QuEChERS-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定辣椒中的咪鮮胺及2，4，6-三氯苯酚殘留量

張彥軍，洪霞，錢瀅文，*，王克輝，熊敏暉，王燕嬌，馬燕，尚欣春

（1.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州 730010；2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，甘肅 蘭州 730010）

辣椒是世界上僅次于豆類、番茄的第三大蔬菜作物，在我國(guó)種植規(guī)模大、產(chǎn)品類別多樣、市場(chǎng)需求高，是我國(guó)最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)。辣椒中含有豐富的辣椒紅素、辣椒素、維生素、礦物質(zhì)等，具有很高的保健功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有抗菌消炎、抗氧化、降低膽固醇、溶解血栓等方面的功效能增，為重要的蔬菜和調(diào)味品[1-2]。

咪鮮胺是一種咪唑類廣譜高效殺菌劑，其作用機(jī)理主要通過(guò)抑制麥角甾醇的生物合成，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能，從而達(dá)到殺菌目的，對(duì)辣椒枯萎病菌引起病害具有很好的保護(hù)和治療作用，用于防治辣椒的枯萎病[3-4]。咪鮮胺在環(huán)境中首先降解為N-丙基-N-[2-（2，4，6-trichlorophenol，2，4，6-三氯苯氧基）乙基]脲（BTS44595）和 N-醛基-N-丙基-N-[2-（2，4，6-三氯苯氧基）乙基]脲（BTS44596），后降解為 BTS45186[5-6]，即 2，4，6-三氯苯酚（2，4，6-TCP）。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究咪鮮胺的毒性[7]，咪鮮胺毒性較低，在推薦使用劑量范圍內(nèi)，其對(duì)哺乳動(dòng)物的致突變作用、致癌作用以及致畸作用的危害較小。但2，4，6-TCP 作為咪鮮胺的最終降解物，已經(jīng)被確定為我國(guó)水體中的優(yōu)先污染物，是一種具有毒性、致突變性和致癌性的環(huán)境污染物，會(huì)對(duì)人類的健康造成潛在威脅[8]，其殘留問(wèn)題受到越來(lái)越多的關(guān)注。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于咪鮮胺和2，4，6-TCP 檢測(cè)的前處理，樣品提取液在210 ℃～240 ℃條件下與吡啶鹽酸鹽發(fā)生水解反應(yīng)，將咪鮮胺及其代謝物全部轉(zhuǎn)化為2，4，6-TCP，經(jīng)石油醚提取后采用磺化法凈化，檢測(cè)2，4，6-TCP 的含量[9-11]。該方法操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，且吡啶鹽酸鹽毒性較大，對(duì)試驗(yàn)人員的健康和環(huán)境安全造成威脅。QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）為這一問(wèn)題提供了新的解決途徑，該方法利用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）去除組份中的色素和油脂，以無(wú)水硫酸鎂去除水分，適用于辣椒中咪鮮胺和2，4，6-TCP 農(nóng)藥殘留的提取和凈化，是一種快速、簡(jiǎn)單、便宜、可靠和安全的樣品前處理方法[12]。目前，對(duì)咪鮮胺和2，4，6-TCP 的檢測(cè)方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[13]，液相色譜法（lliquid chromatography，LC）[14]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatogarphy-mass spectrometry，GC-MS）[15]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[16-17]等，主要涉及到樣品有水果[18]、谷物[19]、油料作物[20]、中藥材[21]和土壤[22]等，而對(duì)辣椒中咪鮮胺和2，4，6-TCP 殘留的研究尚無(wú)報(bào)道。

本文建立了QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜連用測(cè)定辣椒中咪鮮胺和2，4，6-TCP 殘留的方法，具有對(duì)咪鮮胺和2，4，6-TCP 精密度好、準(zhǔn)確度高、溶劑使用量少、樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)單和分析成本廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。能夠?qū)Φ蜐舛鹊倪漉r胺和2，4，6-TCP 進(jìn)行定性與定量分析，填補(bǔ)了辣椒中咪鮮胺和2，4，6-TCP 殘留檢測(cè)研究中的空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)水硫酸鎂（分析純，使用前650 ℃下灼燒4 h，備用）：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；乙酸鈉（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究院；PSA：天津博納艾杰爾科技有限公司；冰乙酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：北京百靈威科技有限公司；甲醇中咪鮮胺溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（25165XM，純度98.4%，濃度為 100 μg/mL）、甲醇中 2，4，6-TCP 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（26233XM，純度 99.5 %，濃度為 100 μg/mL）：北京振翔科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；VORTEX genius3 渦旋混合器：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；RJ-TDL-60B 離心機(jī)：無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司；JJ500 電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

1.3 條件

1.3.1 氣相色譜條件

DB-1701 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度260℃；升溫程序：初始溫度60℃保持1 min，以 10 ℃/min 升至 280 ℃，保持 10 min；進(jìn)樣量 1.0 μL，不分流進(jìn)樣。

1.3.2 質(zhì)譜條件

EI 電離源，電離電壓70 eV；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲：5 min；咪鮮胺選擇監(jiān)測(cè)離子：定量離子 m/z 180；定性離子 m/z 308、266。2，4，6-TCP 選擇監(jiān)測(cè)離子：定量離子 m/z 196；定性離子 m/z 198、132。

1.4 樣品處理

稱取10.00 g 樣于50 mL 離心管，加10 mL 乙腈-乙酸（99 ∶1，體積比），搖勻，加 3.0 g 無(wú)水硫酸鎂，1.0 g乙酸鈉，渦旋1 min，4 000 r/min 離心5 min。取上清液5 mL 于15 mL 離心管，加1.0 g 無(wú)水硫酸鎂PSA量（3 ∶1，質(zhì)量比），渦旋 1 min，4 000 r/min 離心 5 min，取1 mL 上清液過(guò)膜，待測(cè)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取 1 mL 100 μg/mL 的咪鮮胺和2，4，6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成兩種10.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別吸取以上兩種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，并用樣品提取液稀釋至質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

選用丙酮、乙腈、乙腈-乙酸作為提取溶劑進(jìn)行比較。在辣椒中添加 0.1 μg/mL 咪鮮胺和 2，4，6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定其回收率見表1。

表1 辣椒中咪鮮胺和2，4，6-TCP 在0.1 μg/mL 添加水平下的回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）Table 1 Recoveries and the relative standard deviation（RSD）of prochloraz and 2，4，6-TCP at 0.1 μg/mL spiked in pepper

由表1可知，咪鮮胺在丙酮、乙腈、乙腈-乙酸中回收率在94.55%～105.55%之間，三者對(duì)咪鮮胺均有較好的提取效果。2，4，6-TCP 在丙酮和乙腈中回收率為79.27 %～87.72 %之間，在乙腈-乙酸中回收率為96.92%～105.25%，說(shuō)明 2，4，6-TCP 在乙腈-乙酸提取效率比乙腈好。這是由于2，4，6-TCP 具有較強(qiáng)的極性和酸性，其羥基上的H+與環(huán)境中的Na+進(jìn)行交換從而生成 2，4，6-三氯苯酚鈉，而 2，4，6-三氯苯酚鈉在水相中的溶解度大于在有機(jī)相中的溶解度，有機(jī)相無(wú)法對(duì)樣品基質(zhì)中的2，4，6-三氯苯酚鈉進(jìn)行有效提取，加入乙腈-乙酸，存在大量的H+，促進(jìn)樣品基質(zhì)中2，4，6-三氯苯酚鈉形成 2，4，6-TCP，從而提高提取效率，2，4，6-TCP 與 2，4，6-三氯苯酚鈉的轉(zhuǎn)化見圖1。

圖1 2，4，6-TCP 與 2，4，6-三氯苯酚鈉的轉(zhuǎn)化Fig.1 The transformation of 2，4，6-TCP and 2，4，6-trichlorophenosodiumsalt

因此，本研究選擇乙腈-乙酸作為咪鮮胺和2，4，6-TCP 的提取劑。

2.2 無(wú)水硫酸鎂PSA用量的優(yōu)化

本研究選用無(wú)水硫酸鎂PSA 量?jī)艋崛∫?，PSA對(duì)多糖、肽類（包括氨基酸）和色素有強(qiáng)吸附作用，無(wú)水硫酸鎂去除提取液中少量的水分，有助于加強(qiáng)PSA的凈化效果。考察不同用量的無(wú)水硫酸鎂PSA 量對(duì)凈化效率的影響見表2，按1.4 過(guò)程在辣椒中添加0.10 μg/mL 咪鮮胺和 2，4，6-TCP 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 g 無(wú)水硫酸鎂 PSA 量?jī)艋崛∫?，觀察不同用量的無(wú)水硫酸鎂PSA 對(duì)提取液的凈化效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨3 ∶1 的無(wú)水硫酸鎂PSA 用量增加對(duì)提取液凈化效果越好。

表2 辣椒中在0.10 μg/mL 添加水平下不同量3 ∶1 的無(wú)水硫酸鎂PSA 對(duì)平均回收率的影響（n=5）Table 2 Effects of amount of anhydrous magnesium sulfate PSA（3 ∶1，m/m）on average recoveries of 0.10 μg/mL spiked in pepper（n=5）

由表2可知，當(dāng)無(wú)水硫酸鎂和PSA 的量達(dá)到1.0 g后2，4，6-TCP 和咪鮮胺回收率基本不變。綜合凈化效果和回收率，本研究選擇1.0 g 無(wú)水硫酸鎂PSA 量?jī)艋崛∫骸?/p>

2.3 線性范圍和檢出限

取1.4 配制的咪鮮胺和2，4，6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，在最佳的試驗(yàn)條件下檢測(cè)咪鮮胺和2，4，6-TCP，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)見圖2。

圖2 咪鮮胺和2，4，6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of the prochloraz and 2，4，6-TCP

得到咪鮮胺和2，4，6-TCP 的線性方程分別為Y=637 497.3X-8 786.1 和 Y=890 775.9X-3 978.6，其相關(guān)系數(shù)r 值分別為0.999 1 和0.999 2，表明咪鮮胺和2，4，6-TCP 在 0.01 μg/mL～1.0 μg/mL 范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好，以3 倍信噪比（S/N=3）確定咪鮮胺和2，4，6-TCP 檢出限為 0.003 3 mg/kg，滿足殘留定量分析要求。

2.4 回收率和精密度

試驗(yàn)對(duì)辣椒進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)，考察該方法的回收率與精密度。按照1.5 步驟對(duì)辣椒添加0.02、0.10、0.50 μg/mL 3 個(gè)水平的咪鮮胺和 2，4，6-TCP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理后GC-MS 分析，測(cè)定后計(jì)算回收率見表3。

表3 辣椒中咪鮮胺和2，4，6-TCP 在3 個(gè)添加水平下的平均回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）Table 3 Average recoveries and the RSD of prochloraz and 2，4，6-TCP at three spiked levels in pepper（n=7）

由表3可知，在3 個(gè)添加水平下咪鮮胺和2，4，6-TCP 的平均回收率在96.70%～100.64%的范圍之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）介于2.33%～4.28%之間，表明此方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。因此，試驗(yàn)中開發(fā)的方法滿足2，4，6-TCP 和咪鮮胺分析的要求，可用于辣椒樣品中2，4，6-TCP 和咪鮮胺農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

2.5 實(shí)樣分析

利用本試驗(yàn)方法按1.5 樣品處理步驟，以市售的辣椒50 個(gè)樣品進(jìn)行定性定量分析見表4。

其中 4 個(gè)樣品檢出咪鮮胺和 2，4，6-TCP 殘留，結(jié)果見表4，其余樣品均未檢出，對(duì)檢出樣品做5 次平行檢測(cè)，咪鮮胺和2，4，6-TCP 分別在0.049 mg/kg～0.25 mg/kg 和 0.018 mg/kg～0.19 mg/kg 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.02%～11.28%之間。

表4 實(shí)樣檢測(cè)結(jié)果Table 4 Sample test results

由于咪鮮胺最終降解為2，4，6-TCP，根據(jù)水解反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量法，1 摩爾咪鮮胺（分子量為376.7）水解產(chǎn)生 1 摩爾的 2，4，6-TCP（分子量為 197.5），所以它們之間存在下一種轉(zhuǎn)換關(guān)系[23-24]：

1（mg/kg）2，4，6-TCP=1.907（mg/kg）咪鮮胺

按照GB2763-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量規(guī)定》[25]，咪鮮胺及其含有2，4，6-三氯苯酚部分的代謝產(chǎn)物之和，以咪鮮胺表示，根據(jù)轉(zhuǎn)換關(guān)系計(jì)算4 個(gè)樣品中咪鮮胺的含量在0.095 mg/kg～0.57 mg/kg 之間，在辣椒中的最終殘留量均低于最大殘留量2 mg/kg。

3 結(jié)論

采用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蔬菜中咪鮮胺及其代謝物2，4，6-三氯苯酚殘留量的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了研究。該方法前處理簡(jiǎn)便快速、選擇性好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，具有良好的線性響應(yīng)，且在0.02、0.10、0.50 μg/mL 添加水平下，兩種農(nóng)藥均有較好的回收率。表明該方法符合農(nóng)藥殘留分析的要求，適用于辣椒中咪鮮胺及其代謝物2，4，6-三氯苯酚殘留檢測(cè)的定性和定量分析。