腎纖維化診斷生物標志物研究進展

劉秋玉，劉偉偉，高建東

(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腎病科 上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)腎病研究所 肝腎疾病病證教育部重點實驗室(上海中醫(yī)藥大學)上海市中醫(yī)臨床重點實驗室(14DZ2273200),上海 201203)

近年來，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患病率逐年升高。據(jù)報道，中國成人CKD患病率高達13.4%，極大增加了國家的醫(yī)療負擔[1]。腎纖維化是CKD的標志，CKD的嚴重程度通常與腎纖維化程度相關[2]。腎纖維化主要包括腎小球硬化、腎小管間質纖維化和腎內血管硬化，其病理特征表現(xiàn)為腎臟固有細胞損傷、炎癥細胞浸潤、肌成纖維細胞和成纖維細胞的活化和增殖、細胞外基質(膠原纖維、纖連蛋白、層粘連蛋白)堆積、腎臟固有細胞丟失、腎小管萎縮塌陷和血管稀疏化，最終導致腎臟正常結構破壞。腎纖維化標志著不可逆性腎損傷， 因此早期診斷腎纖維化和針對病因進行治療是延緩CKD進展的關鍵。目前，超聲和磁共振成像等影像學方法用于評估CKD患者的腎纖維化，但這些技術只能從宏觀水平上診斷腎纖維化，無法敏銳地捕捉腎纖維化炎癥反應期的微觀病變信息。而生物標志物既能評估或定量測量某種疾病的生物學和病理學進程，同時也可作為疾病的治療靶點[3]。生物標志物參與了疾病進程的各個環(huán)節(jié)，其水平隨著疾病進程的活動或進展程度而不斷變化。故確定腎纖維化的最佳生物標志物，有助于早期準確診斷腎纖維化和靶向性防治CKD。現(xiàn)就腎纖維化診斷生物標志物研究進展予以綜述。

1 腎臟損傷類標志物

1.1胱抑素 C(cystatin C，CysC) CysC是分子量為13 000的小分子蛋白質，因其分子量小，故可通過腎小球濾過膜。血液中的CysC不易與其他蛋白質結合，只能通過腎臟排泄，而腎小管不能直接分泌CysC，CysC經(jīng)腎近曲小管重吸收后被完全代謝分解[4]。CysC是評價腎小球濾過功能的良好指標。許洪濤等[5]提出，CysC不但是一個能更準確、更敏感反映早期腎疾病的指標，且在CKD早期診斷與分期中具有重要臨床價值。姚衛(wèi)國等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，在IgA腎病腎小球硬化大鼠模型中，血/尿CysC 水平與腎小球硬化積分和腎小管間質纖維化積分呈正相關，提示血/尿CysC水平可能是反映IgA腎病腎小球硬化和腎小管間質纖維化程度的可靠指標。

1.2腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)/甲型肝炎病毒細胞受體1 KIM-1屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白的一種，其由受損的近端腎小管上皮細胞表達。Zhou等[7]的研究表明，在慶大霉素、汞或鉻誘導的三種急性腎損傷模型中，與其他近端腎小管的毒性生物標志物(尿素氮、血肌酐、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶)相比，尿KIM-1具有較高的敏感性和特異性。在臨床研究中，尿KIM-1被證實是腎小管損傷的早期診斷指標[8]。此外，KIM-1主要在炎癥和纖維化區(qū)域內的去分化近端腎小管上皮細胞的腔側表達，這意味著KIM-1可能在腎小管間質纖維化過程中起作用[9]。

1.3視黃醇結合蛋白(retinol-binding protein,RBP) RBP是肝細胞產(chǎn)生的低分子量蛋白。臨床上，RBP是反映腎近端小管損傷的敏感指標，當腎近端小管損傷時，尿中的RBP明顯增多[10]。Pallet等[11]通過連續(xù)測量189例腎臟活檢患者尿中的低分子量蛋白(RBP、β2-微球蛋白、α1-微球蛋白)、高分子量蛋白(白蛋白、轉鐵蛋白、IgG)和總蛋白發(fā)現(xiàn)，低分子量蛋白尿水平與腎間質纖維化程度呈正相關，尿RBP與CKD患者的腎間質纖維化程度獨立相關。因此，臨床可以通過測量RBP水平評估CKD患者的腎間質纖維化程度。

1.4中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) NGAL是分子量為2 500的脂質運載蛋白，其在受損的腎小管中高表達，是急性腎損傷最有效的標志物之一。有學者使用微陣列研究了53個CKD腎活檢標本，并用活檢標本的微陣列基因表達譜來計算分子評分，結果發(fā)現(xiàn)NGAL和KIM-1等的表達水平發(fā)生改變，且與腎小管間質纖維化和腎小管細胞損傷的嚴重程度相關[12]。因此，NGAL和KIM-1可作為預測腎小管間質纖維化和腎小管細胞損傷的生物標志物。

2 炎癥和促纖維化因子類標志物

2.1單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1 ,MCP-1) 在腎纖維化早期，炎癥反應起至關重要的作用。炎癥趨化因子，特別是MCP-1，通過聚集炎癥細胞，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用。MCP-1不但能檢測狼瘡腎炎中的間質炎癥和纖維化[13]，而且在蛋白尿出現(xiàn)之前，可以檢測1型糖尿病腎病早期病變[14]。此外，尿MCP-1有助于評估2型糖尿病腎病患者的腎纖維化程度[15]。Mansour等[16]提出，MCP-1與活檢組織中的纖維化有一定的相關性。研究表明，尿MCP-1可以檢測到腎功能正常成人早期的腎小管間質纖維化[17]。作為隱匿性腎小管間質纖維化的生物標志物，尿MCP-1對早期診斷和干預腎纖維化具有重要意義。

2.2轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)β1TGF-β1是公認的纖維化指標，其參與了多種進行性腎病相關的腎纖維化和炎癥反應。TGF-β1參與腎纖維化主要有以下幾點：①參與炎癥反應，調節(jié)多種炎癥和促纖維化因子。②誘導腎臟固有細胞轉分化成肌成纖維細胞，刺激成纖維細胞活化和增殖，促進細胞外基質的產(chǎn)生。③調控基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)和組織型纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物1系統(tǒng)，抑制細胞外基質降解。當發(fā)生腎纖維化時，組織、血清和尿液中的TGF-β1水平明顯升高。劉江等[18]研究中指出，IgA腎病纖維化患者的尿TGF-β1/肌酐水平與腎小球、腎小管中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原呈顯著正相關。因此，尿TGF-β1/肌酐可作為腎纖維化活動性病變的臨床檢測指標。Kocer等[19]研究證明，在常染色體顯性多囊腎病腎纖維化中，血清TGF-β1水平明顯升高。Musia等[20]的研究顯示，CKD 3～5期患兒血清和尿液中的TGF-β1水平升高。

2.3MMPs/TIMPs MMPs是參與細胞外基質重構的含鋅內肽酶，其對組織發(fā)育和體內平衡至關重要。最初MMPs被認為僅切割細胞外基質蛋白質，但研究發(fā)現(xiàn)細胞黏附分子(鈣黏素和整聯(lián)蛋白)和生長因子及其受體等也是MMPs的底物[21]。而TIMPs是結合和抑制大部分MMPs的內源性抑制劑。研究表明，尿液和血清中的TIMP-1、TIMP-2、MMP-1、MMP-2、和MMP-9是腎纖維化的早期生物標志物[22-23]。此外，Zhou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，CKD患者的尿MMP-7水平與腎纖維化評分密切相關。在MMP-7基因敲除小鼠中，MMP-7的敲除改善了由阻塞性腎損傷誘導的纖維化病變和基質基因的表達[24]。尿MMP-9是反映移植腎早期和長期功能的生物標志物，MMP-9增加與腎小管萎縮和纖維化有關[25]。在正常情況下，MMPs/TIMPs系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)，一旦失衡將導致細胞外基質沉積，腎纖維化不可逆轉。

2.4人附睪蛋白4 (human epididymis protein 4, HE4) HE4是位于染色體20q12～13.1上的基因編碼的N-糖基化蛋白。它是促進腎纖維化的新型成纖維細胞衍生因子，也是泛絲氨酸蛋白酶、MMP-2和MMP-9的抑制劑。最初HE4被認為與精子成熟有關，后其被作為上皮性卵巢癌患者的血清生物標志物。Lebleu等[26]發(fā)現(xiàn)，HE4在人和小鼠腎臟組織中上調，它通過抑制絲氨酸蛋白酶35和絲氨酸蛋白酶23來防止Ⅰ型膠原的降解，促進腎纖維化。同時他們還發(fā)現(xiàn)，編碼HE4的基因是肌成纖維細胞中上調最多的基因，而肌成纖維細胞是形成腎纖維化的關鍵細胞，表明HE4介導了腎纖維化。Wan等[27]發(fā)現(xiàn)，CKD腎纖維化患者早期的血清HE4水平明顯升高，其血清水平與腎纖維化程度相關，說明HE4可作為早期預測腎纖維化的標志物。

3 微RNAs類生物標志物

微RNAs(microRNAs，miRNAs)是約20個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，其在生物體內通過轉錄后調節(jié)機制抑制基因表達。miRNAs在細胞增殖、分化、凋亡、器官發(fā)育、干細胞生物學、腫瘤發(fā)生和轉移以及免疫系統(tǒng)的功能調節(jié)中具有重要作用。其具有組織特異性，并在生物體液中穩(wěn)定存在。腎臟組織中的miRNAs可以用于腎纖維化的組織學檢測[28-29]。目前，miRNAs的定性定量檢測變得相對容易，故體液中的miRNAs成為無創(chuàng)生物標志物的理想來源。

CKD以腎纖維化為特征，TGF-β1是腎纖維化的關鍵因子，它能造成細胞外基質的累積并損害正常的腎功能。TGF-β/Smad3通路在組織纖維化中起重要作用，而miRNAs是TGF-β誘導的腎纖維化的核心成員。在腎損傷期間，TGF-β表達上調并刺激TGF-β1受體，激活Smad3途徑，從而調節(jié)腎纖維化中miRNAs的表達。目前，用于腎纖維化診斷的miRNAs主要有miR-21、miR-29、miR-192和miR-200[30]。

3.1miR-21 TGF-β1通過Smad3上調miR-21，miR-21通過靶向不同的基因來控制細胞外基質蛋白(膠原蛋白、纖維連接蛋白、上皮鈣黏素和α-平滑肌肌動蛋白)的合成，進而調節(jié)腎纖維化的進程。正常腎臟中miR-21低表達，但在腎臟疾病患者標本及CKD和急性腎損傷動物模型中，其豐度均大大增加。在梗阻性和糖尿病性腎病小鼠模型中，發(fā)生纖維化的腎小管間質和腎小球區(qū)域均觀察到高表達的miR-21[31-32]。有文獻報道，在糖尿病腎病小鼠的腎纖維化中，miR-21通過增加TIMP-1和減少MMP-9，最終導致細胞外基質沉積[32]。Liu等[33]認為，TGF-β調控組織腎纖維化的關鍵為鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸鹽，腎小管上皮細胞中鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸鹽與TGF-β活化后的miR-21存在關聯(lián)，兩者共同影響腎纖維化。Glowacki等[34]首次證明，血清miR-21可作為反映早期腎纖維化的一個可靠標志物。

3.2miR-29 在腎纖維化中，除miR-21外，miR-29家族(miR-29a、miR-29b1、miR-29b2、miR-29c)也廣泛參與了調控細胞外基質蛋白的生成。miR-29家族對大量的細胞外基質蛋白基因具有靶向作用，從而影響了多種細胞外基質蛋白的表達，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白及原纖維蛋白、MMP-2等[35-36]。在高糖培養(yǎng)基中或在TGF-β1誘導下，人腎臟近曲小管上皮細胞中的miR-29表達下調，且有助于多種膠原蛋白基因的表達。Lv等[37]研究表明，尿外泌體miR-29c可作為CKD患者腎功能和腎纖維化的生物標志物。此外有學者提出，狼瘡性腎炎患者尿外泌體中的miR-29c水平與組織學慢性指數(shù)和腎小球硬化呈負相關[38]。尿miR-29c與腎慢性程度的相關性，提示其可以用來反映和早期預測組織腎纖維化，是一種新型的非侵入性標志物[38]。

3.3miR-192 與其他器官相比，miR-192在正常腎臟中豐度較高[39]。體內外實驗表明，miR-192通過調控E盒結合鋅指蛋白1/2參與腎小管間質纖維化[40]。據(jù)報道，在阻塞性腎病、IgA腎病和高血壓性腎病引起的腎纖維化中，miR-192的表達均上調[41-43]。劉亞楠等[44]的研究表明，miR-192在幼年大鼠單側輸尿管結扎所致的腎間質纖維化模型中表達增加，其可能促進腎間質纖維化的形成。在難治性腎病綜合征患者中，尿miR-192水平有助于判斷腎小球細胞外基質蓄積及腎間質纖維化的程度[45]。

3.4miR-200 miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)通過抑制E盒結合鋅指蛋白1/2和TGF-β2來阻斷 TGF-β介導的上皮-間充質轉化。在不同的腎纖維化動物模型中，miR-200家族的表達量不相同。有學者在高血壓性腎小球硬化患者的腎活檢中發(fā)現(xiàn)，miR-200a、miR-200b、miR-141、miR-192、miR-205和miR-429在腎內的表達增加，且其上調程度與疾病的嚴重程度相關[43]。有研究表明，無論導致腎纖維化的是CKD、IgA腎病還是糖尿病腎病，其外泌體miR-200b水平均隨腎纖維化的進展而下降，且非近端腎小管來源的外泌體miR-200b是一種更好的腎纖維化生物標志物[46]。

近年來，新的miRNAs生物標志物不斷被發(fā)現(xiàn)。Lv等[47]研究表明，血清中的miR-130b能作為 2型糖尿病腎病腎纖維化的早期診斷標志物。石變華等[48]的研究顯示，在單側輸尿管梗阻大鼠模型中，miR-207在大鼠纖維化腎組織和尿液中表達上調，其為腎臟纖維化的診斷提供新靶點。

4 新型生物標志物

尋找可以精確定量腎纖維化的特異性生物標志物，有助于開發(fā)更有前景的腎纖維化治療方法。目前，已發(fā)現(xiàn)多種潛在的生物標志物，但其價值有待進一步研究。B細胞淋巴瘤/白血病-3(B-cell lymphoma/leukemia-3,Bcl-3)通過激活核因子κB通路誘導腎臟細胞免疫應答和細胞炎癥反應，參與腎臟纖維化。Chen等[49]研究發(fā)現(xiàn)，單側輸尿管梗阻小鼠模型腎組織中的Bcl-3信使RNA和蛋白水平均升高。同時他們還發(fā)現(xiàn)，CKD患者血清中的Bcl-3蛋白水平高于正常人，且與血清HE4水平高度相關。Bcl-3參與腎纖維化的機制可能為通過直接與Smad3結合，并保護Smad3蛋白免于泛素化和降解來調節(jié)TGF-β/Smad信號轉導途徑[50]。這些證據(jù)表明，Bcl-3可作為檢測腎纖維化的新型生物標志物。李曄等[51]發(fā)現(xiàn)，新纖維化相關因子表面活性蛋白A2在梗阻性腎組織中高表達，且隨著腎纖維化程度加重，表面活性蛋白A2的表達增加，提示表面活性蛋白A2可能參與了腎纖維化過程。Cho等[52]提出，人類腎臟活檢標本中的腎間質纖維化及小管萎縮和節(jié)段性腎小球硬化與血清Klotho蛋白水平降低相關，提示血清和尿Klotho均能預測腎纖維化。此外，血清半乳凝素-3、骨膜素、盤狀結構域受體1、尿波形蛋白信使RNA等也是有廣泛應用前景的潛在腎纖維化生物標志物。

5 小 結

CKD多呈隱匿性漸進性進展，初期癥狀不明顯。目前，評估和量化腎纖維化的金標準為腎活檢的病理染色，其中Masson三色染色是臨床診斷腎纖維化的首選方法，但病理學家主要通過視覺評估Masson三色染色的載玻片進行纖維化量化，缺乏對腎纖維化的標準化評估，具有很大的主觀性，且Masson三色染色可能對輕度纖維化不敏感。天狼星紅染色和免疫組織化學技術雖能區(qū)分不同類型的膠原纖維，但不能敏感診斷炎癥反應期的腎纖維化。而生物標志物參與了疾病進程的各個環(huán)節(jié)，能準確反映疾病的病理特征，它不僅能作為特異性診斷工具，也是疾病的治療靶點。根據(jù)腎纖維化形成的病理機制，從患者樣本(組織、血液、尿液)中尋找替代細胞外基質成分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原纖維、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等)的早期生物標志物，有助于早期精確診斷腎纖維化和靶向逆轉CKD。未來，借助基因組學、代謝組學和蛋白質組學等新興技術，篩選出敏感性、特異性高的腎纖維化診斷標志物或聯(lián)合多種標志物，有望取代經(jīng)典腎臟病理診斷。