蛹?xì)んw積顯著增加23.6%(圖1C-D)，與過去的結(jié)論一致。說明野菊花水提物對(duì)chico1/CyO以及S6kl-1/TM6B突變體果蠅蛹?xì)んw積減小情況均有明顯的緩解作用。

圖1 野菊花水提物對(duì)突變體果蠅蛹?xì)んw積的影響(n=30)

3.2 對(duì)胰島素通路突變體果蠅體質(zhì)量的影響

由于胰島素通路基因發(fā)生突變以后，個(gè)體顯著變小。因此，我們進(jìn)一步分析了野菊花水提物對(duì)突變體果蠅成蟲體質(zhì)量的影響。結(jié)果顯示，與野生型果蠅相比，chico1/CyO雌果蠅體質(zhì)量降低11%，雄果蠅體質(zhì)量降低26.9%。當(dāng)突變體喂食10%野菊花后，雌果蠅體質(zhì)量無明顯變化，但是，雄果蠅體質(zhì)量顯著增加35.6%(圖2A-B)。

另外，我們也對(duì)之前研究發(fā)現(xiàn)的S6kl-1/TM6B突變體喂食10%野菊花后體質(zhì)量進(jìn)行了驗(yàn)證，得到一致的結(jié)論。與野生型果蠅相比，S6kl-1/TM6B雌果蠅體質(zhì)量降低了20.5%，雄果蠅體質(zhì)量降低24.2%。當(dāng)突變體果蠅喂食10%野菊花后，雌果蠅體質(zhì)量變化不明顯，雄果蠅體質(zhì)量顯著增加32%(圖2C-D)。結(jié)果表明野菊花水提物可以提高chico1/CyO和S6kl-1/TM6B突變體雄果蠅成蟲體質(zhì)量。

圖2 野菊花水提物對(duì)突變體果蠅體質(zhì)量的影響(n=150)

3.3 對(duì)S6kl-1/TM6B突變體果蠅翅膀大小的影響

個(gè)體變小主要是由于各個(gè)組織器官變小引起的，因此，我們進(jìn)一步探究野菊花水提物對(duì)突變體果蠅翅膀大小的影響。我們對(duì)之前研究的S6kl-1/TM6B突變體喂食野菊花后翅膀面積進(jìn)行了驗(yàn)證，研究結(jié)論一致。與野生型果蠅相比，S6kl-1/TM6B突變體翅膀面積及單位面積內(nèi)翅膀細(xì)胞數(shù)分別減少了11.8%和14%。當(dāng)突變體果蠅喂食10%野菊花后翅膀面積顯著增加11.5%，單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)增加9.4%(圖3A-D)。說明野菊花水提物可以改善果蠅S6k突變后翅膀面積變小及單位面積內(nèi)翅膀細(xì)胞數(shù)量減少的情況。

圖3 野菊花提取物對(duì)S6kl-1/TM6B突變體 果蠅翅膀大小的影響(n=20)

3.4 對(duì)胰島素通路突變體果蠅脂肪代謝的影響

以上結(jié)果表明野菊花水提物可以緩解突變體果蠅的生長(zhǎng)缺陷。為進(jìn)一步探究野菊花水提物對(duì)突變體果蠅細(xì)胞大小以及脂肪代謝的影響，我們對(duì)果蠅的脂肪體細(xì)胞進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，與野生型果蠅相比，chico1/CyO突變體脂滴面積、細(xì)胞核大小以及脂肪體細(xì)胞面積均顯著減小。當(dāng)突變體喂食10%野菊花后，脂滴面積、細(xì)胞核以及脂肪體細(xì)胞面積分別顯著增加了30.4%、32%、28.6%(圖4A-D)。

另外我們之前的研究發(fā)現(xiàn)S6kl-1/TM6B雜合體喂食10%野菊花水提物后可以改善脂肪代謝，增加細(xì)胞大小。這里我們利用S6k純合突變體果蠅的脂肪體細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步分析。與野生型果蠅相比，S6kl-1/S6kl-1突變體果蠅脂滴面積、細(xì)胞核大小以及脂肪體細(xì)胞面積均顯著減小。當(dāng)S6kl-1/S6kl-1喂食10%野菊花水提物后，其脂滴面積、細(xì)胞核以及脂肪體細(xì)胞面積分別顯著增加44%、33.7%、28.1%(圖4A-D)。說明野菊花水提物均能夠明顯改善突變體chico1/CyO及S6kl-1/S6kl-1的脂肪細(xì)胞大小減小及脂肪體代謝貯存情況。

圖4 野菊花水提物對(duì)突變體果蠅幼蟲 脂肪體細(xì)胞的影響(n=15～20)

4 討論

近年來，中醫(yī)對(duì)治療糖尿病的中藥進(jìn)行了廣泛的研究，但每種中草藥的作用機(jī)理不同[18]。野菊花作為我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物之一，具有抑菌、抗病毒、降血壓等功效被廣泛用于治療多種疾病[19]，且毒副作用小、安全、來源廣、成本低等優(yōu)點(diǎn)是西藥所不具備的。果蠅胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑與哺乳動(dòng)物具有高度的保守性[20]，所以利用果蠅模型快速篩選治療糖尿病的中藥。果蠅中控制能量代謝的相互拮抗兩條信號(hào)通路：胰島素信號(hào)通路(insulin pathway)和脂動(dòng)激素(AKH)信號(hào)通路，負(fù)責(zé)管理能量的流動(dòng)運(yùn)輸和互換，即糖類和脂類物質(zhì)[21]，果蠅中胰島素信號(hào)傳導(dǎo)與脂肪代謝緊密相關(guān)[22]。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)胰島素通路突變體果蠅喂食野菊花水提物后生長(zhǎng)狀態(tài)以及脂肪貯存等方面進(jìn)行分析，表明突變體喂食野菊花水提物后蛹?xì)んw積、體質(zhì)量、脂肪代謝情況及翅膀面積均得到了明顯的改善。說明野菊花水提物對(duì)于胰島素通路突變體果蠅的生長(zhǎng)缺陷有一定的緩解作用，但具體影響果蠅發(fā)育代謝的機(jī)制以及野菊花水提物針對(duì)抗糖尿病方面的具體藥理藥性仍然需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。我們的結(jié)果為野菊花在治療糖尿病方面的開發(fā)和利用提供新的思路。