喉鱗狀細(xì)胞癌ESRRG基因啟動子甲基化及臨床意義研究

胡燕 沈志森 周重昌 袁潔 徐捷 郝文娟 葉棟 鄧紅霞

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一[1]，其中喉鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）是最常見的病理學(xué)類型[2]。手術(shù)和放化療是目前臨床上治療LSCC的主要方法。據(jù)統(tǒng)計(jì)，LSCC患者的5年生存率較低，這主要是由于患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率和第二原發(fā)腫瘤發(fā)生率較高所致[3]。LSCC的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，其中包括遺傳因素及吸煙、飲酒、人乳頭瘤病毒感染等環(huán)境因素[4]，但LSCC發(fā)生的具體分子機(jī)制尚待深入探討。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因修飾方式之一，啟動子區(qū)域CpG島的甲基化修飾對基因表達(dá)的影響十分重要，高甲基化修飾會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄抑制或沉默。抑癌基因高甲基化會導(dǎo)致抑癌作用異常，從而導(dǎo)致癌癥發(fā)生、發(fā)展[5]。人雌激素相關(guān)受體 γ（ESRRG）基因位于人體染色體 1q41[6]。ESRRG蛋白屬孤兒核受體，可在無天然配體的條件下發(fā)揮生物學(xué)作用[7]。研究表明，ESRRG基因與腫瘤細(xì)胞代謝、增殖、轉(zhuǎn)移等有關(guān)，起抑癌作用，包括乳腺癌[8]、子宮內(nèi)膜癌[9]、卵巢癌[10]及前列腺癌[11]等性別相關(guān)腫瘤。據(jù)世界癌癥組織統(tǒng)計(jì)，LSCC男性高發(fā)，在女性中發(fā)生率較低，筆者推測LSCC的發(fā)生亦與性別相關(guān)基因有關(guān)。基于此，本研究探討ESRRG基因啟動子在男性LSCC組織中的甲基化狀態(tài)，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并評估其對LSCC的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2011年4月至2015年2月在寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科行手術(shù)治療的男性 LSCC 患者 89 例，年齡 40～86（60.15±9.06）歲。患者術(shù)前均未接受過放化療。病理學(xué)診斷嚴(yán)格按照國際癌癥控制聯(lián)盟（UICC）分類指南（TNM 2002）分期，其中Ⅰ期28例、Ⅱ期15例、Ⅲ期12例、Ⅳ期34例?；颊咝g(shù)后隨訪5年，其中失訪5例，死亡32例，存活52例。術(shù)中留取的LSCC組織與距癌組織邊緣0.5cm以上的癌旁正常組織標(biāo)本立即置于RNA保存液中保存于-80℃冰箱。本研究獲寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和純化 嚴(yán)格按照QIAamp DNA Mini試劑盒 (Qiagen,Hilden,Germany)說明書提取患者LSCC組織與癌旁正常組織的DNA。嚴(yán)格按照ZYMO EZ DNA Methylation-Gold試劑盒（ZymoRe.Search,Irvine,CA,USA）說明書進(jìn)行DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和純化。

1.2.2 DNA擴(kuò)增及焦磷酸測序 檢測LSCC組織與癌旁正常組織中ESRRG基因啟動子上連續(xù)6個(gè)CG位點(diǎn)（hg19:chr1:217311596-217311629）的甲基化水平。嚴(yán)格按照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒（PyroMark PCR Kit;Qiagen）說明書將亞硫酸鹽處理過的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。ESRRG基因正向引物序列為 5′-TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3′，反向引物序列為 5′-Biotin-TCTTTTCAAATCCATCACTAA-3′。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10min后，循環(huán)“95℃變性30s，50℃退火 40s，72℃延伸 60s”共 45次。應(yīng)用 PyroMark Q24（Qiagen）焦磷酸測序儀，按焦磷酸測序試劑盒（EpiTech Bisulfite Kits,Qiagen）說明書對ESRRG基因啟動子進(jìn)行測序，測序序列為 5′-GGGAGATGAATTGGG-3′，直接從測序儀上讀得ESRRG基因啟動子甲基化水平。以上所有實(shí)驗(yàn)步驟均重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較LSCC組織與癌旁正常組織ESRRG基因啟動子甲基化水平。（2）分析LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，包括年齡、吸煙行為及腫瘤組織學(xué)類型、部位、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等。（3）評估ESRRG基因啟動子甲基化水平對LSCC的診斷價(jià)值。（4）以甲基化水平26.41%為臨界值，將患者分為高甲基化組（61例）和低甲基化組（28例），分析 LSCC組織 ESRRG基因啟動子甲基化水平與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，LSCC組織與癌旁正常組織ESRRG基因啟動子甲基化水平比較采用配對t檢驗(yàn)，不同臨床病理特征的LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；繪制ROC曲線評估ESRRG基因啟動子甲基化水平對LSCC的診斷價(jià)值，得出AUC、靈敏度、特異度；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSCC組織與癌旁正常組織ESRRG基因啟動子甲基化水平比較 見表1。

表1 LSCC組織與癌旁正常組織ESRRG基因啟動子甲基化水平比較（%）

由表1可見，LSCC組織ESRRG基因啟動子每個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化水平均高于癌旁正常組織（均P＜0.05）。6個(gè)CG位點(diǎn)甲基化水平的均值可以代表組織的甲基化水平，結(jié)果顯示LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平高于癌旁正常組織（P＜0.05）。

2.2 LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平與患者臨床病理特征的關(guān)系分析 見表2。

表2 LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平與患者臨床病理特征的關(guān)系分析

由表2可見，T3～4期患者LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平高于 T1～2期患者（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ期患者LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P＜0.05）。不同年齡、吸煙行為、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05）。

2.3 ESRRG基因啟動子甲基化水平對LSCC的診斷價(jià)值分析 見圖1。

圖1 ESRRG基因啟動子甲基化水平診斷LSCC的ROC曲線

由圖1可見，AUC為0.81，表明檢測ESRRG基因啟動子甲基化水平對診斷LSCC具有一定的診斷價(jià)值。當(dāng)ESRRG基因啟動子甲基化水平為26.41%時(shí)，診斷LSCC的靈敏度、特異度分別為0.7079、0.7865。此時(shí)，假陽性率和假陰性率分別為0.2135，0.2921，陽性預(yù)測值為0.7683，陰性預(yù)測值為0.7292，診斷符合率為74.72%。

2.4 LSCC組織ESRRG基因啟動子甲基化水平與患者預(yù)后的關(guān)系分析 在隨訪中，5例患者失訪（均為低甲基化組），低甲基化組患者4例死亡，高甲基化組患者28例死亡，其余存活。生存曲線見圖2、3。

圖2 89例LSCC患者生存曲線

圖3 高甲基化組與低甲基化組患者生存曲線比較

由圖2可見，LSCC患者的5年生存率為52.65%。由圖3可見，ESRRG基因啟動子低甲基化組患者5年生存率高于高甲基化組患者（69.03%vs 45.12%，P＜0.05）。

3 討論

ESRRG蛋白為孤兒核受體，可在無天然配體的條件下發(fā)揮生物學(xué)作用。其主要通過結(jié)合相關(guān)基因啟動子序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用，而小分子配體可以加強(qiáng)（PGC-1α[12]、GRIP-1）或抑制（SHP、DAX-1[13]、SMILE[14]、GNL3L）ESRRG 對靶基因的轉(zhuǎn)錄作用。采用染色體免疫沉淀技術(shù)（CHIP）分析發(fā)現(xiàn)，ESRRG基因的靶基因有很多[15]，目前研究的靶基因包括代謝相關(guān)基因如己糖激酶 2（HK2）、甘油醛脫氫酶（GAPDH）及丙酮酸脫氫酶激酶4（PDK4）[16]等；細(xì)胞周期相關(guān)基因如p21、p27[8]等；細(xì)胞遷移相關(guān)基因如E-鈣黏附蛋白[17]、S100A4[18]等。因此，ESRRG基因與腫瘤細(xì)胞代謝、增殖、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。ESRRG與雌激素受體的高度同源主要位于ESRRG的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)，因此ESRRG在性別相關(guān)腫瘤中研究較多，發(fā)現(xiàn)其主要起抑制腫瘤的作用。

目前臨床診斷LSCC的方法主要包括影像學(xué)技術(shù)及內(nèi)鏡或支撐喉鏡下病理學(xué)活檢。影像學(xué)技術(shù)作為普查項(xiàng)目不實(shí)際，往往在晚期腫瘤患者癥狀明顯時(shí)考慮此技術(shù)，并且作為手術(shù)參考的輔助項(xiàng)目進(jìn)行；內(nèi)鏡或支撐喉鏡下病理學(xué)活檢目前仍是LSCC診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法是有創(chuàng)操作，也不適用于普查。LSCC治療方法主要以手術(shù)為主，放化療為輔，而晚期LSCC手術(shù)大大降低了患者的生活質(zhì)量，如通氣障礙、發(fā)聲障礙等。故尋求微創(chuàng)、簡便、早期診斷LSCC的腫瘤標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)有著重要意義。大量研究從分子遺傳角度對LSCC的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后進(jìn)行研究，而目前仍無巨大的突破，仍未有同甲胎蛋白、癌胚抗原等公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)，因此探索LSCC的分子遺傳學(xué)機(jī)制仍在繼續(xù)。目前所知，LSCC患者中大部分為男性。因此，臨床有理由推測男性中存在某種基因表達(dá)低于女性，而此基因具有抑制LSCC發(fā)生、發(fā)展的作用。

已有研究報(bào)道DNA高甲基化可導(dǎo)致LSCC抑癌基因表達(dá)下調(diào)，抑制癌癥進(jìn)展[19]。在LSCC組織中，高甲基化的基因有 CBY[20]、DAPK[21]等，這些基因都被視為LSCC的抑癌基因。本研究主要探討ESRRG基因啟動子在男性LSCC組織中的甲基化狀態(tài)，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并評估其對LSCC的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，ESRRG基因啟動子甲基化水平在男性LSCC組織中明顯高于癌旁正常組織，表明在男性LSCC組織中ESRRG基因的轉(zhuǎn)錄可能受到限制，從而減少了ESRRG蛋白的表達(dá)，加大了LSCC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此，ESRRG基因在LSCC中可能也發(fā)揮著抑癌作用。

在ESRRG基因啟動子甲基化水平與LSCC患者臨床病理特征的關(guān)系分析中發(fā)現(xiàn)，ESRRG基因啟動子甲基化水平與腫瘤T分期和臨床分期呈正相關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系。臨床分期是由TNM分期綜合評估的結(jié)果，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESRRG基因啟動子甲基化水平對臨床分期的影響主要是T分期引起的，因此筆者考慮ESRRG基因啟動子甲基化狀態(tài)可能在LSCC中主要對腫瘤大小起抑制作用，可能具有抑制腫瘤增殖的作用。同時(shí)ESRRG基因啟動子高甲基化可以預(yù)測腫瘤進(jìn)展情況，可為治療方案作一參考。此外，臨床還可通過降低患者ESRRG基因啟動子甲基化狀態(tài)抑制腫瘤進(jìn)展。研究報(bào)道，DNA甲基化狀態(tài)與患者的生活習(xí)慣有關(guān)[22]。在LSCC的研究中，p14、APC基因甲基化與吸煙、飲酒等相關(guān)[23]。而本研究中ESRRG基因啟動子甲基化水平與男性LSCC患者吸煙行為并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義，這提示ESRRG基因啟動子甲基化水平與吸煙因素?zé)o相關(guān)性，可能存在其他影響ESRRG基因啟動子甲基化的危險(xiǎn)因素。

腫瘤特異性標(biāo)志物一直以來是癌癥研究中的熱點(diǎn)話題，而目前尚無特異的腫瘤標(biāo)志物可以協(xié)助早期診斷LSCC及評估LSCC患者預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，ESRRG基因啟動子甲基化水平對診斷LSCC具有較高的靈敏度、特異度，分別為0.7079、0.7865。AUC表明ESRRG基因作為腫瘤標(biāo)志物具有一定的可靠性，具有較高的診斷價(jià)值。其可以與其他腫瘤標(biāo)志物，如上述CMTM3、miR-34a等基因進(jìn)行聯(lián)合診斷。有研究報(bào)道DNA甲基化狀態(tài)可納入癌癥的預(yù)后指標(biāo)[21]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，LSCC患者5年生存率約57%[3]。本研究中LSCC患者的5年生存率約52%，稍低于上述統(tǒng)計(jì)情況。將LSCC患者分成高、低甲基化組，對這兩組患者的5年生存率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)低甲基化組患者的5年生存率明顯高于高甲基化組，說明ESRRG基因啟動子高甲基化水平是影響LSCC患者預(yù)后的不良因素。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示ESRRG基因啟動子在LSCC組織中呈高甲基化水平，且在T3～4期及Ⅲ、Ⅳ期患者LSCC組織中明顯增高。ESRRG基因啟動子高甲基化LSCC患者預(yù)后較差。檢測ESRRG基因啟動子甲基化水平可為LSCC的診斷和靶向治療提供新思路，并為預(yù)后判斷提供新線索。