LncRNA PLUTO促進(jìn)胰島素轉(zhuǎn)錄和分泌的作用及機(jī)制研究

張方方，劉 悅，金 亮

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京210009）

糖尿病是世界上最常見的代謝疾病之一。肥胖是2型糖尿病的重要致病因素，但肥胖誘發(fā)2型糖尿病的確切機(jī)制尚未完全闡明［1-2］。肥胖能降低靶組織（肝臟、脂肪、肌肉）對(duì)胰島素的敏感性，產(chǎn)生胰島素抵抗，削減胰島β細(xì)胞的功能［3-4］。而胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷是2型糖尿病的兩個(gè)主要發(fā)病機(jī)制。人類2型糖尿病易感基因的全基因組數(shù)據(jù)顯示，非編碼RNA對(duì)2型糖尿病的發(fā)生具有重要的作用［5-6］，非編碼 RNA（noncoding RNA ncRNA）是一大類不具有蛋白編碼潛能的RNA轉(zhuǎn)錄本［7］，主要包含短鏈非編碼 RNA（microRNA，miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）［8］。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 bp，序列保守性低的RNA，但其在基因組中的定位和功能具有較高的保守性［9］。lncRNA雖然不編碼蛋白，但能與特定蛋白結(jié)合改變?cè)摰鞍椎陌|(zhì)定位，同時(shí)lncRNA可以作為miRNA及piRNA的前體小分子，分別從轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平參與蛋白質(zhì)編碼基因的調(diào)控，目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA的異常表達(dá)可導(dǎo)致多種人類疾病的發(fā)生，比如皮膚?。?0］、冠狀動(dòng)脈疾病［11］及糖尿?。?2-14］。

目前在人類和小鼠胰島β細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)上千種lncRNA［15-17］；Arnes等［18］和 You等［19］通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)lncRNA-Meg3可抑制胰島素合成和分泌；Kallen等［20］研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19直接與let-7結(jié)合導(dǎo)致胰島β細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。以上結(jié)果均提示lncRNA能夠參與胰島β細(xì)胞的功能調(diào)控。近年來(lái)對(duì)lncRNA的研究已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，但與胰島β細(xì)胞相關(guān)的lncRNA研究機(jī)制尚不夠深入。探索在胰島β細(xì)胞中扮演重要角色的新lncRNA，揭示并完善其調(diào)控胰島β細(xì)胞數(shù)量及功能的重要機(jī)制，是糖尿病研究領(lǐng)域中亟待解決的重要科學(xué)問題。

為尋找肥胖模型小鼠胰島細(xì)胞差異表達(dá)的lncRNA，探索肥胖誘發(fā)2型糖尿病的分子機(jī)制，本課題組對(duì)轉(zhuǎn)基因肥胖模型小鼠（ob／ob、db／db）及高脂飲食小鼠的胰島進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與正常小鼠胰島細(xì)胞相比，肥胖小鼠胰島細(xì)胞中低表達(dá)lncRNA PLUTO。利用RT-qPCR對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明lncRNA PLUTO的表達(dá)模式與測(cè)序結(jié)果一致；最后在胰島原代細(xì)胞和Min6細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲降PLUTO，探討了PLUTO促進(jìn)胰島β細(xì)胞合成和分泌胰島素的功能及作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 細(xì)胞和試劑

胰島β細(xì)胞系Min6細(xì)胞購(gòu)自上海生命科學(xué)院細(xì)胞所。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），LipofectamineTM2000、Trizol試劑、RIPA裂解溶液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、胰蛋白酶（上海碧云天生物公司）；兔抗鼠Pdx1多克隆抗體，GAPDH單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；PLUTO Smart Silencer（廣州銳博生物科技公司），All-in-one逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR試劑盒（美國(guó)Abm公司）。

1.2 動(dòng) 物

8周齡C57BL／6J小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0014。高脂模型組（HFD）小鼠飼喂高脂飼料（D12494，60%脂肪），正常對(duì)照組（NCD）小鼠飼喂普通維持飼料（D12450J，10%脂肪），持續(xù)喂養(yǎng)12周，高脂飲食小鼠體重為40～45 g，正常飲食小鼠體重為23～25 g。8周齡db／db及ob／ob小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，許可證號(hào)分別為：SCXK（蘇）2016-0021，SCXK（蘇）2016-0001。所有小鼠保持在恒定濕度和溫度的清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。室內(nèi)燈光每隔12h保持開啟或關(guān)閉，模擬晝夜變化以維持動(dòng)物正常生物節(jié)律。

1.3 儀 器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Roche公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；顯微圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）；Western blot電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 胰島β細(xì)胞系-Min6細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 完全培養(yǎng)基 高糖DMED含有15%胎牛血清，50μmol／Lβ-巰基已醇，1%青霉素-鏈霉素。

2.1.2 Min6細(xì)胞復(fù)蘇 將水浴鍋升溫至37℃，將Min6細(xì)胞從液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋溶解，然后加入新鮮的完全培養(yǎng)基1 mL，2 300 r／min離心5 min然后棄上清液，加入完全培養(yǎng)基4 mL重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后換液。

2.1.3 Min6細(xì)胞傳代培 顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中的Min6細(xì)胞融合率達(dá)到75%以上即可傳代；棄去全部培養(yǎng)基并加入0.1 mmol／L PBS洗滌兩次，加入胰酶1 mL 37℃消化5 min，加入新鮮的完全培養(yǎng)基1 mL終止消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管于2 300 r／min離心5 min，棄上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)基2 mL重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至兩個(gè)培養(yǎng)瓶于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后換液。

2.2 胰島提取

分別取 HFD、NCD、db／db、ob／ob小鼠，脫頸椎處死小鼠，置于體視顯微鏡下，用膠帶固定，于劍突下作橫向切口，開口盡量大，暴露肝臟、胃、十二指腸和脾臟。從十二指腸腸管進(jìn)針，再?gòu)哪c內(nèi)壁刺入十二指腸大乳頭，并輕輕插入胰總管約0.8～1 cm，保持針頭平直，扎緊胰總管的結(jié)扎線，將針頭連同胰管一同扎緊，防止倒流。此時(shí)胰腺應(yīng)逐漸膨脹，胰尾開始充盈。注射完畢后，從胰尾開始輕輕分離胰腺包膜。于37℃，1 400 r／min消化28 min，至均勻細(xì)沙狀（顆粒直徑小于1 cm3）終止消化。加入含10%胎牛血清HBSS液5 mL終止消化。用HBSS緩沖液洗滌2遍，用適量HBSS緩沖液重懸胰島后在顯微鏡下進(jìn)行精細(xì)挑取，獲得純凈的胰島細(xì)胞。

2.3 糖脂刺激Min6細(xì)胞及胰島原代細(xì)胞

80個(gè)胰島原代細(xì)胞、Min6細(xì)胞（1×107個(gè)）接種于12孔板，分別用0.5 mmol／L棕櫚酸（palmitate）、2.5 mmol／L及25 mmol／L葡萄糖刺激，并于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

2.4 核質(zhì)分離

（1）用細(xì)胞刮刀刮取 Min6細(xì)胞，2 300 r／min離心5 min，棄上清液，保留沉淀，加入預(yù)冷的細(xì)胞分餾緩沖液（PARISTMKit，life）400μL，冰浴5 min，2 300 r／min離心5 min，收集上清液，得到細(xì)胞質(zhì)RNA。

（2）細(xì)胞沉淀加入預(yù)冷的細(xì)胞破碎緩沖液400μL，4℃離心10 min，獲得細(xì)胞核RNA。

2.5 RNA的提取和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

用Trizol法提取各胰島原代細(xì)胞和Min6細(xì)胞的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，然后檢測(cè)其中PLUTO的mRNA表達(dá)水平，RT-qPCR反應(yīng)數(shù)據(jù)以循環(huán)閾值（Ct）記錄，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照（PLUTO和GAPDH引物序列見表1）。

2.6 質(zhì)粒構(gòu)建和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

PLUTO全長(zhǎng)1 444 bp，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體時(shí)，使用PCR將PLUTO片段克隆，利用pcDNA3.1（+）真核生物表達(dá)質(zhì)粒，并選擇XhoⅠ和BamHⅠ作為雙酶切位點(diǎn)（PCR引物見表2），構(gòu)建成功的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒命名over-PLUTO；敲除載體使用廣州銳博公司設(shè)計(jì)的 lncRNA Smart Sliencer，用 ddH2O溶解siNC和si-PLUTO干粉至終濃度為20μmol／L。根據(jù)LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染結(jié)束后更換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Table 1 Primers used for RT-qPCR of PLUTO and GAPDH genes

Table 2 Primers used for PCR of PLUTO

2.7 葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)（GSIS）

胰島原代細(xì)胞和Min6細(xì)胞轉(zhuǎn)染over-PLUTO或si-PLUTO 48 h后，棄培養(yǎng)基，用洗滌液（2%血清，2.5 mmol／L葡萄糖的 KRBH緩沖液）300μL洗滌3次，加入饑餓液（10%血清，2.5 mmol／L葡萄糖的KREB緩沖液）200μL饑餓12 h，12 h后棄上清液并洗滌3次，分別用2.5 mmol／L葡萄糖，25 mmol／L葡萄糖工作液誘導(dǎo)2 h；誘導(dǎo)結(jié)束后收集全部工作液，1 200 r／min離心5 min并收集上清液，用小鼠胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中胰島素的分泌量，同時(shí)用胰酶將細(xì)胞全部消化后用BCA試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。以每孔胰島素含量（μIU）／細(xì)胞總蛋白量（mg）進(jìn)行計(jì)算，作為胰島素分泌能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 PLUTO在肥胖小鼠胰島β細(xì)胞中低表達(dá)

基于課題組前期高通量測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)lncRNA-PLUTO在肥胖胰島β細(xì)胞中降低2倍，為了驗(yàn)證該測(cè)序結(jié)果，利用酶法分離db／db，ob／ob和HFD 3種肥胖模型小鼠的胰島細(xì)胞，通過(guò)RT-qPCR分析PLUTO的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與同窩出生的db／-小鼠比較，PLUTO在 db／db小鼠中降低 50%（圖1-A），與同窩出生的野生型小鼠比較，在ob／ob小鼠胰島細(xì)胞中降低60%（圖1-B），與NCD小鼠胰島細(xì)胞相比，在HFD小鼠中PLUTO的表達(dá)量下降70%（圖1-C）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)PLUTO在胰島細(xì)胞特異性高表達(dá)（圖1-D）。以上結(jié)果顯示PLUTO在不同肥胖模型小鼠的胰島細(xì)胞中顯著降低，但在正常小鼠（C57BL／6J）的胰島組織中特異性高表達(dá)，提示PLUTO可能參與胰島β細(xì)胞功能的調(diào)控作用。

Figure 1 Expression levels of PLUTO in the islet of db／db mice（A），ob／ob mice（B），HFD mice（C）and None islet fraction of C57BL／6Jmice（D）by RT-qPCR analysis（±s，n=3）**P＜0.005，***P＜0.001

3.2 糖脂毒性誘導(dǎo)PLUTO表達(dá)量降低

為了探索肥胖誘導(dǎo)PLUTO降低的原因，本研究分別用 0.5 mmol／L棕櫚酸、2.5 mmol／L和 25 mmol／L葡萄糖刺激胰島原代細(xì)胞及Min6細(xì)胞48 h。48 h后提取細(xì)胞RNA經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)PLUTO的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2-A和2-B所示，在胰島原代細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)0.5 mmol／L棕櫚酸刺激后PLUTO的表達(dá)量降低 60%，經(jīng)高糖（25 mmol／L）刺激后PLUTO的表達(dá)量降低50%；在Min6細(xì)胞中也觀察到相同的變化趨勢(shì)（圖2-C，2-D）。

Figure2 Primary isletswere incubated with 0.5mmol／L palmitae（A）and glucose（2.5 and 25 mmol／L，B），The expression levelsof PLUTOwere determined by RT-qPCR.Min6 cellswere incubated with 0.5 mol／L palmitae（C）and glucose（2.5 and 25 mmol／L，D），The expression levels of PLUTO weremeasured by RT-qPCR（±s，n=3）**P＜0.005，***P＜0.001

3.3 PLUTO的特征研究

為了研究PLUTO調(diào)控胰島β細(xì)胞功能的作用及機(jī)制，首先通過(guò)網(wǎng)站UCSC查詢PLUTO的亞型，保守性、蛋白編碼能力等。發(fā)現(xiàn)在人源PLUTO只有1個(gè)亞型，而鼠源PLUTO共有3個(gè)亞型，且人源和鼠源PLUTO序列同源性高（圖3-A），其中pancreatic and duodenal homeobox factor 1（Pdx1）是PLUTO的相鄰基因（圖3-B），經(jīng)蛋白編碼能力網(wǎng)站CPAT預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)PLUTO的蛋白編碼能力為0（圖3-C），以上結(jié)果證明PLUTO符合 lncRNA的所有特征，說(shuō)明PLUTO是一條長(zhǎng)度大于200 bp，且不具有蛋白編碼能力的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。

LncRNA在細(xì)胞中的定位具有多樣性，而lncRNA在靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的功能與其在細(xì)胞中的定位密切相關(guān)。為了研究PLUTO在Min6細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，本研究利用核質(zhì)分離試劑盒將Min6細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行分離，分別對(duì)PLUTO在細(xì)胞不同組分中的豐度進(jìn)行了測(cè)定。U6為細(xì)胞核的陽(yáng)性對(duì)照，GAPDH為細(xì)胞質(zhì)的陽(yáng)性對(duì)照，RT-qPCR發(fā)現(xiàn)PLUTO主要定位于Min6細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)（圖3-D）。

Figure 3 （A）PLUTO is located in a large syntenic block on human chromosome13 andmouse chromosome5，there is only one isoform in human but 3 isoforms in mouse；（B）UCSC Genome Browser scheme of the human PLUTO and mouse PLUTO variants；（C）CPAT predicted the ability of PLUTO-encoded proteins；（D）PLUTO is enriched in the Min6 cells nuclear fraction.Levels of PLUTO，GAPDH，and U6 RNA in purified Min6 cells nuclear and cytoplasm fractions were detected by RT-qPCR

3.4 PLUTO促進(jìn)胰島素轉(zhuǎn)錄和生物合成

為了研究PLUTO是否能調(diào)控胰島β細(xì)胞功能，首先在胰島原代細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲降PLUTO。利用酶法分離C57BL／6J小鼠的胰島細(xì)胞，通過(guò)lipo2000轉(zhuǎn)染 over-PLUTO和 si-PLUTO，轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)在胰島原代細(xì)胞中PLUTO的表達(dá)量上升300倍（圖4-A），當(dāng)敲降PLUTO時(shí)，敲降效率為90%（圖4-A）。RT-qPCR檢測(cè)胰島素基因（Ins1和Ins2）發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PLUTO能夠促進(jìn)胰島素基因上調(diào)，敲降PLUTO時(shí)，胰島素基因表達(dá)降低（圖4-B，4-C）；用酸乙醇抽提液（74%無(wú)水乙醇、14%濃鹽酸、12%ddH2O）溶解細(xì)胞內(nèi)的胰島素，采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素的含量，結(jié)果如圖4-D所示，過(guò)表達(dá)PLUTO后，細(xì)胞內(nèi)的胰島素含量升高3倍，而敲降PLUTO時(shí)，胰島素含量降低50%。

為進(jìn)一步研究PLUTO調(diào)控胰島β細(xì)胞的功能，接下來(lái)利用具有胰島素分泌能力的β細(xì)胞系Min6細(xì)胞進(jìn)行功能考察。經(jīng)RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)在Min6細(xì)胞過(guò)表達(dá)PLUTO，細(xì)胞中PLUTO的表達(dá)量上升350倍，當(dāng)敲降PLUTO時(shí)，敲除效率為80%（圖4-E）。RT-qPCR檢測(cè)胰島素基因（Ins1和Ins2），過(guò)表達(dá)PLUTO促進(jìn)胰島素基因表達(dá)（圖4-F），敲降PLUTO時(shí)，胰島素基因表達(dá)降低（圖4-G）；ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素的含量，結(jié)果如圖4-H所示，過(guò)表達(dá)PLUTO，細(xì)胞內(nèi)的胰島素含量升高1.5倍，而敲降PLUTO時(shí)，胰島素含量降低50%。以上結(jié)果表明PLUTO促進(jìn)胰島β細(xì)胞合成胰島素。

Figure 4 Effect of overexpression or knockdown of PLUTO in primary islets and Min6 cells.Over-PLUTO or si-PLUTO was transfected into primary islets and Min6 cells for 48 h.（A）The transfected efficiencies of PLUTOwere analyzed by RT-qPCR.（B-C）RT-qPCR was carried out to determine the expression levels of Ins1 and Ins2 in primary islets.Insulin contentwas then tested by ELISA in primary islets（D）.（E）The transfected efficiencies of PLUTO were analyzed by RT-qPCR，（F-G）RT-qPCR was carried out to determine the expression levels of Ins1 and Ins2 in Min6 cells，and insulin contentwas analyzed by ELISA in Min6 cells（H）（±s，n=3）*P＜0.05；**P＜0.01，***P＜0.001

3.5 PLUTO促進(jìn)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌

為研究PLUTO是否能調(diào)控胰島素分泌，首先利用酶法分離胰島原代細(xì)胞（30 islet／孔），在含有100μL 10%FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)平衡12 h，隨后在胰島細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲降PLUTO，轉(zhuǎn)染48 h后，用饑餓液（含2.5 mmol／L葡萄糖的HBSS緩沖液）饑餓培養(yǎng)6 h后，分別用2.5 mmol／L和16.7 mmol／L的葡萄糖刺激2 h，收集細(xì)胞上清液，用小鼠胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中胰島素的含量，圖5-A顯示，在高糖或低糖刺激條件下，過(guò)表達(dá)PLUTO均能促進(jìn)胰島原代細(xì)胞的胰島素分泌，而敲降PLUTO后胰島原代細(xì)胞胰島素分泌能力被抑制。

同時(shí)將Min6細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)的密度接種于48孔板，將over-PLUTO或si-PLUTO轉(zhuǎn)染Min6細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行GSIS實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5-B所示，與對(duì)照組相比，在低糖及高糖刺激下，過(guò)表達(dá)PLUTO能顯著促進(jìn)Min6細(xì)胞胰島素分泌，敲降PLUTO能顯著抑制Min6細(xì)胞胰島素分泌。以上結(jié)果均表明PLUTO促進(jìn)胰島素分泌。

3.6 PLUTO靶向Pdx1促進(jìn)胰島β細(xì)胞功能

LncRNA一般通過(guò)調(diào)控相鄰基因發(fā)揮功能，對(duì)PLUTO的特征分析發(fā)現(xiàn)Pdx1是其相鄰基因，如圖6-A和6-B所示，在胰島原代細(xì)胞和Min6細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)PLUTO時(shí)，Pdx1的mRNA和蛋白表達(dá)量增加，敲降PLUTO時(shí)，Pdx1的mRNA和蛋白表達(dá)量降低。說(shuō)明PLUTO可以調(diào)控Pdx1的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

為研究PLUTO通過(guò)靶向Pdx1調(diào)控胰島β細(xì)胞功能，本研究通過(guò)開展功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在Min6細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-PLUTO和Pdx1過(guò)表達(dá)載體，結(jié)果如圖6-C和6-D顯示Pdx1可逆轉(zhuǎn)si-PLUTO降低的胰島素合成和分泌能力。以上結(jié)果表明PLUTO是通過(guò)靶向Pdx1促進(jìn)胰島素合成及分泌。

Figure 5 PLUTO regulates insulin secretion in islets.Over-PLUTO or si-PLUTO was transfected into primary islets and Min6 cells for 48 h.Insulin secretion was analyzed by GSIS assay in islets（A）and in Min6 cells（B）（±s，n=3）*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

Figure6 PLUTO regulates insulin secretion via Pdx1.Over-PLUTO or si-PLUTO was transfected into primary islets and Min6 cells for 48 h.RT-qPCR and Western blotwere performed to detect the expression levels of Pdx1，in primary islets（A）and Min6 cells（B）.Co-transfected si-PLUTO and Pdx1 in Min6 cells for 48 h，insulin content（C）and insulin secretion（D）were analyzed by ELISA（±s，n=3）*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

4 討 論

LncRNA的作用機(jī)制包括：（1）作為信號(hào)分子調(diào)控其他基因的表達(dá)；（2）作為誘餌分子招募RNA結(jié)合蛋白，共同實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控；（3）作為引導(dǎo)分子引導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白復(fù)合體定位到調(diào)控位點(diǎn)，調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)；（4）作為支架分子招募多種染色質(zhì)修飾復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的沉默作用，動(dòng)態(tài)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性［21-23］。LncRNA定位于細(xì)胞核或胞漿，在真核細(xì)胞內(nèi)被普遍轉(zhuǎn)錄，但不具有蛋白編碼功能［24-25］。與編碼蛋白質(zhì)的mRNA相比，lncRNA的表達(dá)豐度一般較低，但卻具有更強(qiáng)的組織和細(xì)胞表達(dá)特異性。LncRNA具有不同的亞細(xì)胞定位［26］，并在不同的細(xì)胞定位中起不同的作用，其中細(xì)胞核定位表現(xiàn)更為顯著。本研究基于課題組前期高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠胰島細(xì)胞中低表達(dá)的lncRNA-PLUTO，利用RT-qPCR對(duì)測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果一致。

在肥胖相關(guān)的2型糖尿病發(fā)展過(guò)程中，β細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于糖脂毒性環(huán)境［27］。因此，本文模擬機(jī)體肥胖的病理?xiàng)l件，用高濃度的游離脂肪酸（棕櫚酸）及高葡萄糖刺激胰島原代細(xì)胞和Min6細(xì)胞，分析PLUTO表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，PLUTO表達(dá)水平因棕櫚酸和葡萄糖濃度升高而降低。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有助于闡明肥胖誘導(dǎo)PLUTO低表達(dá)的原因。

LncRNA的相鄰基因?qū)ncRNA的功能調(diào)控發(fā)揮主要作用［28］，通過(guò)對(duì)PLUTO的結(jié)構(gòu)特征研究，發(fā)現(xiàn)相鄰基因?yàn)镻dx1［29］。Pdx1可結(jié)合胰島素基因上游核心啟動(dòng)區(qū)微增強(qiáng)子的A3／A4元件，被認(rèn)為是胰島素基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［30］。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明過(guò)表達(dá)PLUTO促進(jìn)Pdx1轉(zhuǎn)錄及翻譯；同時(shí)功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)也證明Pdx1可逆轉(zhuǎn)PLUTO低表達(dá)時(shí)胰島素合成和分泌能力的降低，與文獻(xiàn)研究中Pdx1的功能作用相符合。表明PLUTO是通過(guò)上調(diào)相鄰基因Pdx1的轉(zhuǎn)錄和翻譯實(shí)現(xiàn)促進(jìn)胰島素合成及分泌的作用。

雖然非編碼RNA的研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，但隨著研究的深入有望解決非編碼RNA成藥的局限性問題，本研究結(jié)果有望為臨床檢測(cè)和診斷2型糖尿病提供新的生物標(biāo)志物。另一方面通過(guò)干預(yù)體內(nèi)PLUTO的表達(dá)水平，達(dá)到抑制肥胖，改善2型糖尿病胰島素抵抗的目的。