齊墩果酸衍生物SZC014同時誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡和自噬

謝賢鑫，王聰，李偉杰，李歡，姜大慶*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧 沈陽 110042；2.遼寧省乳腺癌研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110042)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，約占女性腫瘤的三分之一[1-3]。外科手術(shù)切除作為治愈性治療的基石傳統(tǒng)上是早期癌癥的初始治療，而化療及靶向治療的參與可明顯提高進(jìn)展期和晚期癌癥的總生存期和無進(jìn)展生存期[4]。近年來，大量治療乳腺癌的化療藥物問世，然而不幸的是絕大多數(shù)乳腺癌的患者最終往往對化療藥物耐受，從而導(dǎo)致治療失敗甚至死亡。一類靶定乳腺癌細(xì)胞特異性分子缺陷的藥物可以使乳腺癌患者獲益，其中曲妥珠單抗和拉帕替尼治療HER-2過表達(dá)的乳腺癌[5]以及依維莫司聯(lián)合內(nèi)分泌治療對抗激素受體陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌[6]是這類靶向藥物的代表。盡管如此，根據(jù)美國癌癥協(xié)會2014年的統(tǒng)計分析，乳腺癌仍為女性腫瘤的第二大死因，僅次于肺癌。因此，迫切需要研發(fā)高效而低毒的新藥或輔助藥。

三萜系化合物是來自植物提取物的傳統(tǒng)中藥的重要成分，同時三萜系化合物單體及其合成性衍生物已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)科學(xué)[7]。齊墩果酸(OA)，在植物系中經(jīng)常出現(xiàn)的三萜系化合物之一，具有多種藥理學(xué)作用，如保肝、抗炎、抗HIV、降血糖及抗氧化作用[8]。近來的研究表明，OA可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，包括肝細(xì)胞癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]、黑色素瘤[11]、骨肉瘤[12]、乳腺癌[13]、結(jié)腸癌[14]與白血病[15]。

然而，作為一種具有潛在抗癌活性的天然產(chǎn)物，其相對較弱的活性、低生物利用度及低效能限制了它的科研進(jìn)展和臨床應(yīng)用。此外，OA及其衍生物抗癌活性的確切機(jī)制仍然不清楚。

在本研究中，我們合成了新的OA衍生物—SZC014，且進(jìn)一步證明SZC014在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-435、MDA-MB-231)中顯示出較OA更強(qiáng)的細(xì)胞生長抑制作用，而這種抗腫瘤活性可能與其誘導(dǎo)凋亡及自噬相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所有的試劑與化學(xué)藥品均經(jīng)正規(guī)商業(yè)來源獲得，且應(yīng)用時沒有進(jìn)一步純化。其中實(shí)驗(yàn)儀器包括：CyFlow Counter流式細(xì)胞術(shù)系統(tǒng)(德國Partec公司)、200kV場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)、SpectraMax M2全波長酶標(biāo)儀(美國美敦力公司)、伯樂bio-rad-蛋白印跡(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司)。corning 6、24、96孔板、離心管(1.5 mL、2 mL、4 mL、10 mL、50 mL)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(貼壁、懸浮)、塑料試管、移液管(美國Corning康寧有限公司)。實(shí)驗(yàn)試劑包括：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶、PBS、pro-caspase 9一抗、pro-caspase 3一抗、cleaved-caspase 9一抗、cleaved-caspase 3一抗、Bax一抗、Bcl-2一抗、Cyto-c一抗、actin一抗、Beclin一抗、ATG 5一抗、二抗。

1.2 藥物合成

1.2.1 3-oxo-OA的合成

3-oxo-OA(3-oxo-olean-12-en-28-oic acid)的合成,OA(2.0 g, 4.4 mmol)溶于100 mL二氯甲烷與丙酮的混合溶劑中(體積比1∶1)，而后冷卻至0℃。將Jones 試劑(2.0 mL)于30 min內(nèi)逐滴加入溶液中，而后攪拌30 min，再加入異丙醇(2 mL)。10 min后，過濾混合液，濾液在低壓中蒸發(fā)，析出固體物，而后將其溶于50 mL的乙酸乙酯中并用飽和鹽水沖洗(50 mL×3)。有機(jī)相以玄明粉干燥并真空收集。制成的粗制品用經(jīng)石油醚/乙基乙酸鹽(體積比20:1)洗脫的硅膠柱色譜法純化以獲得白色固體狀3-oxo-OA(1.97 g, 產(chǎn)出率98.2%)。

1.2.2 SZC014的合成

SZC014[2-(Pyrrolidine -1-yl)methyl-3-oxo-olean- 12-en-28-oic acid]的合成，將吡咯烷鹽酸鹽(1.08 g, 10.0 mmol)、SnCl2(0.38 g,2.0 mmol)與低聚甲醛(0.3 g) 加入含3-oxo-OA(0.91 g, 2.0 mmol)的40 mL乙醇溶液中。將反應(yīng)混合物反流加熱20 h，而后過濾。濾液在低壓下收集并干燥。將得到 的殘余固體物溶解于200 mL的乙酸乙酯中并以飽和鹽水沖洗(50 mL×3)。有機(jī)層以玄明粉干燥并真空收集。制成的粗制品用經(jīng)氯仿/乙醇/水(體積比15∶1∶0.1)洗脫的硅膠柱色譜法純化以獲得白黃色固體化合物SZC014(0.24 g, 產(chǎn)出率22.3%)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-435、MDA-MB-231(日本熊本大學(xué))在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)于添加10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.4 MTT法測定細(xì)胞存活率

為測定細(xì)胞存活率，MCF-7、MDA-MB-435及MDA-MB-231細(xì)胞在37°C條件下，以1×105/孔的密度培養(yǎng)于96孔板中12 h，而后設(shè)置空白對照組(0 μmol/L)及不同濃度的OA及其衍生物組(10,20,40,80 μmol/L)。在37℃下與待測復(fù)合物共培養(yǎng)3、6、12及24 h后，每孔加入15 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。而后將形成的結(jié)晶溶于100 μL的Triple溶液(10%SDS、5%異丁醇及0.01 mol/L HCl)中。應(yīng)用酶標(biāo)儀(Multiskan MK3;Pioneer Co;China)在570 nm處測定吸光度。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，每個治療組的細(xì)胞存活率以相比于對照組的百分率表示。

1.5 PI染色進(jìn)行細(xì)胞周期分析

MCF-7細(xì)胞(60%～70%)同步進(jìn)行過夜血清饑餓處理后用SZC014 (0,10,20,30 μmol/L)在RPMI-1640 完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞用胰蛋白消化，用冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并以1 000 r/min離心5 min。細(xì)胞用70%冷乙醇(1 000 μL)固定，4℃過夜，然后黑暗條件下培養(yǎng)于包含50 μg/mL碘化丙啶 (PI)和20 μg/mL RNase A 的細(xì)胞周期與凋亡分析液中30 min。用流式細(xì)胞儀(BD FACSAria II; BD Co; America)進(jìn)行細(xì)胞周期分析，每個樣本分析10 000次。

1.6 倒置相差顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中并用濃度為20 μmol/L的SZC014處理0、6、12 和 24 h。然后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.7 透射電子顯微鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

經(jīng)SZC014處理的MCF-7細(xì)胞被胰酶消化，洗滌，離心并以2.5%的戊二醛固定，4℃過夜。隨后，細(xì)胞用鋨四氧化物處理30 min進(jìn)行后固定，再用以10%為梯度的50%～100%的乙醇進(jìn)行脫水，嵌入環(huán)氧樹脂812中進(jìn)行樹脂化。然后使用超薄切片機(jī)(LKB-V; JEOL Co; Japan)制作超薄切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行染色，最后使用透射電子顯微鏡(JEM-2000EX; JEOL Co; Japan)進(jìn)行觀察。

1.8 細(xì)胞質(zhì)和核蛋白提取物的準(zhǔn)備

MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同濃度的SZC014處理后，用核-質(zhì)提取物試劑盒提取核碎片和胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理，PBS洗滌并用200 μL緩沖液A(10 mmol/L Hepes 7.5, 10 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L DTT, 1 mmol/L NaF, 1 mmol/L甘油磷酸和1蛋白酶抑制劑)重懸。冰浴20 min后，在懸浮液中加入22 μL緩沖液B(0.15% of Nonidet P-40)。等待1 min，以16 000 r/min離心細(xì)胞5 min后上清液中即為細(xì)胞質(zhì)蛋白提取物。然后，沉淀以100 μL懸浮液C (20 mmol/L Hepes 7.5, 420 mmol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/L DTT, 1mmol/L NaF, 1 mmol/L甘油磷酸和1蛋白酶抑制劑)重。冰浴30 min后，以16 000 r/min離心10 min后上清液即為細(xì)胞核蛋白提取物。

1.9 Western blot檢測

取胞質(zhì)蛋白和核蛋白樣本(30 μg蛋白/樣本)加入到預(yù)制的12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，隨后將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)到PVDF膜上。封閉，并加入一抗4℃孵育過夜，PBS充分洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜顯影，用化學(xué)發(fā)光法檢測標(biāo)本膜上的信號。

1.10 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 SZC014抑制乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-435及MDA-MB-231)生長

為了評估SZC014的抗癌效果，我們選用三種乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、MDA-MB-435及MDA-MB-231)，分別予以不同濃度的SZC014(0,10,20,40,80 μmol/L)，并分別處理0,3,6,12,24 h，MTT比色法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示SZC014時間及劑量依賴地抑制乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-435及MDA-MB-231)的生長(圖1)。SZC014處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-435及MDA-MB-231 24 h后，其IC50分別為24.51,28.85和30.03 μmol/L。作為對照，我們同樣用MTT法檢測OA對于乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-435及MDA-MB-231)的生長抑制作用，結(jié)果顯示MCF-7、MDA-MB-435及MDA-MB-231經(jīng)OA處理24 h，后其IC50分別為120.405,130.065及125.305 μmol/L。結(jié)果表明，SZC014可抑制乳腺癌細(xì)胞生長，且生長抑制作用強(qiáng)于OA(圖1)。

注:對照組與實(shí)驗(yàn)組(n=3)的細(xì)胞存活率以百分率表示。數(shù)值以表示，*P<0.05,**P<0.01。(A)SZC014處理MCF-7、MDA-MB-435及MDA-MB-231 細(xì)胞24 h后測得IC50分別為24.51, 28.85和 30.03 μmol/L；相應(yīng)地，OA處理24 h測得IC50分別為120.405, 130.065及125.305μmol/L。(B)表明SZC014劑量及時間依賴地抑制MCF-7細(xì)胞的生長圖1 SZC014抑制乳腺癌細(xì)胞生長

2.2 SZC014促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡

為了研究細(xì)胞凋亡是否參與SZC014對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用，我們采用20 μmol/L SZC014處理MCF-7細(xì)胞0、6、12和24 h，后使用光學(xué)顯微鏡觀察其細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，SZC014處理過的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變包括變圓、皺縮、變形及漂浮，而空白對照組中則未觀察到上述變化(圖2)。此外，對于20 μmol/L SZC014處理0、6、12和24 h后的，使用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，對空白照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核為圓形并位于細(xì)胞中央，細(xì)胞器形態(tài)正常和且有豐富的微絨毛(圖2)。而經(jīng)SZC014處理過的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則出現(xiàn)了顯著的凋亡改變，比如微絨毛的丟失(圖2)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膨脹，染色質(zhì)的凝集，染色質(zhì)邊緣化等。

2.3 SZC014誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞G2-M期停滯

為了評估SZC014對細(xì)胞周期的影響，我們使用PI單染的流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨SZC014濃度的提高，G0/G1期細(xì)胞的比例出現(xiàn)了顯著的下降(74.68%～43.49%)，G2期細(xì)胞的比例出現(xiàn)顯著的增加(3.84%～20.84%)，而S期細(xì)胞的比例也出現(xiàn)改變(21.48%～35.67%)。與空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞的比例增加了17%，這表明了SZC014可能誘導(dǎo) MCF-7細(xì)胞G2/M期停滯(圖3)。

注:MCF-7細(xì)胞用SZC014(20 μmol/L)處理0,6,12,24 h，并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及超微結(jié)構(gòu)變化;(A)倒置相差顯微鏡顯示，對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;(B)投射電子顯微鏡顯示，對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化圖2 SZC014誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡

注:將細(xì)胞用SZC014(0,10,20,30 μmol/L)處理，用以流式細(xì)胞計數(shù)為基礎(chǔ)的PI法測定細(xì)胞周期分布。細(xì)胞周期分布以相比于對照組的百分率表示。數(shù)據(jù)顯示隨著SZC014濃度的增加，G1期細(xì)胞百分比明顯減少，G2期細(xì)胞百分比顯著增加，而S期細(xì)胞百分比亦升高圖3 SZC014誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞G2-M期阻滯

2.4 SZC014通過線粒體途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡

作為典型的細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志，caspases出現(xiàn)并需要在特定的位點(diǎn)裂解開來以顯示活性。為了檢驗(yàn)caspases是否與SZC014誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)，我們檢測了經(jīng)SZC014處理過的 MCF-7細(xì)胞中caspases蛋白水平。數(shù)據(jù)表明在SZC014處理過的MCF-7細(xì)胞中pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白水平隨時間增長而下降；相對應(yīng)地，cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9蛋白水平隨時間增長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(圖4)。此外，cyto-c蛋白水平隨時間增長先上升后下降，表明SZC014可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中cyto-c的釋放。更進(jìn)一步，我們檢測到SZC014處理的MCF-7細(xì)胞Bcl-2蛋白水平下降，而Bax蛋白水平升高。從而使得Bax/Bcl-2比值出現(xiàn)顯著的增加，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡(圖4)。綜上所述，SZC014可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

注:SZC014(20 μmol/L,處理MCF-7細(xì)胞0,3,6,12 h，提取總蛋白并用Western blot分析相關(guān)蛋白的表達(dá)。以actin蛋白作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)顯示在SZC014處理的MCF-7細(xì)胞中，pro-caspase3、pro-caspase9、Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)降低，而cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、cycto-c和Bax表達(dá)升高圖4 SZC014誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中線粒體途徑 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的改變

2.5 SZC014誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬

考慮到自噬在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生存和死亡信號通路中的重要作用，我們進(jìn)一步探究SZC014是否能引起MCF-7細(xì)胞的自噬反應(yīng)。電子顯微鏡仍是觀察細(xì)胞自噬的最精確的手段之一。我們用透射電子顯微鏡觀察典型的自噬改變，即自噬小體?？瞻讓φ战M細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)依然保持正常，比如細(xì)胞膜、核膜和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保持完整，核仁清晰，胞質(zhì)均勻；而20 μmol/L的 SZC014處理12、24 h后的MCF-7細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯的自噬性改變，即包含細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器的致密體(圖5)。此外，我們還檢測不同濃度SZC014下兩種自噬相關(guān)蛋白，beclin 1和ATG 5的變化。結(jié)果表明SZC014能夠時間依賴地增加beclin 1和ATG 5的表達(dá)(圖5)。所有這些結(jié)果表明自噬可能參與SZC014對MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用。

注:將細(xì)胞用SZC014(20 μmol/L)處理0,12 h，在TEM下觀察典型的自噬改變。并應(yīng)用Western blot提取和分析自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的改變。(A)透射電子顯微鏡顯示，SZC014處理12 h后，MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)典型的自噬改變，即自噬小體。(B)SZC014處理后，beclin 1和ATG 5的表達(dá)升高，表明beclin和ATG 5可能參與了SZC014誘導(dǎo)的自噬圖5 SZC014誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬

3 討論

由于OA水溶性差，那么對于它的結(jié)構(gòu)改造成為了提高其水溶性就一個重要策略。因此，Huang等人[16]通過Jones氧化反應(yīng)，合成了OA的三氧化衍生物(3-oxo-OA)，并且探究其抗癌活性。與OA相比，3-oxo-OA對于在體外培養(yǎng)的不同組織癌細(xì)胞的生長有重要的抑制作用，并對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞有抑制作用的同時，對正常細(xì)胞的毒性較小。另一個改造OA的成功例子是CDDO (2-cyano-3,12-dioxo-olean-1,9-dien- 28-oic acid)[17]，它對于鼠巨噬細(xì)胞中由IFN-γ 誘導(dǎo)所產(chǎn)生的NO有強(qiáng)烈的抑制作用(IC50,0.4 nM)。此外，已經(jīng)證明CDDO甲酯(CDDO-Me)在了人類非小細(xì)胞肺癌中，通過細(xì)胞色素C觸發(fā)的caspase激活通路來誘導(dǎo)凋亡，IC50值從0.1到0.3 mol/L不等[18]。另外有研究指出在蕈樣肉芽腫病(MF)和Sézary綜合癥細(xì)胞系以及自Sézary綜合癥病人新鮮提取的外周血淋巴細(xì)胞中，與空白對照組相比，1～5 mol/L CDDO作用48 h引起劑量依賴性的凋亡[19]。本研究中，為了提高OA的水溶性和抗癌活性，我們合成了新的OA衍生物，SZC014[2-(Pyrrolidine -1-yl) methyl-3-oxo-olean- 12-en-28-oic acid]。

另外，我們證明了SZC014以劑量依賴性的方式抑制三種乳腺癌細(xì)胞的生長，并且其生長抑制作用強(qiáng)于OA，表明了SZC014可能是潛在的抗乳腺癌藥物。SZC014的藥理活性是否比得上其他OA衍生物如CDDO(CDDO-Me)和3-oxo-OA，需要進(jìn)一步證明。流式細(xì)胞術(shù)揭示了SZC014顯著地將MCF-7細(xì)胞阻滯在G2/M期，表明了周期阻滯可能是SZC014抑制MCF-7細(xì)胞生長的機(jī)制之一。目前已知, 細(xì)胞周期停滯可發(fā)生在G1/G0期，S期以及G2/M期3個時相。在細(xì)胞受到 DNA 損傷后, p53的激活常會導(dǎo)致G1/G0期停滯, 而缺乏p53時則多引起G2/M期停滯。本文中SZC014誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞G2/M期周期阻滯，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制，可能與MCF-7細(xì)胞中P53缺乏相關(guān)。

已經(jīng)有報道稱，OA在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，胰腺癌Panc-28細(xì)胞，前列腺癌PC-3細(xì)胞和SH-SY5Y神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20-22]。本研究證明，SZC014可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，在這個過程中，電鏡下觀察到了典型的凋亡特點(diǎn)如染色質(zhì)固縮，核片段化，染色質(zhì)邊緣化等。為了探究SZC014誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，我們用Western blot檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，研究結(jié)果表明SZC014可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

該研究的另一個新穎有趣的發(fā)現(xiàn)是SZC014在MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬。自噬是一種漸進(jìn)的，保守的溶酶體降解過程，在大量的疾病尤其是癌癥中，自噬對于調(diào)節(jié)促存活和促死亡的信號通路中發(fā)揮重要作用。一些關(guān)鍵的自噬介質(zhì)，包括Beclin1，ATGs，mTOR，ROS，已經(jīng)被證明在癌癥細(xì)胞中的復(fù)雜的自噬網(wǎng)中發(fā)揮重要作用[23]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些抗癌藥物的作用下可以發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象，如雷帕霉素，白藜蘆醇和他莫西芬[24-26]，這說明自噬可能是一種潛在的抗癌機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn)20μmol/L的SZC014作用12、24 h后的MCF-7細(xì)胞中，電鏡可觀察到典型的自噬改變，即自噬小體。另外，SZC104時間依賴地增加了Beclin 1和ATG 5的表達(dá)，這說明了Beclin 1和ATG 5可能參與SZC014誘導(dǎo)的自噬。這些結(jié)果都說明了SZC014可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬，它可能是一種潛在的抗癌方式。另外，盡管我們發(fā)現(xiàn)SZC014誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，但兩者的關(guān)系仍不清楚。一些研究表明OA會影響Akt，mTOR，ERK，JNK的磷酸化形式的表達(dá)，它們在凋亡中發(fā)揮重要作用。與此同時，近年來，有大量研究報道稱，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自噬中也發(fā)揮作用。因此，在MCF-7細(xì)胞中，OA可能通過調(diào)節(jié)這些信號通路來誘導(dǎo)凋亡和自噬。特殊信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)和時間上的先后順序則需要進(jìn)一步研究。

綜上，本研究可以總結(jié)如下：我們合成新的OA衍生物SZC014，并證明SZC014抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，比OA的藥理活性更強(qiáng)。SZC014可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞周期停滯在G2/M期。此外，SZC014還誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡及自噬。表明SZC014可能是一種新的、有潛力的抗乳腺癌藥物。