張彥軍,洪霞,錢(qián)瀅文,*,王克輝,熊敏暉,王燕嬌,馬燕,尚欣春
(1.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司,甘肅 蘭州 730010;2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司,甘肅 蘭州 730010)
辣椒是世界上僅次于豆類、番茄的第三大蔬菜作物,在我國(guó)種植規(guī)模大、產(chǎn)品類別多樣、市場(chǎng)需求高,是我國(guó)最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)。辣椒中含有豐富的辣椒紅素、辣椒素、維生素、礦物質(zhì)等,具有很高的保健功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,有抗菌消炎、抗氧化、降低膽固醇、溶解血栓等方面的功效能增,為重要的蔬菜和調(diào)味品[1-2]。
咪鮮胺是一種咪唑類廣譜高效殺菌劑,其作用機(jī)理主要通過(guò)抑制麥角甾醇的生物合成,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能,從而達(dá)到殺菌目的,對(duì)辣椒枯萎病菌引起病害具有很好的保護(hù)和治療作用,用于防治辣椒的枯萎病[3-4]。咪鮮胺在環(huán)境中首先降解為N-丙基-N-[2-(2,4,6-trichlorophenol,2,4,6-三氯苯氧基)乙基]脲(BTS44595)和 N-醛基-N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]脲(BTS44596),后降解為 BTS45186[5-6],即 2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究咪鮮胺的毒性[7],咪鮮胺毒性較低,在推薦使用劑量范圍內(nèi),其對(duì)哺乳動(dòng)物的致突變作用、致癌作用以及致畸作用的危害較小。但2,4,6-TCP 作為咪鮮胺的最終降解物,已經(jīng)被確定為我國(guó)水體中的優(yōu)先污染物,是一種具有毒性、致突變性和致癌性的環(huán)境污染物,會(huì)對(duì)人類的健康造成潛在威脅[8],其殘留問(wèn)題受到越來(lái)越多的關(guān)注。
國(guó)內(nèi)外對(duì)于咪鮮胺和2,4,6-TCP 檢測(cè)的前處理,樣品提取液在210 ℃~240 ℃條件下與吡啶鹽酸鹽發(fā)生水解反應(yīng),將咪鮮胺及其代謝物全部轉(zhuǎn)化為2,4,6-TCP,經(jīng)石油醚提取后采用磺化法凈化,檢測(cè)2,4,6-TCP 的含量[9-11]。該方法操作復(fù)雜費(fèi)時(shí),且吡啶鹽酸鹽毒性較大,對(duì)試驗(yàn)人員的健康和環(huán)境安全造成威脅。QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe)為這一問(wèn)題提供了新的解決途徑,該方法利用N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)去除組份中的色素和油脂,以無(wú)水硫酸鎂去除水分,適用于辣椒中咪鮮胺和2,4,6-TCP 農(nóng)藥殘留的提取和凈化,是一種快速、簡(jiǎn)單、便宜、可靠和安全的樣品前處理方法[12]。目前,對(duì)咪鮮胺和2,4,6-TCP 的檢測(cè)方法有氣相色譜法(gas chromatography,GC)[13],液相色譜法(lliquid chromatography,LC)[14],氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatogarphy-mass spectrometry,GC-MS)[15],液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)[16-17]等,主要涉及到樣品有水果[18]、谷物[19]、油料作物[20]、中藥材[21]和土壤[22]等,而對(duì)辣椒中咪鮮胺和2,4,6-TCP 殘留的研究尚無(wú)報(bào)道。
本文建立了QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜連用測(cè)定辣椒中咪鮮胺和2,4,6-TCP 殘留的方法,具有對(duì)咪鮮胺和2,4,6-TCP 精密度好、準(zhǔn)確度高、溶劑使用量少、樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)單和分析成本廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。能夠?qū)Φ蜐舛鹊倪漉r胺和2,4,6-TCP 進(jìn)行定性與定量分析,填補(bǔ)了辣椒中咪鮮胺和2,4,6-TCP 殘留檢測(cè)研究中的空白。
無(wú)水硫酸鎂(分析純,使用前650 ℃下灼燒4 h,備用):天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;乙酸鈉(分析純):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究院;PSA:天津博納艾杰爾科技有限公司;冰乙酸(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈(色譜純):北京百靈威科技有限公司;甲醇中咪鮮胺溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(25165XM,純度98.4%,濃度為 100 μg/mL)、甲醇中 2,4,6-TCP 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(26233XM,純度 99.5 %,濃度為 100 μg/mL):北京振翔科技有限公司。
7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)安捷倫科技有限公司;VORTEX genius3 渦旋混合器:艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司;RJ-TDL-60B 離心機(jī):無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司;JJ500 電子天平:常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。
1.3.1 氣相色譜條件
DB-1701 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度260℃;升溫程序:初始溫度60℃保持1 min,以 10 ℃/min 升至 280 ℃,保持 10 min;進(jìn)樣量 1.0 μL,不分流進(jìn)樣。
1.3.2 質(zhì)譜條件
EI 電離源,電離電壓70 eV;離子源溫度280 ℃;傳輸線溫度280 ℃;溶劑延遲:5 min;咪鮮胺選擇監(jiān)測(cè)離子:定量離子 m/z 180;定性離子 m/z 308、266。2,4,6-TCP 選擇監(jiān)測(cè)離子:定量離子 m/z 196;定性離子 m/z 198、132。
稱取10.00 g 樣于50 mL 離心管,加10 mL 乙腈-乙酸(99 ∶1,體積比),搖勻,加 3.0 g 無(wú)水硫酸鎂,1.0 g乙酸鈉,渦旋1 min,4 000 r/min 離心5 min。取上清液5 mL 于15 mL 離心管,加1.0 g 無(wú)水硫酸鎂PSA量(3 ∶1,質(zhì)量比),渦旋 1 min,4 000 r/min 離心 5 min,取1 mL 上清液過(guò)膜,待測(cè)。
分別準(zhǔn)確移取 1 mL 100 μg/mL 的咪鮮胺和2,4,6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL 容量瓶中,用甲醇定容,配成兩種10.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,分別吸取以上兩種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,并用樣品提取液稀釋至質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
選用丙酮、乙腈、乙腈-乙酸作為提取溶劑進(jìn)行比較。在辣椒中添加 0.1 μg/mL 咪鮮胺和 2,4,6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定其回收率見(jiàn)表1。
表1 辣椒中咪鮮胺和2,4,6-TCP 在0.1 μg/mL 添加水平下的回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)Table 1 Recoveries and the relative standard deviation(RSD)of prochloraz and 2,4,6-TCP at 0.1 μg/mL spiked in pepper
由表1可知,咪鮮胺在丙酮、乙腈、乙腈-乙酸中回收率在94.55%~105.55%之間,三者對(duì)咪鮮胺均有較好的提取效果。2,4,6-TCP 在丙酮和乙腈中回收率為79.27 %~87.72 %之間,在乙腈-乙酸中回收率為96.92%~105.25%,說(shuō)明 2,4,6-TCP 在乙腈-乙酸提取效率比乙腈好。這是由于2,4,6-TCP 具有較強(qiáng)的極性和酸性,其羥基上的H+與環(huán)境中的Na+進(jìn)行交換從而生成 2,4,6-三氯苯酚鈉,而 2,4,6-三氯苯酚鈉在水相中的溶解度大于在有機(jī)相中的溶解度,有機(jī)相無(wú)法對(duì)樣品基質(zhì)中的2,4,6-三氯苯酚鈉進(jìn)行有效提取,加入乙腈-乙酸,存在大量的H+,促進(jìn)樣品基質(zhì)中2,4,6-三氯苯酚鈉形成 2,4,6-TCP,從而提高提取效率,2,4,6-TCP 與 2,4,6-三氯苯酚鈉的轉(zhuǎn)化見(jiàn)圖1。
圖1 2,4,6-TCP 與 2,4,6-三氯苯酚鈉的轉(zhuǎn)化Fig.1 The transformation of 2,4,6-TCP and 2,4,6-trichlorophenosodiumsalt
因此,本研究選擇乙腈-乙酸作為咪鮮胺和2,4,6-TCP 的提取劑。
本研究選用無(wú)水硫酸鎂PSA 量?jī)艋崛∫?,PSA對(duì)多糖、肽類(包括氨基酸)和色素有強(qiáng)吸附作用,無(wú)水硫酸鎂去除提取液中少量的水分,有助于加強(qiáng)PSA的凈化效果??疾觳煌昧康臒o(wú)水硫酸鎂PSA 量對(duì)凈化效率的影響見(jiàn)表2,按1.4 過(guò)程在辣椒中添加0.10 μg/mL 咪鮮胺和 2,4,6-TCP 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別以 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 g 無(wú)水硫酸鎂 PSA 量?jī)艋崛∫?,觀察不同用量的無(wú)水硫酸鎂PSA 對(duì)提取液的凈化效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨3 ∶1 的無(wú)水硫酸鎂PSA 用量增加對(duì)提取液凈化效果越好。
表2 辣椒中在0.10 μg/mL 添加水平下不同量3 ∶1 的無(wú)水硫酸鎂PSA 對(duì)平均回收率的影響(n=5)Table 2 Effects of amount of anhydrous magnesium sulfate PSA(3 ∶1,m/m)on average recoveries of 0.10 μg/mL spiked in pepper(n=5)
由表2可知,當(dāng)無(wú)水硫酸鎂和PSA 的量達(dá)到1.0 g后2,4,6-TCP 和咪鮮胺回收率基本不變。綜合凈化效果和回收率,本研究選擇1.0 g 無(wú)水硫酸鎂PSA 量?jī)艋崛∫骸?/p>
取1.4 配制的咪鮮胺和2,4,6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)混合工作液,在最佳的試驗(yàn)條件下檢測(cè)咪鮮胺和2,4,6-TCP,以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)見(jiàn)圖2。
圖2 咪鮮胺和2,4,6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of the prochloraz and 2,4,6-TCP
得到咪鮮胺和2,4,6-TCP 的線性方程分別為Y=637 497.3X-8 786.1 和 Y=890 775.9X-3 978.6,其相關(guān)系數(shù)r 值分別為0.999 1 和0.999 2,表明咪鮮胺和2,4,6-TCP 在 0.01 μg/mL~1.0 μg/mL 范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好,以3 倍信噪比(S/N=3)確定咪鮮胺和2,4,6-TCP 檢出限為 0.003 3 mg/kg,滿足殘留定量分析要求。
試驗(yàn)對(duì)辣椒進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn),考察該方法的回收率與精密度。按照1.5 步驟對(duì)辣椒添加0.02、0.10、0.50 μg/mL 3 個(gè)水平的咪鮮胺和 2,4,6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)前處理后GC-MS 分析,測(cè)定后計(jì)算回收率見(jiàn)表3。
表3 辣椒中咪鮮胺和2,4,6-TCP 在3 個(gè)添加水平下的平均回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)Table 3 Average recoveries and the RSD of prochloraz and 2,4,6-TCP at three spiked levels in pepper(n=7)
由表3可知,在3 個(gè)添加水平下咪鮮胺和2,4,6-TCP 的平均回收率在96.70%~100.64%的范圍之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)介于2.33%~4.28%之間,表明此方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。因此,試驗(yàn)中開(kāi)發(fā)的方法滿足2,4,6-TCP 和咪鮮胺分析的要求,可用于辣椒樣品中2,4,6-TCP 和咪鮮胺農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。
利用本試驗(yàn)方法按1.5 樣品處理步驟,以市售的辣椒50 個(gè)樣品進(jìn)行定性定量分析見(jiàn)表4。
其中 4 個(gè)樣品檢出咪鮮胺和 2,4,6-TCP 殘留,結(jié)果見(jiàn)表4,其余樣品均未檢出,對(duì)檢出樣品做5 次平行檢測(cè),咪鮮胺和2,4,6-TCP 分別在0.049 mg/kg~0.25 mg/kg 和 0.018 mg/kg~0.19 mg/kg 之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.02%~11.28%之間。
表4 實(shí)樣檢測(cè)結(jié)果Table 4 Sample test results
由于咪鮮胺最終降解為2,4,6-TCP,根據(jù)水解反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量法,1 摩爾咪鮮胺(分子量為376.7)水解產(chǎn)生 1 摩爾的 2,4,6-TCP(分子量為 197.5),所以它們之間存在下一種轉(zhuǎn)換關(guān)系[23-24]:
1(mg/kg)2,4,6-TCP=1.907(mg/kg)咪鮮胺
按照GB2763-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量規(guī)定》[25],咪鮮胺及其含有2,4,6-三氯苯酚部分的代謝產(chǎn)物之和,以咪鮮胺表示,根據(jù)轉(zhuǎn)換關(guān)系計(jì)算4 個(gè)樣品中咪鮮胺的含量在0.095 mg/kg~0.57 mg/kg 之間,在辣椒中的最終殘留量均低于最大殘留量2 mg/kg。
采用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蔬菜中咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚殘留量的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了研究。該方法前處理簡(jiǎn)便快速、選擇性好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng),具有良好的線性響應(yīng),且在0.02、0.10、0.50 μg/mL 添加水平下,兩種農(nóng)藥均有較好的回收率。表明該方法符合農(nóng)藥殘留分析的要求,適用于辣椒中咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚殘留檢測(cè)的定性和定量分析。