3-甲基腺嘌呤通過抑制自噬促進(jìn)小鼠毛囊再生的作用研究

李 婧，羅福玲，吳盛旺，萬敬員，趙恒光

（1重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶400016；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶400016；3重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶400016；4重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，重慶400016）

脫發(fā)是臨床常見病，發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響患者容貌和生活質(zhì)量。臨床上休止期脫發(fā)的產(chǎn)生，與毛囊休止期的過度延長有關(guān)［1］，因此，尋找一種可以促進(jìn)毛囊由休止期向生長轉(zhuǎn)化的藥物，是休止期脫發(fā)疾病研究的重要方向之一。

自噬是機(jī)體吞噬衰老細(xì)胞器或大分子物質(zhì)的一個降解過程，這些物質(zhì)通過自噬過程在溶酶體中降解為氨基酸、脂肪酸以及核苷酸并可被重復(fù)利用，在維持細(xì)胞自身的物質(zhì)平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬紊亂會導(dǎo)致多種疾病，包括脫發(fā)，而維持適當(dāng)穩(wěn)定的自噬水平則有助于促進(jìn)毛發(fā)再生［3-5］。

拔毛法是目前普遍采用的一種生長期誘導(dǎo)模型，拔毛可誘導(dǎo)功能正常的毛囊快速轉(zhuǎn)化進(jìn)入生長期，并重新長出新發(fā)［6］。

為進(jìn)一步研究自噬在毛發(fā)生長中的作用及機(jī)制，本研究采用3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）作為自噬通路抑制劑［7］，用拔毛法構(gòu)建毛囊再生的模型，以3～4周齡毛囊處于休止期的C57BL／6小鼠作為拔毛后的毛發(fā)再生模型，并以空白處理組和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）組為陰性對照，觀察自噬通路在小鼠毛發(fā)再生中的作用，并進(jìn)一步探討3-MA通過抑制自噬在哺乳動物毛發(fā)再生中的重要意義，為臨床進(jìn)一步研究毛發(fā)疾病的治療手段提供理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

蘇木精、伊紅（美國Amresco公司）；免疫組化試劑盒、DAB濃縮試劑（武漢中杉金橋公司）；P62抗體、Beclin1抗體（美國CST公司，兔抗）；Western blot用兔抗 LC3B抗體（美國 Sigma公司）；鼠抗Ki67抗體（美國 GeneTex公司）；FITC-CD34、PECD49f（美國 BD公司）；鼠抗 β-actin抗體、HRP標(biāo)記二抗山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗鼠、免疫組化用兔抗LC3B抗體（武漢博士德公司）；3-甲基腺嘌呤（3-MA）、雷帕霉素（RAPA）（美國 Selleck公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Coolpix相機(jī)、DS-Fil熒光顯微鏡（日本 Nikon公司）；蛋白質(zhì)凝膠電泳儀、ChemiDocXRSTM凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 實(shí)驗動物

健康雄性3～4周齡 C57BL／6小鼠21只，體重（8±1）g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心（合格證號0004285），飼養(yǎng)于（23±2℃，12 h明暗交替）獨(dú)立通氣籠盒SPF系統(tǒng)。所有動物均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 動物分組及處理

所有鼠隨機(jī)分為3組（n=7），1%戊巴比妥麻醉后，用低熔點(diǎn)石蠟融化后均勻涂抹于小鼠背部，凝固變硬后拔除背部毛發(fā)。3-MA組腹腔注射給予3-MA 2 mg／（kg·d）；RAPA組腹腔注射給予 RAPA 1 mg／（kg·d），空白組（Vehicle組）拔毛后不予任何處理；拍照記錄小鼠拔毛區(qū)毛發(fā)生長的動態(tài)變化。14 d后脫頸處死，取拔毛區(qū)全層皮膚組織備用。

2.2 HE染色檢測毛囊形態(tài)學(xué)改變

石蠟切片脫蠟水化，蘇木精1～5 min并返藍(lán)，伊紅30 s～3 min，雙蒸水徹底清洗，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡采集圖像并分析數(shù)據(jù)。

2.3 Western blot印記法檢測皮膚中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

組織液氮研磨后，細(xì)胞裂解液提取總蛋白并測定含量，SDS-PAGE電泳，80 V電壓跑濃縮膠，100 V電壓跑分離膠，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%BSA（溶于TBST）室溫振蕩封閉 1 h。鼠抗 β-actin、兔抗LC3B、兔抗 P62、兔抗 Beclin1一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗（HRP羊抗鼠、羊抗兔1∶3 000）室溫振蕩孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像儀采圖，Image Lab5.0軟件分析灰度值。

2.4 免疫組化檢測毛囊中P62、ki67的表達(dá)

采用免疫組化SP法。石蠟切片脫蠟水化，檸檬酸修復(fù)液（pH 6.0）微波抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、山羊血清均室溫封閉30 min，兔抗兔抗P62、鼠抗Ki67一抗（1∶200）4℃孵育過夜，二抗山羊抗兔、山羊抗鼠室溫孵育30 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素室溫孵育30 min，DAB（1∶20）顯色，TBS徹底清洗，蘇木精染核返藍(lán)，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡采集圖像并分析數(shù)據(jù)。

2.5 免疫熒光檢測毛囊中CD34、CD49f的表達(dá)

冰凍切片復(fù)溫，5%BSA封閉，F(xiàn)ITC-CD34、PECD49f（1∶50）37℃孵育 1 h，DAPI（2μg／mL）室溫30 min，封片，熒光顯微鏡下采集圖像并分析數(shù)據(jù)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 3-MA對小鼠背部毛發(fā)生長的影響

3～4周齡 C57BL／6小鼠毛囊處于休止期［6］，在脫毛后即時觀察背部皮膚顏色呈粉紅色，拔毛后，拔發(fā)部位的皮膚顏色開始逐漸變灰、轉(zhuǎn)黑，預(yù)示毛囊開始轉(zhuǎn)入生長期［6］。在拔毛后第 2、5、7、9及14天，記錄小鼠拔毛部位的皮膚顏色變化及毛發(fā)生長，結(jié)果如圖1所示，3-MA組鼠無論皮膚顏色變化還是毛發(fā)生長均明顯快于Vehicle組和RAPA組，而RAPA處理小鼠的背部顏色變化及毛發(fā)生長明顯慢于3-MA組，甚至明顯慢于Vehicle組。在第9天時，3-MA組鼠背部已有明顯新毛發(fā)生長，Vehicle組鼠背雖為灰色但無毛發(fā)生長，而RAPA組鼠背仍為粉色，提示毛囊仍處于休止期。至第14天時，3-MA組和Vehicle組毛發(fā)生長已基本正常，RAPA組雖有毛發(fā)生長，但毛發(fā)數(shù)量和質(zhì)量均明顯較對照組差。

3.2 3-MA對鼠毛囊再生影響的形態(tài)學(xué)觀察

第14天時，取鼠背部毛發(fā)再生部位的皮膚全層行HE染色顯示，發(fā)現(xiàn)3-MA組鼠的毛囊生長明顯優(yōu)于 Vehicle組和 RAPA組（圖2-A），表現(xiàn)為：（1）新生毛囊的數(shù)量與密度均明顯多于Vehicle組和RAPA組。每中倍鏡視野（×100）下，3-MA組的毛囊單位計數(shù)顯著增加，與Vehicle組和RAPA組的比較分別為（8.67±1.52）vs（4.67±0.33）和（8.67±1.52）vs（3.33±0.33），P均小于 0.05（圖2-B）。（2）形態(tài)學(xué)上，3-MA組的新生毛囊處于生長期，表現(xiàn)為毛囊長度更長，毛乳頭體積更大，下端深達(dá)脂肪層下部，并接近肌肉深筋膜層淺面；Vehicle組毛乳頭體積偏小，毛乳頭下端多數(shù)僅位于真皮層中下部及脂肪淺層；而RAPA組甚至比Vehicle組毛乳頭更小，毛乳頭下端僅位于真皮層中上部。

3.3 3-MA對小鼠皮膚中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure1 Effect of3-methyladenine（3-MA）on dorsal hair regrowth in C57BL／6 mice

為檢測3-MA處理后對C57BL／6鼠再生毛囊中自噬通路的影響，本研究利用Western blot法測定小鼠拔毛部位皮膚中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響。結(jié)果如圖3所示，與Vehicle組相比，3-MA組的Beclin1表達(dá)、LC3BⅡ／Ⅰ比值均顯著降低［分別為（2.72±0.179）vs（4.25±0.084）和（0.28±0.029）vs（0.43±0.069），P均＜0.05］，總LC3B升高［（16.13±0.213）vs（7.98±0.263）］，P62的表達(dá)則明顯升高［（1.25±0.103）vs（0.82±0.013），P＜0.05］。而RAPA組的Beclin1表達(dá)、LC3BⅡ／Ⅰ比值顯著較Vehicle組升高［分別為（4.86±0.0.067）vs（4.25±0.084）、（0.81±0.032）vs（0.43±0.069），P均 ＜0.05］，總 LC3B升高［（16.95±0.541）vs（7.98±0.263）］，P62的表達(dá)則明顯較 Vehicle組降低［（0.66±0.029）vs（0.82±0.013），P＜0.05］。

Figure2 （A）Effect of 3-MA on hair follicle regeneration by HE staining（×100）and（B）the quantitative result（±s，n=4）RAPA：Rapamycin.*P＜0.05 vs vehicle group；＃P＜0.05 vs3-MA group

Figure 3 （A）Effect of 3-MA on expressions of Beclin1，P62，LC3BII／Ⅰand LC3B in dorsal skin by Western blot and（B E）the quantitative result（xˉ±s，n=3）*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle group

但由于以上結(jié)果中，Western blot方法檢測的只是小鼠拔毛部位皮膚全層的蛋白變化，為進(jìn)一步明確該變化是否發(fā)生于再生的毛囊結(jié)構(gòu)中，本研究采用免疫組化染色特異性標(biāo)記再生的毛囊結(jié)構(gòu)中的以上蛋白，證實(shí)變化結(jié)果同上，即在3-MA處理后，在特定的毛囊結(jié)構(gòu)中，LC3B總量明顯升高（3-MA主要通過抑制胞漿型LC3BⅠ型向膜型LC3BⅡ型的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致LC3BⅠ型堆積［8］，LC3B總量增加），P62表達(dá)升高；而在RAPA處理后，LC3B總量升高的同時（RAPA誘導(dǎo)LC3BⅠ型向LC3BⅡ型的轉(zhuǎn)化，LC3BⅡ型表達(dá)增強(qiáng)），P62表達(dá)明顯降低（圖4），表明上述的經(jīng)Western blot檢測的自噬變化結(jié)果同樣發(fā)生于毛囊局部結(jié)構(gòu)中。

3.4 3-MA對新生毛囊上皮細(xì)胞中Ki67表達(dá)的影響

為進(jìn)一步明確3-MA導(dǎo)致的自噬變化對毛囊上皮細(xì)胞增殖分化的影響，本研究采用免疫組化染色檢測毛囊上皮細(xì)胞中細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示。3-MA處理后毛囊上皮細(xì)胞在自噬通路發(fā)生明顯抑制的同時，Ki67的表達(dá)明顯增加，表明細(xì)胞的增殖分裂能力明顯加強(qiáng)；而經(jīng)RAPA處理后的結(jié)果卻恰好相反。

Figure 4 Effect of3-MA on expressions of P62 and LC3B in hair follicle cells by immunohistochemistry（×400）（±s，n=3）*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle group

Figure 5 Effect of3-MA on expressions of Ki67 in hair follicle cells by IHC（×200）（±s，n=3）*P＜0.05，**P＜0.001 vs vehicle group

3.5 3-MA對小鼠毛囊中CD34、CD49f表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探討3-MA對鼠毛發(fā)再生的影響是否與對毛囊干細(xì)胞的作用有關(guān)，本研究采用CD34和CD49f雙標(biāo)記染色以顯示毛囊干細(xì)胞［9-10］。結(jié)果如圖6所示，CD34和CD49f雙標(biāo)陽性細(xì)胞主要位于毛囊隆突部，在3-MA處理后雙標(biāo)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度明顯高于Vehicle組，而RAPA組則明顯低于Vehicle組，表明經(jīng)3-MA處理后，毛囊干細(xì)胞的數(shù)目增多，細(xì)胞增殖活躍，RAPA則可能抑制了毛囊干細(xì)胞的增殖分化過程。

4 討 論

哺乳動物毛囊是一種具有自我再生能力的特殊器官，在出生后第一次毛囊形態(tài)學(xué)發(fā)生完成后，就依次進(jìn)入退行期、休止期和生長期的不斷循環(huán)。如果該正常循環(huán)周期一旦被破壞，則會發(fā)生各種毛發(fā)疾病，如臨床休止期脫發(fā)的發(fā)生就與毛囊長期停滯于休止期有關(guān)，而如果能快速有效地促進(jìn)毛囊由休止期重新轉(zhuǎn)入生長期，則有助于對休止期脫發(fā)的臨床治療。

Figure 6 Effect of3-MA on expressions of CD34，CD49f in hair follicle by immunofluorescence（×200）

自噬是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種重要機(jī)制，恰當(dāng)?shù)淖允伤接兄皶r清除衰老無用的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；但過度亢進(jìn)的自噬又可能導(dǎo)致對細(xì)胞內(nèi)容物的過度清除，從而抑制細(xì)胞的功能［11-13］。毛囊作為一種快速更新的器官，維持恰當(dāng)?shù)淖允伤接葹橹匾?。如研究發(fā)現(xiàn)，Mnd2鼠在轉(zhuǎn)染HtrA2／Omi基因后，細(xì)胞會出現(xiàn)過度自噬導(dǎo)致鼠的休止期脫發(fā)、體重減輕［14］。Wang等［15］采用自噬抑制劑Tempol和RP67580抑制毛囊細(xì)胞中LC3BⅡ的表達(dá)，可以重建毛囊周期循環(huán)，而活性氧簇（ROS）和P物質(zhì)則通過誘導(dǎo)毛囊細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，使毛囊處于休止期而不能向生長期轉(zhuǎn)化；在移植自噬相關(guān)基因Atg7缺失小鼠的皮膚至SCID小鼠后，毛乳頭的生成反而增加［16］；相反，自噬誘導(dǎo)劑RAPA可增強(qiáng)毛囊細(xì)胞的自噬，從而延長C57BL／6小鼠從休止期進(jìn)入生長期的時間［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，自噬在毛囊周期的調(diào)節(jié)中的確發(fā)揮著重要作用。同時還發(fā)現(xiàn)在給予自噬抑制劑3-MA刺激后，毛囊上皮細(xì)胞內(nèi)的Beclin1表達(dá)、LC3BⅡ／Ⅰ比值均顯著降低，P62表達(dá)明顯升高，鼠毛囊的再生明顯被促進(jìn)，毛囊上皮細(xì)胞中Ki67表達(dá)增加，毛囊干細(xì)胞的增殖分化加速，鼠再生部位的皮膚顏色改變及新發(fā)生成明顯加強(qiáng)，而給予RAPA后，Beclin1表達(dá)、LC3BⅡ／Ⅰ比值顯著升高，P62表達(dá)明顯降低，Ki67表達(dá)減少，毛囊干細(xì)胞的增殖減慢，毛囊從休止期入生長期的時間反而延長，且新生毛發(fā)的質(zhì)與量均有下降。證明通過抑制自噬可以促進(jìn)小鼠的毛囊從休止期向生長期的轉(zhuǎn)化，而誘導(dǎo)自噬可能導(dǎo)致休止期的持續(xù)延長。

綜上所述，本研究提示自噬是毛囊上皮細(xì)胞的一種重要的周期循環(huán)調(diào)節(jié)機(jī)制，自噬的異?？赡苁敲野l(fā)生休止期延遲或停滯的原因之一，而通過適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)休止期毛囊的自噬異常，則有助于促進(jìn)毛囊從休止期向生長期的快速轉(zhuǎn)化，促進(jìn)休止期毛發(fā)的再生。使用自噬抑制劑3-MA或其相關(guān)的自噬抑制劑則有望在人類休止期脫發(fā)疾病的治療中發(fā)揮重要作用，具有深入研究的前景與價值。