纖維蛋白膠復(fù)合脫蛋白小牛骨的成骨效果觀察

楊帆 陳建萍 王林紅

各類牙列的缺損和缺失大都同時伴有牙槽骨的缺損以及骨量不足等情況，通常需要進行骨增量手術(shù)以獲得種植修復(fù)足夠的骨量。目前，臨床上有多種多樣的骨替代品、屏障膜以及生長因子制劑等用來促進成骨[1]。自體骨被認為是骨增量的最好材料，但使用自體骨需要增加手術(shù)部位、存在潛在并發(fā)癥、延長手術(shù)時間等，大大限制了其臨床應(yīng)用[2]。脫蛋白小牛骨（deproteinized bovine bone mineral,DBBM）是目前臨床使用最為廣泛的一類人工骨增量材料，且具有良好的引導(dǎo)成骨性能及可靠的臨床效果。但DBBM呈顆粒狀難以塑形，而骨缺損區(qū)域大多形態(tài)不規(guī)則；且DBBM不具備任何的機械強度，移植后在口腔內(nèi)受黏膜及口唇肌肉活動、義齒的壓迫等容易發(fā)生變形、移位、散落在軟組織中以及被吸收等。因此，尋找可促使顆粒狀骨增量材料任意塑形，有一定機械強度且不阻礙其成骨效果的支架材料，可有效解決骨增量材料的缺陷，顯著提高骨增量手術(shù)的臨床效果。

纖維蛋白膠（fibrin glue,FG）是臨床上常用的一種生物粘合劑，具有較強的粘結(jié)能力，能夠止血、促進組織修復(fù)、血管再生，具有極強的可塑性、生物相容性，常作為載體材料攜帶細胞和生長因子在體內(nèi)發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[3-4]。臨床上可以通過調(diào)整纖維蛋白原和凝血酶的濃度來調(diào)整FG的凝固時間，配置成可注射型的纖維蛋白液體[5]，凝固后可以任意塑形并具有一定的粘彈性，可作為一種支架材料填充任何幾何形狀的骨缺損間隙[1，6]，但是，F(xiàn)G 的降解速度較快、力學(xué)性能低，因此往往需要聯(lián)合使用其他材料來克服這些缺陷。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細胞及β-磷酸三鈣（β-TCP）可促進修復(fù)股骨缺損[7]；FG作為攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）的載體，可防止BMP-2快速釋放同時促進成骨[8]；FG與一些骨增量材料聯(lián)合使用，可發(fā)揮理想的骨增量效果[9]。目前臨床上較為廣泛應(yīng)用的DBBM類骨增量材料是進口的Bio-oss和國產(chǎn)的海奧骨修復(fù)材料。但這類DBBM材料本身只有骨引導(dǎo)作用，而聯(lián)合應(yīng)用DBBM能否增強FG骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)的雙重性能目前仍不明確?；诖?，本實驗擬通過將兩種不同的DBBM與FG復(fù)合來修復(fù)兔顱骨極限骨缺損，通過微計算機斷層掃描（Micro-CT）以及硬組織切片染色觀察FG復(fù)合DBBM的成骨效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 骨增量材料：Bio-oss（瑞士Geistlish公司），海奧骨修復(fù)材料（山東正海生物公司，HA）。FG（上海護固萊士公司），HKM種植機（德國HKM公司），16∶1 Nurvag種植機手機（瑞士 Nurvag公司），Micro-CT機（瑞士SCANCO公司），1600P型硬組織切片機（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 兩種DBBM/FG復(fù)合材料構(gòu)建 FG主要由纖維蛋白原、凝血酶、無菌水和氯化鈣4個組分組成，用5ml無菌水溶解200mg纖維蛋白原，置于37℃水浴中孵化15～20min至完全溶解，配比成25～45mg/ml的纖維蛋白原溶液。將凝血酶溶解于40mmol/L氯化鈣溶液中，制備成50U/ml的凝血酶溶液。將配比好的纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液按1∶1等體積混合好后立即分別與Bio-oss骨粉顆粒及HA骨粉顆粒按粉末/液體質(zhì)量體積比（g/ml）1∶1[10]在 48 孔板內(nèi)混合，并攪拌均勻，制備成直徑約10mm的Bio-oss/FG復(fù)合材料及HA/FG復(fù)合材料。

1.2.2 實驗分組與動物實驗 實驗動物為成年健康新西蘭兔24只（由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室提供），體重2.5～3.0 kg，雌雄不限，按隨機數(shù)字表法分為6組：Bio-oss組、Bio-oss/FG組、HA組、HA/FG組、FG組和空白組，每組4只。新西蘭兔術(shù)前4h禁食、禁水，標記后稱量體重，采用3%戊巴比妥鈉0.5ml/kg耳緣靜脈注射聯(lián)合0.5ml/kg鹽酸賽拉嗪注射液肌肉注射麻醉；待麻醉起效后，常規(guī)消毒，鋪巾，沿兔顱骨矢狀縫位置作長約3～4cm縱切口，直達骨面，剝離黏骨膜，用種植機及直徑10.5mm的環(huán)形鉆制備直徑約10mm的圓形骨缺損區(qū)，每只新西蘭兔制備2個骨缺損區(qū)。備洞過程中使用4℃的0.9%氯化鈉溶液持續(xù)冷卻，貫穿全層至硬腦膜，并保持硬腦膜的完整性。按照分組植入相應(yīng)材料，止血后分層對位縫合，待新西蘭兔復(fù)蘇后送回飼養(yǎng)箱，術(shù)后即刻、24h、48h分別肌肉注射青霉素8萬U預(yù)防感染。術(shù)后4、8周分批處死新西蘭兔，取出骨缺損區(qū)及其組織，4%多聚甲醛固定，每個時間點留取每組骨片標本各4份，實驗步驟符合動物實驗相關(guān)的倫理要求進行。

1.3 觀察指標

1.3.1 Micro-CT檢查 所有骨片標本應(yīng)用Micro-CT機掃描。掃描條件設(shè)置為：電壓50kV，電流200μA，使用0.5mm鋁制過濾器，360°旋轉(zhuǎn)，空間分辨率為18.26μm。數(shù)據(jù)用圖像分析軟件（CT-analyzerTM，Skyscan）選擇直徑12mm、高度5mm的植入圓柱體作為感興趣區(qū)域（ROI）。利用 Microview 軟件（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.）對掃描的骨片進行高分辨率重建，顯示植入物的新生骨形成情況，計算相對骨體積（BV/TV）。

1.3.2 硬組織切片染色 所有骨片標本在Micro-CT掃描后制備硬組織切片，標本先用梯度乙醇（80%～100%）進行脫水后，滲透，包埋。然后將標本垂直于短軸鋸成10～13片100～200μm厚的切片，然后手工磨片，最后完成的切片厚度30～50μm。按照標準程序進行Mc-Neal染色。每張切片隨機取5個視野，在顯微鏡下觀察其成骨情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 6組新西蘭兔骨片標本Micro-CT下新生骨形成情況比較 6組新西蘭兔術(shù)后4、8周骨片標本Micro-CT橫斷面三維重建結(jié)果見圖1。術(shù)后4周，空白組中可見少量新生骨形成，且新生骨均出現(xiàn)在缺損周圍與顱骨相接處，而FG組中四周新生骨形成較少；術(shù)后8周，空白組顱骨缺損并不能完全愈合，而FG組新生骨的面積范圍相對于空白組更多。Bio-oss組與Bio-oss/FG組在術(shù)后4周及術(shù)后8周時新生骨形成情況比較并沒有很大的差異，但術(shù)后8周的Bio-oss組、Bio-oss/FG組比術(shù)后4周時的新生骨密度高；而HA組與HA/FG組結(jié)果相反，術(shù)后8周時HA/FG組較HA組新生骨密度低。對于FG組和空白組，骨缺損修復(fù)開始于缺損周圍，而Bio-oss組及其他各組骨修復(fù)開始于缺損周圍及缺損中間骨植入物充填區(qū)。

圖1 6組新西蘭兔骨片標本Micro-CT橫斷面三維重建圖

對骨缺損區(qū)行Micro-CT定量分析，術(shù)后4周時，6組新西蘭兔骨片標本BV/TV值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Bio-oss/FG組的BV/TV值高于Bio-oss組，HA/FG組的BV/TV值高于HA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且Bio-oss/FG組、HA/FG組均明顯高于FG組和空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。術(shù)后8周時，6組新西蘭兔骨片標本BV/TV值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但Bio-oss/FG組的BV/TV值與Bio-oss組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HA/FG組的BV/TV值與HA組比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

表1 6組新西蘭兔骨片標本Micro-CT定量分析結(jié)果（BV/TV值）比較（%）

2.2 6組新西蘭兔骨片標本硬組織切片染色下新生骨形成情況比較 6組新西蘭兔骨片標本術(shù)后4、8周時硬組織切片染色結(jié)果見圖2。Bio-oss組術(shù)后4周時，多數(shù)骨粉顆粒周圍可見少量新生骨，部分骨粉顆粒被纖維結(jié)締組織包繞；術(shù)后8周時，骨粉顆粒周圍纖維結(jié)締組織數(shù)量較少，多數(shù)被新生骨圍繞，相互聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀或片狀。Bio-oss/FG組術(shù)后4周時，多數(shù)骨粉顆粒表面被纖維結(jié)締組織包繞，骨粉表面直接成骨較單純Bio-oss組數(shù)量少，但靠近硬腦膜處可見較多新生骨；術(shù)后8周時，骨粉顆粒周圍新生骨數(shù)量明顯增加，骨粉顆粒周圍纖維結(jié)締組織數(shù)量極少，基本上完全被新生骨圍繞，相互聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀或片狀。HA組術(shù)后4周時，骨粉顆粒形狀大小各不一，部分顆粒表面可見新生骨形成；術(shù)后8周時，新生骨的數(shù)量明顯大于纖維結(jié)締組織，大多數(shù)顆粒上的骨陷窩內(nèi)充滿著骨細胞，有些顆粒邊緣不規(guī)則，呈鋸齒狀，并可見到破骨細胞的存在。HA/FG組術(shù)后4周時，骨粉顆粒周圍及中間均可見較多的新生骨形成；術(shù)后8周時HA顆粒形狀極為不規(guī)則，顆粒大部分被吸收，被新生骨質(zhì)代替，骨陷窩內(nèi)充滿著成骨細胞及破骨細胞。FG組術(shù)后4周時，在骨缺損交界面有少量的反應(yīng)性新生骨形成，新生骨生成的厚度明顯薄于缺損區(qū)域原有的骨組織厚度，并且其厚度越往缺損區(qū)域中間越薄?？瞻捉M與FG組類似，在骨缺損交界處有少量新生骨形成，新生骨厚度明顯薄于原有骨組織厚度，并且其厚度越往缺損區(qū)域中間越薄。

3 討論

本實驗通過兔顱骨極限骨缺損模型觀察兩種不同的DBBM與FG復(fù)合后的成骨效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純FG并不能促進成骨，F(xiàn)G與兩種不同的DBBM復(fù)合后在早期（術(shù)后4周）能促進成骨，但在術(shù)后8周時效果與單純應(yīng)用DBBM類似。另外，F(xiàn)G與顆粒狀的DBBM復(fù)合后，有較好的塑形作用，可以將骨粉顆粒緊密地連接固定在一起并在骨缺損區(qū)域維持一定的形狀，防止骨粉顆粒發(fā)生移位、散開，有效的提高了骨粉顆粒的力學(xué)性能[11]。

圖2 6組新西蘭兔骨片標本術(shù)后硬組織切片染色情況比較（NB：新生骨；FT：纖維結(jié)締組織；BP:骨粉顆粒；Mc-Neal染色，×40）

本實驗結(jié)果顯示，兩組DBBM/FG成骨效果無統(tǒng)計學(xué)差異，在術(shù)后4周時均有成骨促進作用，但在術(shù)后8周時并沒有較大的作用。分析原因可能是因為FG的降解速度大約為10～14d左右[12]，在這2周內(nèi)，DBBM顆粒周圍黏附的FG發(fā)揮了其生物學(xué)作用，促進了微血管的生成，微血管的生成同時也可以促進硬腦膜表面的骨膜下成骨[13-14]。另外，F(xiàn)G有骨誘導(dǎo)作用，能誘導(dǎo)周邊組織中的骨原細胞、成骨前體細胞，趨化、定性分化為成骨細胞[15]；因此，在早期FG有促進成骨的作用。但到了術(shù)后8周的時候，F(xiàn)G已經(jīng)完全降解，不再有生物學(xué)作用[12]。DBBM的成骨方式是顆粒表面直接引導(dǎo)成骨，顆粒表面有較多的新生骨生成，而DBBM/FG顆粒表面因為FG的黏附并沒有很多的顆粒表面的直接成骨，甚至反而可能阻止了DBBM顆粒表面的直接成骨作用[16]。另一個原因可能是術(shù)后8周時骨粉顆粒之間原先被FG占據(jù)的空間因為FG的快速吸收而致骨粉顆粒之間的間隙增大，容易被周圍的纖維結(jié)締組織長入，不能夠維持成骨所必需的空間。因此，兩組DBBM/FG并沒有表現(xiàn)出比單純DBBM組更好的成骨作用。

另外，目前臨床關(guān)于FG是否能促進成骨仍然是一個有爭議的話題。不同品牌、不同濃度的纖維蛋白原與凝血酶配比、與成骨材料的不同配比濃度等條件均會影響FG的成骨效果[3]。有研究指出，在Bio-oss顆粒中添加纖維蛋白后會導(dǎo)致骨與生物材料之間的組織接觸減少，影響犬下頜骨缺損的修復(fù)[17]。Bosch等[18]指出異種纖維蛋白在修復(fù)骨愈合過程中會由于局部的免疫反應(yīng)而影響成骨，而同源纖維蛋白促進毛細血管和結(jié)締組織細胞的生長而加速新骨形成。也有研究認為高濃度纖維蛋白原（35～55mg/ml）會阻止細胞的遷移、浸潤并導(dǎo)致骨延遲愈合[19]。

本實驗同時也比較了兩種不同的DBBM的成骨效果，結(jié)果顯示Bio-oss/FG和HA/FG復(fù)合材料均具有良好的骨修復(fù)效果，兩組復(fù)合材料的成骨效果在術(shù)后4、8周時BV/TV值比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。Bio-oss和HA的主要成分都是羥基磷灰石，主要區(qū)別是Bio-oss是完全脫蛋白小牛骨，只保留了無機成分；而HA是部分脫蛋白小牛骨，保留了原骨松質(zhì)中的Ⅰ型膠原蛋白成分。Bio-oss作為支架材料僅具有骨引導(dǎo)效果，其成骨方式是骨顆粒周邊直接引導(dǎo)成骨，顆粒與新生骨組織緊密接觸，而Bio-oss顆粒本身似乎很難被替代，最終形成顆粒與新生骨完全融合在一起的新生骨組織。在HA組，因為HA組顆粒里面含有Ⅰ型膠原蛋白及β-TCP，F(xiàn)G的降解同時也伴隨著膠原和β-TCP的降解，在硬組織切片上有些區(qū)域可見新生的類骨質(zhì)沉積于新骨表面或HA顆粒表面，大多數(shù)HA顆粒上的骨陷窩內(nèi)充滿著骨細胞，有的HA邊緣不規(guī)則，呈鋸齒狀的吞蝕現(xiàn)象，并可見到破骨細胞的存在，最后HA顆粒部分被吸收并且與新生骨組織完全融為一體。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示FG與顆粒狀的DBBM復(fù)合，可將骨粉顆粒緊密的連接在一起，有很好的塑形作用，而且在短期內(nèi)有促進成骨作用，同時不影響其長期的成骨作用，因此臨床上可根據(jù)具體情況選擇性應(yīng)用FG。