止痛化癥膠囊對(duì)血瘀證模型大鼠的藥效學(xué)研究

吳福林，王涵，董慶海，曹瑩，譚靜，林紅強(qiáng)，李平亞

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021)

婦科血瘀證是以疼痛、腫塊、出血色紫暗或夾有瘀塊等為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，是婦科臨床常見的一種病證[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,婦科血瘀證可由情志內(nèi)傷、寒邪侵襲、環(huán)境改變等多種原因誘發(fā),其病機(jī)實(shí)質(zhì)是瘀阻沖任、胞宮、胞脈,并有不同程度的全身血液運(yùn)行障礙，主要治療的方法為活血化瘀法?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,婦科血瘀證發(fā)生機(jī)理可能主要在于血液流變學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)、病理結(jié)構(gòu)的改變及體內(nèi)免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)的改變等方面[2]。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，氣滯血瘀和寒凝血瘀二種血瘀證類型最為常見[3]。

止痛化癥膠囊(ZhiTong HuaZheng Capsule, ZTHZC)，是由黨參等19味中藥炮制而成。用于氣虛血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、癥瘕，癥見行經(jīng)后錯(cuò)、經(jīng)量少、有血塊、行經(jīng)小腹疼痛、腹有癥塊；慢性盆腔炎見上述證候者[4]。近年來，ZTHZC廣泛用于治療痛經(jīng)、盆腔炎、子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病等婦科疾病[5-8]，臨床效果較好，但其作用機(jī)制還不明確。本研究通過皮下注射腎上腺素結(jié)合冰水浴建立大鼠急性血瘀證模型，探究止痛化癥膠囊對(duì)血瘀模型大鼠血液流變學(xué)、血漿GMP-140及vWF含量的影響，為闡明止痛化癥膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

止痛化癥膠囊,批號(hào)：160502，國藥準(zhǔn)字Z22020845，吉林金寶藥業(yè)股份有限公司；桂枝茯苓膠囊，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10950005，產(chǎn)品批號(hào)：171113；鹽酸腎上腺素注射液，上海禾豐制藥有限公司出品，國藥準(zhǔn)字H31021344,批號(hào)：41170602；大鼠血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)ELISA檢測試劑盒，批號(hào)：E20181201A，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大鼠血管性血友病因子(vWF)ELISA檢測試劑盒，批號(hào)：E20181201A，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FA1104N型萬分之一電子分析天平(上海菁華科技儀器有限公司)；T.G.L-16-aR飛鴿牌離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KES-900B型血流變檢測儀(無錫康爾生儀器公司)；TECAN SUNRISE 酶標(biāo)儀(瑞士帝肯集團(tuán)公司)；DHG-9053A型電熱恒溫干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取Wistar雌性大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，購置于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，質(zhì)量合格證號(hào)：No.SCXK(遼)2015-0001。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

按照大鼠的體質(zhì)量隨機(jī)分成正常對(duì)照組、血瘀模型組、止痛化癥膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組及陽性對(duì)照組共6組，每組8只。止痛化癥膠囊高、中、低劑量分別為1.60 g/kg、0.80 g/kg和0.4 g/kg，陽性對(duì)照組為桂枝茯苓膠囊，劑量為1 g/kg。在室溫(22±2)℃，濕度為40%～60%的飼養(yǎng)室中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，次日上午開始灌胃給藥，灌胃劑量為10 mL/kg，實(shí)驗(yàn)過程中正常對(duì)照組及血瘀模型組給予等量的蒸餾水，各給藥組均給予供試藥液，連續(xù)給藥7 d。

2.2 急性血瘀模型的制備

除對(duì)照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，給藥1 h后，除對(duì)照組大鼠外，其它各組大鼠放置0～2℃冰水中，浸泡游泳4 min，連續(xù)進(jìn)行7 d，并于第7天末次給藥1 h后，給大鼠皮下注射0.1%腎上腺素2次，劑量為0.8 mL/kg ，中間相隔時(shí)間為4 h，在第 1 次大鼠皮下給予鹽酸腎上腺素注射液 0.8 mg/kg，2 h后，將大鼠置于0～2℃冰水中，浸泡游泳4 min，再過2 h后，注射第2次鹽酸腎上腺素注射液，造成大鼠急性血瘀證模型[9]。

2.3 血液流變學(xué)指標(biāo)的測定

給大鼠第2次注射腎上腺素后，將大鼠禁食不禁水12 h，次日，除對(duì)照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛將其麻醉 ，進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈取血。將血液放置在肝素抗凝管中，然后測定大鼠全血黏度和血漿黏度。首先，將放置肝素抗凝管中的血液取出適量，用血流變檢測儀對(duì)全血黏度的低切(10/s)、中切(60/s)及高切(150/s)進(jìn)行測定，然后將余下全血離心10 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，取血漿適量進(jìn)行血漿黏度(140/s)測定。所有的實(shí)驗(yàn)操作在采血后3 h內(nèi)完成。

2.4 血漿GMP-140及vWF含量的測定

給大鼠第2次注射腎上腺素后，將大鼠禁食不禁水12 h，次日，除對(duì)照組大鼠外，其余各組大鼠灌胃給藥，1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛將其麻醉 ，進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈取血，將血液放置在肝素抗凝管中離心10 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/min。吸取上層血漿，分別按照大鼠血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)及大鼠血管性血友病因子(vWF)試劑盒說明書進(jìn)行測定含量。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 止痛化癥膠囊對(duì)血液流變學(xué)的影響

通過對(duì)比模型組與對(duì)照組數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，模型組大鼠全血高、中、低切黏度均明顯增加，血漿黏度明顯增加，數(shù)據(jù)表明，大鼠急性血瘀模型復(fù)制成功。對(duì)照組急性血瘀模型大鼠全血高、中、低切黏度及血漿黏度顯著降低(P<0.05，P<0.01)。止痛化癥膠囊中、高劑量組顯著低于模型組血漿黏度以及全血黏度(P<0.01)，低劑量組明顯降低模型大鼠全血高、中切黏度及血漿黏度(P<0.05)。表明止痛化癥膠囊能夠影響急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)，效果顯著，見表1。

表1 止痛化癥膠囊對(duì)血瘀模型大鼠全血黏度及血漿黏度的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.2 止痛化癥膠囊對(duì)血漿GMP-140及vWF含量的影響

通過比較模型組與對(duì)照組，結(jié)果表明，模型組大鼠血漿GMP-140及vWF含量明顯增加(P<0.01)。與血瘀模型組相比，桂枝茯苓膠囊能夠明顯降低急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF水平(P<0.01)。止痛化癥膠囊低、中、高劑量組均可使急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量明顯減低(P<0.01)。研究表明，止痛化癥膠囊可使急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF水平明顯降低。見表2。

表2 止痛化癥膠囊對(duì)血瘀模型大鼠血漿GMP-140 及vWF含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

4 討論

血瘀證在婦科中是一種常見的疾病,血液循環(huán)受到阻礙，瘀血在體內(nèi)運(yùn)行不暢均對(duì)婦女造成傷害[10]。ZTHZC廣泛運(yùn)用于治療婦科疾病，其丹參素，丹酚酸B等活性成分已被報(bào)道具有抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化及改善血液循環(huán)的作用[11-12]。血液流變學(xué)能夠評(píng)估血液循環(huán)狀態(tài)，可以作為一種檢測指標(biāo)[13]，當(dāng)血液流變學(xué)發(fā)生異常，就會(huì)使人體內(nèi)的血液循環(huán)產(chǎn)生阻礙，就會(huì)發(fā)生血瘀證，誘發(fā)各種疾病。GMP-140是血小板α顆粒膜蛋白，是血小板活化的標(biāo)志性成分。GMP-140可參與血小板與單核巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，能夠反映出體內(nèi)血小板的活化程度和聚集，對(duì)血栓的形成具有監(jiān)督作用[14-15]。血管性血友病因子vWF可以作為內(nèi)皮細(xì)胞受到傷害的標(biāo)志性成分，是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成的糖蛋白。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到損害時(shí)，可參與血小板的相互作用，使血小板發(fā)生聚集、黏附，導(dǎo)致血栓的發(fā)生[16-17]。

本研究首次采用皮下注射腎上腺素結(jié)合冰水浴建立大鼠急性血瘀證模型，通過檢測血液流變學(xué)及GMP-140、vWF試劑盒，探究ZTHZC改善血瘀證的藥效學(xué)研究。結(jié)果表明ZTHZC中、高劑量組能夠降低血瘀模型大鼠全血高、中、低切黏度，也使血漿黏度顯著降低(P<0.01)，低劑量組也能夠降低模型大鼠全血高、中切黏度降低和血漿黏度(P<0.05)，有明顯改善急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)作用。ZTHZC各劑量組均能夠明顯降低急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量(P<0.01)，從而影響血小板相互作用及活化而達(dá)到抗血瘀效果。研究表明，ZTHZC可以顯著改善血液流變學(xué)的相應(yīng)指標(biāo)，具有改善血瘀證的藥效作用，下一步將從ZTHZC改善血瘀的代謝組學(xué)進(jìn)行分析，明確相關(guān)代謝通路，為闡明ZTHZC的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。