色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定環(huán)孢素A的有關(guān)物質(zhì)

倪悅泠，韓 興，宋 敏，杭太俊

（中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析系，南京210009）

環(huán)孢素 A（cyclosporin A，環(huán)［［（E）-（2S，3R，4R）-3-羥基-4-甲基-2-（甲氨基）-6-辛烯酰］-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-纈氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-纈氨酰］，圖 1），是從真菌代謝產(chǎn)物中提取得到含11個(gè)氨基酸殘基的環(huán)肽免疫抑制劑。臨床上主要用于肝、腎以及心臟移植的抗排異反應(yīng)，預(yù)防及治療骨髓移植時(shí)發(fā)生的移植物抗宿主反應(yīng)［1］，也是目前眼科應(yīng)用最多的一種免疫抑制劑類(lèi)可供眼表使用的抗炎藥物，可治療干眼癥、結(jié)膜炎，抑制角膜移植排異反應(yīng)［2-4］。此外，環(huán)孢素還可用于重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、特發(fā)性血小板減少性紫癜、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性腎炎和腎病綜合癥等多種自身免疫性疾?。?-8］。

中國(guó)及主要發(fā)達(dá)國(guó)家現(xiàn)行藥典已收載環(huán)孢素A及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，歐洲藥典還列出其A、B、C 3類(lèi)共12個(gè)雜質(zhì)和結(jié)構(gòu)。已有文獻(xiàn)報(bào)道了環(huán)孢素 A制劑質(zhì)量研究［9-11］及藥代動(dòng)力學(xué)研究［12-14］，但是，環(huán)孢素A原料藥有關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)研究與鑒定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

Figure 1 Chemical structure of cyclosporine A

本研究建立了適用于環(huán)孢素A有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，通過(guò)TOF／MS測(cè)定了環(huán)孢素A各有關(guān)物質(zhì)的準(zhǔn)確分子質(zhì)量及分子式，結(jié)合MS／MS的子離子特征，綜合解析鑒定其有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可用于環(huán)孢素A的發(fā)酵工藝和成品的質(zhì)量控制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

環(huán)孢素A原料藥（批號(hào)180301HB，江蘇九陽(yáng)生物制藥有限公司）；環(huán)孢素 A粗品（批號(hào)WCP180101，江蘇九陽(yáng)生物制藥有限公司）；環(huán)孢素A對(duì)照品（EP）；環(huán)孢素色譜分離度對(duì)照品（USP，環(huán)孢素 U-環(huán)孢素，1∶100）。

乙腈、甲基叔丁基醚（美國(guó)Tedia公司）；甲酸（AR，南京化學(xué)試劑股份有限公司）。自制純凈水。

1.2 儀 器

Agilent 1290 Infinity液相色譜-6224飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó) Agilent公司）；Thermo Dionex Ulti-Mate 3000高效液相色譜-TSQQuantum Ultra型LCMS／MS聯(lián)用儀（美國(guó) Thermo-Fisher公司）；BS 21S分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

2 方 法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

Thermo Scientific BDS Hypersil C18（100 mm×4.6 mm，2.4μm）色譜柱；乙腈-水-甲基叔丁基醚-甲酸（430∶520∶50∶1）流動(dòng)相等度洗脫，流速0.8 mL／min，柱溫80℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量20μL。

電噴霧正離子化，TOF／MS測(cè)定噴霧電壓3.5 kV，霧化氮?dú)鈮毫?275 kPa，流量 10 L／min，溫度350℃，碎片電壓200 V，參比離子m／z121.050 8（質(zhì)子化嘌呤，C5H5N4+）和m／z922.009 8（質(zhì)子化氟代膦嗪HP-921，C18H19O6N3P3F24+），質(zhì)量數(shù)掃描范圍m／z100～1 300。MS／MS測(cè)定的噴霧電壓4 kV，霧化氣壓力300 kPa，輔助氣壓力35 kPa，毛細(xì)管溫度350℃，二級(jí)質(zhì)譜掃描碰撞氬氣壓力0.16 Pa，碰撞能量30～60 eV。

2.2 供試品溶液的制備

取環(huán)孢素A約25 mg，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加乙腈-水（70∶30）稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為2.5 mg／mL的供試品溶液。精密量取上述溶液適量，加稀釋劑定量稀釋?zhuān)渲?.1%的自身對(duì)照溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取環(huán)孢素A對(duì)照品約25 mg，精密稱(chēng)定，加稀釋劑溶解并定量稀釋成質(zhì)量濃度約為2.5 mg／mL的溶液作為環(huán)孢素A對(duì)照品溶液。

取環(huán)孢素色譜分離度對(duì)照品（含環(huán)孢素U-環(huán)孢素，1∶100）25 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋制成含環(huán)孢素A和環(huán)孢素U的質(zhì)量濃度分別約為2.5 mg／mL和25μg／mL的混合溶液，用于供試品中環(huán)孢素U的定性。

2.4 強(qiáng)制降解試驗(yàn)溶液

取環(huán)孢素A約25 mg兩份，加入稀釋劑0.5 mL溶解后，分別經(jīng)1 mol／L鹽酸溶液0.5 mL 60℃水浴4 h、或1mol／L氫氧化鈉溶液0.5mL 60℃水浴1 h處理后，分別中和后加稀釋劑稀釋至10 mL，配制成質(zhì)量濃度約為2.5 mg／mL的酸、堿強(qiáng)制降解試驗(yàn)溶液。

取環(huán)孢素A約25 mg，經(jīng)30%過(guò)氧化氫1 mL 60℃水浴52 h，然后加稀釋劑溶解并稀釋至10 mL，配制成質(zhì)量濃度約為2.5 mg／mL的氧化強(qiáng)制降解試驗(yàn)溶液。

取環(huán)孢素A約25 mg，經(jīng)120℃烘箱放置5 d，加稀釋劑溶解并稀釋至10 mL，配制成質(zhì)量濃度約為2.5 mg／mL的高溫強(qiáng)制降解試驗(yàn)溶液。

同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，制備空白對(duì)照。

3 結(jié)果和討論

3.1 有關(guān)物質(zhì)檢查

建立的環(huán)孢素A有關(guān)物質(zhì)揮發(fā)性流動(dòng)相HPLC檢查方法適用于質(zhì)譜聯(lián)用鑒定?，F(xiàn)行藥典所使用的乙腈-甲基叔丁基醚-水流動(dòng)相體系分離效果較好，嘗試將甲基叔丁基醚更換為甲醇，或使用四氫呋喃，對(duì)分離度及柱效均無(wú)改善。色譜條件中柱溫是影響分離的關(guān)鍵因素，低于80℃柱溫，環(huán)孢素A及各有關(guān)物質(zhì)的保留時(shí)間均增加，峰展寬嚴(yán)重，分離變差。本研究?jī)?yōu)化了流動(dòng)相中有機(jī)相種類(lèi)、比例，嘗試添加三氟乙酸和緩沖鹽體系，分離均未改善。最終確立的色譜條件可盡早洗脫出各有關(guān)物質(zhì)，色譜分離較好。

圖2為環(huán)孢素A原料藥、粗品及其強(qiáng)制降解溶液的HPLC-UV譜圖。采用0.1%自身對(duì)照法估算有關(guān)物質(zhì)的含量，按保留時(shí)間由小到大順序?qū)看笥?.1%主要雜質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和編號(hào)，共檢出分離效果較好的29個(gè)主要有關(guān)物質(zhì)，其中有關(guān)物質(zhì)9、10、12、14、15、16、17、18、19、20、23、24和 27與EP中列出的9個(gè)已知結(jié)構(gòu)雜質(zhì)（或其光學(xué)異構(gòu)體）相應(yīng)。

環(huán)孢素A原料藥供試品共檢出2個(gè)有關(guān)物質(zhì)（21、23，圖2-c）。環(huán)孢素A粗品共檢出9個(gè)有關(guān)物質(zhì)（9、10、12、15、19、21、23、24和 28，圖 2-h）。強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果表明，本品對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫條件均具有一定敏感性，對(duì)光照條件較為穩(wěn)定。酸破壞形成3個(gè)主要降解產(chǎn)物（13、25和26，圖2-d）；堿破壞形成4個(gè)主要降解產(chǎn)物（2、11、16和19，圖2-e）；氧化破壞形成2個(gè)主要降解產(chǎn)物（4和8，圖2-f）；高溫破壞形成15個(gè)主要降解產(chǎn)物（1、3、4、5、6、7、8、14、17、18、19、20、22、27和 29，圖2-g）。

Figure2 HPLC-UV chromatograms of cyclosporin A（a.Reference solution of0.1%；b.Reference solution of1.0%；c.API）and its stressed solutions（d.Acid；e.Alkaline；f.Oxidation；g.Thermal；h.Crude）

3.2 有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

采用LC-TOF／MS測(cè)得各有關(guān)物質(zhì)母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量和離子組成，三重四極質(zhì)譜測(cè)得它們的二級(jí)質(zhì)譜特征碎片，并通過(guò)與環(huán)孢素A和環(huán)孢素U的質(zhì)譜特征的對(duì)比分析，鑒定各主要有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。結(jié)果見(jiàn)表1和圖3。

3.2.1 環(huán)孢素質(zhì)譜裂解規(guī)律 通過(guò)對(duì)環(huán)孢素A對(duì)照品及色譜分離度對(duì)照品中環(huán)孢素A、環(huán)孢素U進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜母離子準(zhǔn)確質(zhì)量（圖4）、二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子進(jìn)行分析，總結(jié)出環(huán)孢素母核一般裂解規(guī)律（圖5～圖7），從而輔助未知有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的推斷。

Table 1 Related substances of cyclosporin A identified by LC-MS

（Continued）

Figure 3 Chemical structures of the related substances（RSs1 29）of CsA

Figure 4 ESI-MSTIC chromatogram obtained from cyclosporine A resolution mixture（2.5 mg／mL）

環(huán)孢素A ESI+-TOF／MS測(cè)得環(huán)孢素A的［M+H］+準(zhǔn)確質(zhì)量為 1 202.851 4，與離子式C62H112N11O12+相應(yīng)，相對(duì)分子質(zhì)量為1 202.6。測(cè)得［M+H］+的ESI+-MS／MS主要特征碎片離子m／z1 184.8、1 099.8、1 071.8、1 057.7、944.7、834.6、821.6、806.6、693.5、675.5等。m／z1184.8與母離子脫水生成的［P-H2O］+特征碎片離子相應(yīng)；m／z834.6、821.6和806.6由母離子b／Y裂解丟失AA5（Val）+AA6（MeLeu）+AA7（Ala）+AA8（D-Ala）、AA2（Abu）+AA3（MeGly）+AA4（MeLeu）+AA5（Val）和AA7（Ala）+AA8（D-Ala）+AA9（MeLeu）+AA10（MeLeu）產(chǎn)生；m／z637.5由m／z821.6離子b／Y裂解丟失 AA1產(chǎn)生；m／z1 099.8、1 071.8、944.7、693.5、675.5和 567.4分別由m／z1 184.8離子 b／Y裂解丟失 AA2（Abu）、AA11（MeVal）、AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）、AA1+AA2（Abu）+AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）、AA2（Abu）+AA3（MeGly）+AA4（MeLeu）+AA5（Val）+AA6（MeLeu）和 AA1+AA2（Abu）+AA9（MeLeu）+AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）產(chǎn)生。環(huán)孢素 A的二級(jí)質(zhì)譜圖及推斷裂解途徑分別見(jiàn)圖5。

Figure5 MS／MSspectrum of［M+H］+ion and fragmentation pathways of CsA（m／z1 202.8）

環(huán)孢素U ESI+-TOF／MS測(cè)得環(huán)孢素U的［M+H］+準(zhǔn)確質(zhì)量為 1 188.831 8，與離子式C61H110N11O12+相應(yīng)，相對(duì)分子質(zhì)量為1 188.6。測(cè)得［M+H］+的 ESI+-MS／MS主要特征碎片離子m／z1 170.8、1 157.7、1 085.8、1 057.7、930.6、679.5、675.4、661.5、383.3等。環(huán)孢素 U的裂解規(guī)律與環(huán)孢素A相似，m／z1 170.8與母離子脫水形成的碎片離子相應(yīng)；m／z679.5由母離子b／Y裂解丟失 AA7（Ala）+AA8（D-Ala）+AA9（MeLeu）+AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）產(chǎn)生；m／z661.5為m／z679.5離子脫水生成的質(zhì)量數(shù)為［M-18］+的特征碎片離子；m／z1 086.7、1 057.7和675.4分別由m／z1 170.8離子 b／Y裂解丟失 AA2（Abu）、AA11（MeVal）和 AA2（Abu）+AA3（MeGly）+AA4（MeLeu）+AA5（Val）+AA6（MeLeu）產(chǎn)生。環(huán)孢素U的二級(jí)質(zhì)譜圖及推斷裂解途徑分別見(jiàn)圖6。

Figure 6 MS／MS spectrum of［M+H］+ion and fragmentation pathways of CsU（m／z1 188.8）

環(huán)孢素母核裂解規(guī)律如下：（1）鍵開(kāi)裂的方式主要有 a／X、b／Y、c／Z 3種，由于所使用碰撞能較大，3種開(kāi)裂產(chǎn)物均可能出現(xiàn)，氨基酸殘基上化學(xué)鍵也可能發(fā)生斷裂，因此環(huán)孢素A及其有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)譜圖較為復(fù)雜。（2）環(huán)孢素A及其有關(guān)物質(zhì)在AA1殘基β-OH易脫水生成質(zhì)量數(shù)為［M-18］+碎片離子。（3）環(huán)孢素 A較易在 AA1-AA2、AA5-AA6、AA8-AA9、AA9-AA10和 AA11-AA1間肽鍵發(fā)生b／Y型斷裂。（4）環(huán)孢素A、環(huán)孢素U及其他有關(guān)物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜大多產(chǎn)生相同質(zhì)荷比的小于m／z650的碎片離子。根據(jù)肽類(lèi)化合物氨基酸殘基裂解規(guī)律，推斷它們均為相同結(jié)構(gòu)（圖7），提示這些有關(guān)物質(zhì)與環(huán)孢素A有大致相同的氨基酸組成及多肽片段。但是，由于不同有關(guān)物質(zhì)中價(jià)鍵能量的差異、二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定時(shí)碰撞電壓的不同，可能會(huì)使這些碎片離子峰簇的相對(duì)豐度此消彼長(zhǎng)［15］。此類(lèi)碎片離子只宜用于驗(yàn)證結(jié)構(gòu)推斷的正確性，而不能作為判定氨基酸序列的決定性依據(jù)。

3.2.2 有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定 ESI-MS總離子流色譜圖中，主成分及各有關(guān)物質(zhì)均產(chǎn)生［M+H］+、［M+NH4］+、［M+Na］+單電荷分子離子峰，及［M+H+NH4］2+、［M+H+Na］2+等雙電荷峰（圖8）。本研究中，ESI-MS／MS均選擇［M+H］+或［M+NH4］+作母離子，以便二級(jí)質(zhì)譜解析。

測(cè)得各有關(guān)物質(zhì)母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量和離子組成（表1），及它們的二級(jí)質(zhì)譜特征碎片（圖9），并通過(guò)與環(huán)孢素A和環(huán)孢素U的質(zhì)譜特征的對(duì)比分析，鑒定各主要有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)（表1，圖3）。

Figure 7 MS／MS common fragments（m／z＜650）of CsA and its typical RSs

Figure 8 ESI-MS full scan spectrum of CsA

Figure 9 MS／MS spectra of typical RSs of CsA

通過(guò)有關(guān)物質(zhì)HPLC保留時(shí)間及質(zhì)譜定性，確證有關(guān)物質(zhì)12與色譜分離度對(duì)照品中環(huán)孢素U對(duì)應(yīng)。檢測(cè)出的29個(gè)有關(guān)物質(zhì)均與環(huán)孢素A有相似母核，根據(jù)結(jié)構(gòu)將其大致分為以下幾類(lèi)：

（1）環(huán)孢素家族及其立體異構(gòu)體

有關(guān)物質(zhì)9、10、12、14和15的結(jié)構(gòu)分別與環(huán)孢素L、環(huán)孢素C、環(huán)孢素U、環(huán)孢素T和環(huán)孢素B相應(yīng)；16和17與環(huán)孢素A／H及其光學(xué)異構(gòu)體相應(yīng)；27與異環(huán)孢素A相應(yīng)；23和24與環(huán)孢素D及其光學(xué)異構(gòu)體相應(yīng)。

有關(guān)物質(zhì)9 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A少14，元素組成少 CH2。特征碎片離子m／z1 170.8、930.6、679.5和661.5均與環(huán)孢素Am／z1 184.8、944.7、693.5和675.5相差14。推斷其甲基丟失在AA1的N上，與歐洲藥典收載的雜質(zhì)環(huán)孢素L相應(yīng)，為發(fā)酵工藝中產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)10 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A多16，元素組成多一個(gè) O，與一個(gè)羥基相應(yīng)。m／z1 200.8、1 087.7、960.6和 691.5均與環(huán)孢素 Am／z1 184.8、1 071.8、944.7和675.5相差16。確證其羥基帶在AA2上，為蘇氨酸（Thr）。該雜質(zhì)與歐洲藥典收載的環(huán)孢素C結(jié)構(gòu)相應(yīng)，為發(fā)酵工藝中產(chǎn)生，含量較大。

有關(guān)物質(zhì)12 其保留時(shí)間、準(zhǔn)確質(zhì)量、元素組成及特征碎片離子均與已知雜質(zhì)環(huán)孢素U的基本相同。確證有關(guān)物質(zhì)12即為環(huán)孢素U。

有關(guān)物質(zhì)14 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A少14，元素組成少CH2。特征碎片離子m／z1 170.8、1 057.7和679.5與環(huán)孢素 Am／z1 184.8、1 071.8和693.5相差14，其甲基丟失在AA10的N上。推斷為環(huán)孢素A在高溫條件下，失去AA10上N-甲基產(chǎn)生，與歐洲藥典收載的雜質(zhì)環(huán)孢素T相應(yīng)。

有關(guān)物質(zhì)15 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A少14，元素組成少CH2。特征碎片離子m／z1 170.8、1 057.7、930.6、679.5、308.2和 237.2均比環(huán)孢素 Am／z1 184.8、1 071.8、944.7、693.5、323.2和 251.2小14；m／z862.6和806.6也為環(huán)孢素A碎片。推斷甲基丟失在AA1或AA2上，當(dāng)其AA2為少一個(gè)甲基的丙氨酸（Ala）時(shí)，與歐洲藥典收載的雜質(zhì)環(huán)孢素B相應(yīng)，為發(fā)酵工藝中產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)16／17 為環(huán)孢素A在堿性或高溫強(qiáng)制破壞條件下。質(zhì)量數(shù)、主要特征碎片離子及裂解途徑與環(huán)孢素A均相同，推斷為環(huán)孢素A母核碳原子發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn)產(chǎn)生的差向異構(gòu)體。當(dāng)AA11為D-甲基纈氨酸（D-MeVal）時(shí)與歐洲藥典收載的雜質(zhì)環(huán)孢素H相應(yīng)。

有關(guān)物質(zhì)23／24 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A大14，元素組成多 CH2。主要特征碎片離子m／z933.7、821.6、637.5等與環(huán)孢素A特征碎片離子相同；m／z1 198.9、1 085.8、958.7、707.5和 336.2比環(huán)孢素 Am／z1 184.8、1 086.7、944.6、693.5和322.2多14，推斷AA2殘基多一個(gè)甲基，為纈氨酸（Val）或2-氨基丁酸（Abu），但可能存在構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，故有不同保留。其中當(dāng)AA2為L(zhǎng)-纈氨酸（L-Val）時(shí)，為歐洲藥典收載的雜質(zhì)環(huán)孢素D。均為發(fā)酵工藝中產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)27 為環(huán)孢素A的同分異構(gòu)體，其保留較強(qiáng)，極性較小。而環(huán)孢素AA1殘基上β-OH是其極性的重要影響因素，根據(jù)其主要特征碎片離子推測(cè)，其為環(huán)孢素A在高溫條件下AA1上β-OH與AA1-AA11間酰胺鍵羰基發(fā)生親核置換，縮合成酯產(chǎn)生。m／z1 184.8與母離子AA11-AA1間酯鍵水解后脫水形成的特征碎片離子相應(yīng)；m／z1 118.8為母離子AA1殘基脫去一分子C6H12形成；m／z751.5為母離子裂解失去AA9（MeLeu）+AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）形成。推斷其結(jié)構(gòu)與歐洲藥典收錄的雜質(zhì)C相同，為異環(huán)孢素A。其產(chǎn)生過(guò)程如圖11所示。

（2）肽鍵水解或丟失部分氨基酸

有關(guān)物質(zhì)1為環(huán)孢素A在高溫條件AA1-AA11間肽鍵水解產(chǎn)生；有關(guān)物質(zhì)13、25和26均由環(huán)孢素A在酸性條件下水解后丟失部分氨基酸片段產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)1 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A大16，元素組成多O，保留很弱，極性較大。m／z1 200.8比母離子m／z1 218.8小18，與母離子脫水相應(yīng)，推測(cè)為環(huán)孢素A環(huán)狀結(jié)構(gòu)開(kāi)環(huán)水解含有游離羧基產(chǎn)物。m／z835.6為母離子脫去一分子HCOOH和AA1+AA2（Abu）+AA3（MeGly）產(chǎn)生；m／z710.6為m／z835.6 b／Y裂解丟失 AA4（MeLeu）產(chǎn)生。推斷該雜質(zhì)為環(huán)孢素A在高溫條件下，AA1-AA11間肽鍵水解產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)13 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A少222，不飽和度減少3，其保留較弱，極性較大。碎片離子中m／z674.5、567.4、548.4、425.3、322.2、297.2、198.1、156.1等也為環(huán)孢素A的特征碎片離子，故雜質(zhì)AA1～8與環(huán)孢素A相同；m／z710.5比環(huán)孢素Am／z693.5大17，與一個(gè)羥基相符，故其AA9存在游離羧基。推斷為環(huán)孢素A在強(qiáng)酸條件下水解，脫去AA10和AA11產(chǎn)生。

Figure 10 Formation reaction of RS 27

有關(guān)物質(zhì)25 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A大18，元素組成多H2O，不飽和度減1。特征碎片離子m／z1 022.7、895.6和782.5表明AA7存在游離羧基。推斷為環(huán)孢素A在強(qiáng)酸條件下，AA7-AA8間肽鍵水解形成。

有關(guān)物質(zhì)26 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A少95。主要特征碎片離子中m／z962.7、944.7、821.6、779.5、675.5、566.3等與環(huán)孢素 A相同；m／z839.6比環(huán)孢素Am／z821.6多18，證明 AA10存在游離羧基。推斷為環(huán)孢素A在強(qiáng)酸條件下水解，脫去AA11產(chǎn)生。

（3）N-去甲基化

有關(guān)物質(zhì)9、12和14質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素 A少14，元素組成少CH2，不飽和度不變。在粗品中存在，或在高溫條件下產(chǎn)生，均由環(huán)孢素A在氨基酸N位發(fā)生去甲基化產(chǎn)生。

（4）側(cè)鏈修飾

有關(guān)物質(zhì)2 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A少了112，不飽和度減1。特征碎片離子m／z963.7、850.6和581.4均比環(huán)孢素A特征碎片m／z1 157.7、944.7和675.5少94，與AA1殘基脫水后相對(duì)分子質(zhì)量相應(yīng)。推斷為環(huán)孢素A在堿性條件下AA1-α碳原子上殘基全部脫去產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)3 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A少56。推測(cè)AA1為2-氨基-3-酮戊酸。m／z1 116.7為母離子AA1殘基上脫去一分子C2H6產(chǎn)生。由于環(huán)孢素AA1-β-OH的存在，高溫條件下γ碳發(fā)生斷裂，丟失一個(gè)丁烯，羥基氧化成羰基形成該雜質(zhì)。

有關(guān)物質(zhì)4／7／8 其分子式及主要特征碎片離子相同，質(zhì)量數(shù)均比環(huán)孢素A多16，元素組成多O，不飽和度不變。m／z1 200.8比環(huán)孢素A特征碎片m／z1 184.8多 16，與一個(gè)羥基相應(yīng)；m／z1 105.8和978.7均比環(huán)孢素 Am／z1 071.8和944.7多34，與兩個(gè)羥基相應(yīng)。為環(huán)孢素A在高溫或者強(qiáng)氧化條件下，AA1殘基烯鍵被氧化成ε-羰基產(chǎn)生（在此過(guò)程中母核易發(fā)生構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，因此有多種立體結(jié)構(gòu)）。m／z1 188.8為母離子AA1殘基上開(kāi)裂脫去一分子C2H6產(chǎn)生，進(jìn)一步確證結(jié)構(gòu)中羰基的位置。推斷有關(guān)物質(zhì)4、7和8為環(huán)孢素A在氧化或高溫條件下產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)5 質(zhì)量數(shù)均比環(huán)孢素A多16，元素組成多O，不飽和度不變。m／z709.5和582.4均比環(huán)孢素Am／z675.5和566.4多16，與一個(gè)羥基相應(yīng)，其AA1殘基與有關(guān)物質(zhì)4／7／8有相同的羰基結(jié)構(gòu)；m／z1 174.8為母離子AA1殘基丟失一分子CH2=CHOH產(chǎn)生。推斷其羰基位置在ζ位，為環(huán)孢素A在高溫條件下產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)18／19／20 質(zhì)量數(shù)均比環(huán)孢素A小18，元素組成少H2O，與脫一分子水對(duì)應(yīng)。其中，有關(guān)物質(zhì)19在粗品中存在，在高溫和強(qiáng)堿強(qiáng)制降解溶液中顯著增加。3個(gè)雜質(zhì)主要特征碎片離子基本相同，也都是環(huán)孢素A的特征碎片離子，推斷均為環(huán)孢素A上AA1-β-OH脫去一分子水成烯鍵形成。在此過(guò)程中母核可能發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn)，因此有多種立體結(jié)構(gòu)，但三者的具體構(gòu)型無(wú)法確證。當(dāng)其碳原子構(gòu)型與環(huán)孢素A完全相同時(shí)，為歐洲藥典收載的雜質(zhì)B

有關(guān)物質(zhì)21 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A大2，元素組成多2H，不飽和度減1。其主要特征碎片離子m／z1 186.9、1 073.8、946.7和 677.5均比環(huán)孢素 Am／z1 184.8、1 071.8、944.7和 675.5大 2，m／z567.4、524.4等碎片離子與環(huán)孢素 A相同，證明AA1殘基上雙鍵還原。在環(huán)孢素粗A品及原料藥中均存在，為發(fā)酵工藝中產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)28 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A小16，與一個(gè)O對(duì)應(yīng)，不飽和度不變。其保留比環(huán)孢素A強(qiáng)很多，極性較弱。主要特征碎片離子中沒(méi)有母離子脫水生成的［P-H2O］+離子，說(shuō)明結(jié)構(gòu)中無(wú)游離羥基。推斷其AA1為2-氨基-4-甲基-6-烯辛酸，在發(fā)酵工藝中產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)29 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A多12，不飽和度減少1，保留較強(qiáng)，極性很弱。主要特征碎片離子m／z1 101.8、974.7、818.6、705.5、578.4和479.3比環(huán)孢素 Am／z1 089.8、963.5、806.6、693.5、567.4和 467.3均大12，m／z352.2比環(huán)孢素Am／z322.2大30。推斷AA2殘基比環(huán)孢素A多一個(gè)甲基，且AA1-β-OH氧化成羰基。為高溫條件下產(chǎn)生降解雜質(zhì)。

（5）縮酮反應(yīng)

有關(guān)物質(zhì)11 縮醛（酮）具有類(lèi)似于醚的結(jié)構(gòu)，在堿性介質(zhì)中化學(xué)穩(wěn)定性很好［16］。根據(jù)特征碎片離子，推斷為堿性強(qiáng)制破壞條件下，環(huán)孢素A肽鍵上羰基可與AA1支鏈上羥基發(fā)生半縮酮反應(yīng)，產(chǎn)生有關(guān)物質(zhì)11。其產(chǎn)生過(guò)程如圖12所示。

Figure 12 Formation reaction of RS 11

（6）其 他

有關(guān)物質(zhì)6 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A多5，不飽和度減1。推斷為環(huán)孢素A在高溫條件下，AA2-β碳氧化帶上羥基，同時(shí)AA5-AA6間肽鍵水解并失去一分子NH==CH2產(chǎn)生。

有關(guān)物質(zhì)22 質(zhì)量數(shù)比環(huán)孢素A小13，不飽和度不變，保留較強(qiáng)。根據(jù)分子式，其結(jié)構(gòu)比環(huán)孢素A少一個(gè)C和一個(gè)N，多一個(gè)O，其主要特征碎片離子m／z1 171.8為母離子丟失一個(gè)羥基形成；m／z1 058.7正好為m／z1 171.8失去一個(gè)甲基纈氨酸（MeLeu）形成；m／z662.4比環(huán)孢素 A的m／z693.5少31，與脫去一分子NH==CH2同時(shí)出現(xiàn)雙鍵相符。推斷有關(guān)物質(zhì)22為環(huán)孢素A高溫條件下脫去第1位氨基酸上NH==CH2，且羥基被氧化成羰基形成。

4 結(jié) 論

本研究建立了能有效檢測(cè)和分離環(huán)孢素A發(fā)酵過(guò)程及其強(qiáng)制降解產(chǎn)生29個(gè)有關(guān)物質(zhì)的揮發(fā)性流動(dòng)相LC-MS方法，并對(duì)這些有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推測(cè)，對(duì)發(fā)酵工藝質(zhì)量控制、評(píng)估藥物內(nèi)在穩(wěn)定性及制定存儲(chǔ)條件具有一定意義。

檢測(cè)出的有關(guān)物質(zhì)根據(jù)來(lái)源可分為發(fā)酵工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)，其產(chǎn)生途徑見(jiàn)圖13。環(huán)孢素A在發(fā)酵工藝過(guò)程中產(chǎn)生了9個(gè)有關(guān)物質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)9、10、12、15、19、21、23、24和 28）；原料藥中兩個(gè)有關(guān)物質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)21和23），含量均未超過(guò)藥典規(guī)定限度。

強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)孢素A在強(qiáng)酸條件下易發(fā)生肽鍵的水解反應(yīng)，丟失部分氨基酸片段生成鏈狀多肽（有關(guān)物質(zhì)13、25和26）；在強(qiáng)堿條件下，環(huán)孢素A可脫去殘基，肽鍵可與鄰近殘基上羥基發(fā)生縮酮反應(yīng)，或降解成保留極弱的氨基酸片段（有關(guān)物質(zhì)2、11、16和19）；在氧化和高溫條件下，環(huán)孢素A易發(fā)生N-脫甲基、殘基脫羥基等反應(yīng)（有關(guān)物質(zhì) 1、3、4、5、6、7、8、14、17、18、19、20、22、27和29）；環(huán)孢素A對(duì)光較為穩(wěn)定，強(qiáng)光照射幾乎沒(méi)有新的雜質(zhì)產(chǎn)生。故環(huán)孢素需于密封干燥處儲(chǔ)存。

Figure13 Generation of themain RSs of CsA