鮮活螺旋藻臭氧殺菌效果研究

禹紹周 林慧純 張書(shū)迪 張偉 黃水林 王維部 張碧松 盧運(yùn)明

摘要 [目的]開(kāi)發(fā)出有效的鮮活螺旋藻殺菌方法，以延長(zhǎng)鮮活螺旋藻的保質(zhì)期，提升其感官和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。[方法]將鮮活螺旋藻分散成懸浮液，用曝氣石將臭氧發(fā)生儀產(chǎn)生的臭氧通入懸浮液中，檢測(cè)懸浮液菌落總數(shù)隨通氣時(shí)間變化而變化的情況?？疾炝藨腋∫簼舛群腕w積對(duì)殺菌效果的影響，還考察了殺菌前后螺旋藻的形態(tài)變化。[結(jié)果]在同等體積下，螺旋藻濃度越小，殺菌效果越好;在同等濃度下，藻液體積小到一定程度之后，殺菌效果才有較為明顯的提升;臭氧基本不會(huì)對(duì)螺旋藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞。[結(jié)論]該研究開(kāi)發(fā)的臭氧殺菌法是一個(gè)理想的鮮活螺旋藻殺菌選項(xiàng)。

關(guān)鍵詞 鮮活螺旋藻;臭氧;殺菌;細(xì)胞結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào) S984.4+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）13-0155-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.048

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research on Ozone Sterilization Effect of Fresh Spirulina

Abstract [Objective]Effective sterilization methods of fresh Spirulina were developed to prolong the shelf life and enhance its sensory and nutritional value. [Method]The fresh Spirulina was dispersed into a suspension， and the ozone generated by the ozone generator was introduced into the suspension by aeration stone to detect the change of the total number of suspension colonies with the change of the ventilation time.The effects of suspension concentration and volume on the bactericidal effect were investigated. The morphological changes of Spirulina before and after sterilization were also investigated.[Result]In the same volume， the smaller the concentration of Spirulina， the better the sterilization effect.At the same concentration， the bactericidal effect was significantly improved when Spirulina volume was small to a certain extent.Ozone didnt damage the cell structure of Spirulina.[Conclusion]The ozone sterilization method developed in this study is an ideal sterilization option for fresh Spirulina.

Key words Fresh Spirulina;Ozone;Sterilization;Cellular structure

基金項(xiàng)目 深圳市戰(zhàn)略新興和未來(lái)產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金項(xiàng)目（2017050316 3617880）。

作者簡(jiǎn)介 禹紹周（1977—），男，黑龍江哈爾濱人，農(nóng)藝師，從事食用農(nóng)產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)分析研究。*通信作者，博士，從事食品安全檢測(cè)與分析研究。

收稿日期 2019-04-22;修回日期 2019-05-06

螺旋藻的生存歷史非常悠久，在地球上已經(jīng)存在了35億年，是一種靠分裂增殖的光合自養(yǎng)型藍(lán)藻。它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪酸、生物活性物質(zhì)等，幾乎包含了所有人體正常運(yùn)轉(zhuǎn)所需要的營(yíng)養(yǎng)素[1]。螺旋藻的蛋白質(zhì)占其干重的58.5%～83.4%[2]，比常見(jiàn)的肉類、蛋奶類和豆類都要高，而其氨基酸組成又非常符合人體對(duì)氨基酸的需求比例。螺旋藻的維生素含量高、種類多，可多達(dá)13種，以維生素B、維生素E、維生素K為主，此外還有藻藍(lán)素和β胡蘿卜素，而β胡蘿卜素又是合成維生素A必不可少的物質(zhì)。螺旋藻含有50多種不同的礦物質(zhì)，其中以碘、鉀、鈉、鎂等礦物質(zhì)為主。螺旋藻所含的脂肪中大多數(shù)都是對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸，尤其是γ-亞麻酸，占其干重的1.1%[3] 。螺旋藻的細(xì)胞壁基本由肽聚糖組成，纖維素組成只占細(xì)胞壁的4%～5%，可以很容易地破壞細(xì)胞壁，其消化率高達(dá)76%[3]。除了以上常見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，螺旋藻還含有各種生物活性物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，它們能夠有效地去除人體中的過(guò)氧化物和自由基，起到抗衰老、預(yù)防高血壓、心臟病等功能。由于螺旋藻卓絕的“食藥同源”特性，它被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）譽(yù)為“21世紀(jì)最佳理想食品”，也被世界衛(wèi)生組織評(píng)為“21世紀(jì)的最佳保健品”[4]。

雖然螺旋藻有著如上令人艷羨的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但是它也存在一些不足之處，那就是鮮活螺旋藻不易保存。剛剛采收的新鮮螺旋藻無(wú)不良?xì)馕?，但若將其放在室溫下?0 ℃），在一天之內(nèi)它就會(huì)因?yàn)槲⑸锘顒?dòng)等原因變質(zhì)，細(xì)胞破裂后里面的蛋白質(zhì)等物質(zhì)被微生物分解后會(huì)產(chǎn)生令人不快的氣味。通常的應(yīng)對(duì)辦法是將新鮮采收的螺旋藻進(jìn)行脫水處理，包括自然晾干、低溫烘干、真空凍干、微波干燥、噴霧干燥等方法[5-6]，有的研究者還對(duì)干燥后的螺旋藻進(jìn)行了輻照殺菌、臭氧殺菌等處理[7-8]，最后得出的產(chǎn)品為粉狀、片狀或者膠囊狀的制劑，雖然能夠保存較長(zhǎng)的時(shí)間，但是其性狀對(duì)消費(fèi)者而言不太具備吸引力，而且干燥會(huì)對(duì)螺旋藻中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)造成不同程度的損失，降低了其原本具有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-10]。在此背景下，開(kāi)發(fā)一種能夠?qū)︴r活螺旋藻進(jìn)行有效殺菌的辦法顯得至關(guān)重要，這樣既能保持螺旋藻原有的狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又能延長(zhǎng)螺旋藻的保質(zhì)期，為其進(jìn)一步深加工運(yùn)用等打下良好的基礎(chǔ)。筆者擬開(kāi)發(fā)一種針對(duì)鮮活螺旋藻的臭氧殺菌方法，分別考察和討論了藻液濃度、藻液體積對(duì)殺菌效果的影響程度，并用顯微鏡檢查了殺菌前后螺旋藻細(xì)胞形態(tài)的變化，說(shuō)明此鮮活螺旋藻臭氧殺菌方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

試驗(yàn)所用胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、氯化鈉等化學(xué)藥品均購(gòu)自深圳銘科科技有限公司，所用超純水為實(shí)驗(yàn)室超純水制備儀所產(chǎn)一級(jí)水，螺旋藻泥為實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的小型螺旋藻培養(yǎng)機(jī)上采收的藻泥，培養(yǎng)時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)Zarrouk培養(yǎng)基，采用間歇式光照和正壓鼓氣方式，將采收到的藻泥用自來(lái)水清洗3次到pH近7.0，暫不用到的藻泥放在-20 ℃下保存至試驗(yàn)日。

無(wú)菌生理鹽水：稱取8.5 g氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，在121 ℃下高壓滅菌15 min。

瓊脂培養(yǎng)基：分別稱取適量胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂加入蒸餾水中，加熱煮沸溶解并調(diào)節(jié)pH至7.0左右，在121 ℃下高壓滅菌15 min。

1.2 設(shè)備

高壓滅菌鍋（MLS-3750，Sanyo）;電子天平（BSM2203，上海卓精電子科技有限公司）;恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;菌落計(jì)數(shù)器（ALN-50S，上海昂尼儀器儀表有限公司）;臭氧消毒機(jī)（FL-802A，深圳市飛立電器科技有限公司）;多功能數(shù)碼液晶顯微鏡（US3，深圳市愛(ài)科學(xué)數(shù)碼科技有限公司），另外還有無(wú)菌吸管、50 mL離心試管、培養(yǎng)皿、臭氧曝氣石等。所有與藻液直接接觸的玻璃器皿、曝氣石等都事先在121 ℃下高壓滅菌并烘干處理。

1.3 方法

稱取200、100、50和20 g螺旋藻泥樣品，分別用1.0、1.0、0.5、0.2 L無(wú)菌生理鹽水配制成螺旋藻濃度為200、100、100、100 g/L藻液。將曝氣石與臭氧殺菌器上的出氣口用硅膠軟管相連，將曝氣石放入藻液中，開(kāi)啟臭氧殺菌器通入臭氧進(jìn)行滅菌，臭氧產(chǎn)量為2 g/h，滅菌時(shí)間分別為0、10、20、30、40、50和60 min，每到一個(gè)時(shí)間點(diǎn)后混勻藻液并從中取出1 mL的藻液待測(cè)。

將上述1 mL待測(cè)藻液加入到裝有9 mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌試管中，混勻后制備成1∶10稀釋的樣品均液。吸取1 mL上述稀釋后的均液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并取15～20 mL無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基導(dǎo)入培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，待其冷卻凝固后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，并在36 ℃下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出平板，并在菌落計(jì)數(shù)器上進(jìn)行計(jì)數(shù)并進(jìn)行最后的換算，結(jié)果取2次平行的平均值并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

考察了相同體積下的藻液濃度和相同濃度下的藻液體積對(duì)殺菌效果的影響。在第1次（200 g/L，1.0 L）、第2次（100 g/L，1.0 L）、第3次（100 g/L，0.5 L）和第4次（100 g/L，0.2 L）殺菌試驗(yàn)下，菌落總數(shù)隨殺菌時(shí)間的增長(zhǎng)變化情況如表1所示。

2.1 懸浮液濃度對(duì)殺菌效果的影響

將表1中第1次試驗(yàn)（200 g/L，1.0 L）和第2次試驗(yàn)（100 g/L，1.0 L）結(jié)果分別進(jìn)行歸一化處理并將數(shù)據(jù)合并，得到圖1所示結(jié)果。從圖中可以看到，在殺菌40 min之前，臭氧對(duì)200 g/L藻液的殺菌效果和對(duì)100 g/L藻液的殺菌效果幾乎沒(méi)有差別，甚至高濃度藻液的殺菌效果還稍微好一點(diǎn)。在殺菌40～60 min時(shí)，100 g/L藻液的殺菌效果比200 g/L的要好，殺菌結(jié)束后200 g/L藻液的殺菌率只有74%，而100 g/L藻液的殺菌率接近90%，殺菌效果更好。這有可能是因?yàn)?00 g/L藻液初始狀態(tài)下細(xì)菌密度更高，接觸到臭氧的概率更大，所以剛開(kāi)始?xì)⒕Ч?而100 g/L藻液總體細(xì)菌數(shù)量更少，所以到最后時(shí)即使殺菌絕對(duì)數(shù)量比200 g/L藻液少，但殺菌率還是更高。

2.2 懸浮液體積對(duì)殺菌效果的影響

將表1中第2次試驗(yàn)（100 g/L，1.0 L）、第2次試驗(yàn)（100 g/L，0.5 L）和第3次試驗(yàn)（100 g/L，0.2 L）結(jié)果分別進(jìn)行歸一化處理并將數(shù)據(jù)合并，得到圖2所示結(jié)果。從圖中可以看到，1 L藻液的初期殺菌速度較快，結(jié)合“2.1”的觀察結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)一個(gè)規(guī)律，即初始細(xì)菌總數(shù)絕對(duì)值大的試樣初期殺菌效果更好。當(dāng)殺菌超過(guò)30 min后，1.0 L和0.5 L的殺菌效率曲線開(kāi)始重合并一直到殺菌結(jié)束;而殺菌10 min后，0.2 L藻液的殺菌效率開(kāi)始遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)

另外2份藻液，其最終殺菌率（94%）也比另外2份藻液高（90%、88%）。這可能是由于0.2 L藻液的體積較小，單位體積能夠溶解的臭氧含量更高，那么隨著臭氧通氣時(shí)間的增加藻液中臭氧濃度也逐漸高于另外2份藻液，殺菌效果自然也就更高。

2.3 殺菌對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

有些細(xì)胞在臭氧的作用下會(huì)破裂死亡或者產(chǎn)生其他不良影響。為了考察臭氧對(duì)螺旋藻細(xì)胞的影響，取殺菌前后（60 min）的藻液分別在40×和100×放大倍數(shù)下拍照，結(jié)果如圖3所示。不論是在40×還是100×放大倍數(shù)下觀測(cè)都可以看出，殺菌前后的螺旋藻細(xì)胞形態(tài)基本沒(méi)有變化，還保持著完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和活性，即臭氧不會(huì)對(duì)螺旋藻造成嚴(yán)重的破壞。

3 結(jié)論

筆者考察了螺旋藻液濃度、體積對(duì)臭氧殺菌效果的影響，發(fā)現(xiàn)藻液中細(xì)菌總數(shù)絕對(duì)值越高，其殺菌初期的殺菌效果越好，這可能是初期細(xì)菌濃度較高，被臭氧殺死的概率也較高的原因;而當(dāng)藻液體積下降到一定程度后，殺菌效果會(huì)顯著提升，這可能是因?yàn)橐后w體積小，單位體積上溶解的臭氧含量更高的緣故。最后，考察了臭氧殺菌對(duì)螺旋藻細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)螺旋藻對(duì)臭氧具有較強(qiáng)的抗性，臭氧不會(huì)對(duì)螺旋藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重的破壞。所有上述結(jié)果表明該鮮活螺旋藻臭氧殺菌辦法是較為可行的。

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