蜂蜜中糖類的高效液相色譜測定及其在蜂蜜品質(zhì)控制中的應(yīng)用研究

張曉華

（許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院河南省食品安全生物標識快檢技術(shù)重點實驗室，河南許昌461000）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)巢脾轉(zhuǎn)化、脫水、貯存釀造而形成的天然甜物質(zhì)。其中，葡萄糖和果糖的含量在蜂蜜中所占比例高達65%～80%，蔗糖的成分相對較少不超過8 %，另外，水分達到20 %左右，其余的物質(zhì)包括：蛋白質(zhì)、多酚、黃酮類化合物、酶、游離氨基酸、色素、生物堿、維生素和香氣化合物等，大約占5%。蜂蜜中的相關(guān)成分會隨生長環(huán)境，水分濃度，天氣溫度等因素影響而不同[1-2]。

蜂蜜中的許多物質(zhì)為人體代謝所必需物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值受到越來越多消費者的青睞，且市場需求量很大[3]。部分生產(chǎn)企業(yè)在利益的驅(qū)使下，利用各種摻假方式大量生產(chǎn)制造假蜂蜜，牟取暴利[4]。目前蜂蜜的摻假方法可以概括為兩大類：（1）以假充真，利用白糖熬制假蜂蜜，或者利用果葡糖漿、高果糖漿、淀粉糖漿、甜菜糖漿、大米糖漿等進行摻假，尤其是果葡糖漿。因為蜂蜜中的主要成分就是葡萄糖和果糖，而果葡糖漿的葡萄糖和果糖比例與蜂蜜中葡萄糖和果糖的比例十分相似，利用果葡糖漿摻假的蜂蜜檢測指標完全達到國家標準，甚至更高。（2）以次充好，雜花蜜的口感、營養(yǎng)價值等均比不上單花種蜂蜜。所以市場上常常存在以低價的雜花蜜摻入單花蜜的問題蜂蜜。同時，也有將價格相對低廉的單花蜜摻入高價單花蜜的冒牌蜂蜜的存在[5]。綜上所述，蜂蜜的摻假技術(shù)多樣，且具有不可預(yù)見性。

目前，蜂蜜品質(zhì)控制檢測方法除了國家標準或行業(yè)標準以外，還包括一些文獻敘述方法[6-8]，例如：花粉檢驗法、光譜法、色譜法、質(zhì)譜法、酶法等。上述方法總結(jié)起來共分為3 類：（1）傳統(tǒng)的檢測手段，包括感官識別，理化指標檢測和花粉檢驗法等。這類方法大部分只能用于初步判斷，不能進行準確檢測。（2）利用大型儀器（例如多級質(zhì)譜等）[9-11]，對蜂蜜樣品的相關(guān)指標進行全面分析，實現(xiàn)真假鑒別。該類方法使用的儀器價格相對昂貴，測定時間較長，國內(nèi)許多實驗室和公共事業(yè)單位承擔(dān)不起昂貴的購置費用，和較高的運行維護和檢測費用。同時，為了得到較為準確的分析結(jié)果，通常需要較長的流出時間和復(fù)雜的流動相條件來完全分離各個目標分析物。這會消耗較長的時間和使用大量的有機溶劑，而且，分離效果的好壞與背景基質(zhì)的復(fù)雜程度有較強的依賴性。（3）色譜法或光譜法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)一階校正方法[12-18]：主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘（partial least squares，PLS）、支持向量機、電子鼻、電子舌等，進行建模分析。這種基于光譜信息的二維模式識別方法，由于其潛在的缺陷，往往具有一定的局限性，得到的結(jié)果是各個組分真實光譜的線性組合，所以其解不具備相關(guān)的物理意義。另外，利用化學(xué)計量學(xué)方法進行建模、聚類分析，需要具備一定的化學(xué)計量學(xué)基礎(chǔ)才能夠開展，對于非化學(xué)計量學(xué)工作者是一個令人頭疼的問題。

以上現(xiàn)有的每種檢測方法都有一定的局限性，且現(xiàn)行檢測手段大多都是在摻假方式出現(xiàn)以后相應(yīng)展開的，也就是說檢測手段落后于摻假手段。受花源和一些環(huán)境因素（如土壤、季節(jié)、溫度和氣候）等的影響，蜂蜜中糖類物質(zhì)的含量存在一定的差異[19]。本論文綜合考慮了方法的準確性和實用性，本著優(yōu)勢互補、高效、經(jīng)濟和環(huán)保的原則，巧妙地將蜂蜜中的主要物質(zhì)糖類的含量與蜂蜜品質(zhì)控制聯(lián)系在了一起，結(jié)合“簡單聚類分析”，對蜂蜜品質(zhì)控制方面擬進行探索性研究。糖類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中不存在生色基團，采用紫外衍生或熒光衍生方法對其直接檢測較為困難[20]。為加大靈敏度和分辨率，文章在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上，利用高效液相色譜結(jié)合示差折光檢測器對蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖5 種糖類進行定性定量分析，然后結(jié)合定量結(jié)果，利用“簡單聚類分析”方法進行蜂蜜的產(chǎn)地溯源和摻假鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9 種蜂蜜均為中國知名品牌，從周邊超市及網(wǎng)上采購所得。

5 種標準物質(zhì)（果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖）均為色譜級別。果糖和乳糖：大連凱美化工工程配套有限公司；蔗糖和麥芽糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡糖糖：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；果葡糖漿：上海好成食品發(fā)展有限公司。乙腈（色譜級）：美國飛世爾公司；所用純水為超純水儀Mini12UV制備得到。

標準品、果葡糖漿和蜂蜜在4 ℃下密封保存。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 型高效液相色譜儀結(jié)合示差折光檢測器：美國安捷倫科技有限公司；Mini12UV 型超純水儀：Kertone 公司；XW-80A 型旋渦混合器：其林貝爾儀器制作有限公司；US6180DH 型超聲波清洗器：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；MS205DU 型電子天平：上海梅特勒托利多儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

所用的高效液相色譜系統(tǒng)是Agilent 1260，色譜柱為 ZORBAX 氨基分析柱（4.6 mm×150 mm），流動相為乙腈∶水（25∶75，體積比）。操作條件為：柱溫 40 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量 10 μL。示差折光檢測器溫度：40 ℃。

1.3.2 標準溶液的配制

糖的標準貯備液制備：用電子天平分別稱取一定量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖標準品，用超純水定容至刻度線，混勻。

標準溶液制備：將儲備液進行梯度稀釋為工作液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)制，利用工作液制備標準溶液，每種分析物標準曲線的濃度是在其線性范圍內(nèi)隨機設(shè)計。

1.3.3 摻假蜂蜜的制作方法

果葡糖漿和棗花蜂蜜以1 ∶1（質(zhì)量比）比例混勻，震蕩，超聲加熱30 min，使其溶解均勻。使用0.45 μm濾膜過濾，再注入色譜系統(tǒng)。每個樣品進行重復(fù)分析，并根據(jù)樣本序號隨機進行試驗。

1.3.4 蜂蜜樣的配制

選取3 種蜂蜜，分別為棗花蜜、洋槐蜜和椴樹蜜。每一種蜂蜜隨機選取了3 個產(chǎn)地。棗花蜜的產(chǎn)地為江西、湖北和上海；洋槐蜜的產(chǎn)地為：江西、河南和上海；椴樹蜜的產(chǎn)地為黑龍江、吉林和上海。每一種蜂蜜稱取不同的質(zhì)量到10.0 mL 的棕色容量瓶中，并用流動相稀釋至刻度。每個類型的蜂蜜構(gòu)建4 個蜂蜜樣本。所有的樣本均超聲處理30.0 min，使其溶解均勻。使用0.45 μm 濾膜過濾，再注入色譜系統(tǒng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 5種糖類色譜行為分析

5 種標準物質(zhì)的示差折光檢測色譜圖見圖1。

圖1 5 種糖類標準物質(zhì)的示差折光檢測色譜圖Fig.1 The elution time profiles by using differential refraction detector for five analytes

由圖1可知，在設(shè)定的高效液相色譜法的條件下，5 種糖類物質(zhì)能完全分開，而且分離效果相對較好，周圍沒有其他峰干擾，表明此色譜條件適合蜂蜜中5 種糖類的測定。5 種糖類的出峰時間分別為：果糖4.53 min、葡萄糖5.15 min、蔗糖6.96 min、麥芽糖8.23 min、乳糖9.18 min。

試驗以標準溶液的濃度作為橫坐標，峰面積作為標準曲線的縱坐標，對5 種糖類的線性回歸方程進行分析，結(jié)果如表1所示。

表1 5 種糖類標準品的線性相關(guān)性Table 1 The linear correlation of five sugar standards

5 種糖類的線性相關(guān)系數(shù)處于0.995 8～0.999 0 之間，線性關(guān)系良好，能夠很好的滿足本試驗定量分析的要求。

2.2 基于蜂蜜中5種糖類的定量分析結(jié)果，進行蜂蜜品質(zhì)控制分析

2.2.1 蜂蜜產(chǎn)地溯源分析

根據(jù)建立的標準曲線方程，對3 個省份洋槐蜂蜜中的5 種糖類進行定量分析，所得結(jié)果如表2所示。

表2 洋槐蜜中5 種糖類的定量結(jié)果Table 2 The quantitative results of five sugars in acacia honey

從表2可以看出，不同產(chǎn)地的洋槐蜂蜜，5 種糖類的含量不盡相同。其中，相對果糖、葡萄糖和蔗糖而言，麥芽糖和乳糖含量相對較低。江西省和河南省的洋槐蜂蜜中未檢出乳糖。果糖含量河南省洋槐蜜最高，葡萄糖含量上海市最高，蔗糖含量江西省最高。

對于棗花蜜，隨機采集了3 個省市，包括江西省、湖北省和上海市。所得到的5 種糖類的定量結(jié)果如表3 所示。

表3 棗花蜜中5 種糖類的定量結(jié)果Table 3 The quantitative results of five sugars in jujube nectar honey

從表3可以看出，對于棗花蜜而言，5 種糖類的含量也不盡相同。其中，蔗糖的含量3 個省份差別最大，約為68 倍。因此，糖類的含量分析，可以看作是一種用于區(qū)分蜂蜜產(chǎn)地非常有用的方式。

椴樹蜜中的5 種糖類的含量見表4。

表4 椴樹蜜中5 種糖類的定量結(jié)果Table 4 The quantitative results of five sugars in linden honey

由表4可知，與上述兩種蜂蜜不同的是，3 個產(chǎn)地的椴樹蜜中果糖和葡萄糖含量相差不大。對于椴樹蜜，3 個產(chǎn)地中，蔗糖含量相差較大，約為77 倍，其他4種糖類也存在不同的差別。

基于表2、表3和表4的定量結(jié)果，本文利用蜂蜜中含量較高的果糖、葡萄糖和蔗糖的含量，對所研究的3 種蜂蜜（洋槐蜜、棗花蜜和椴樹蜜）的產(chǎn)地進行區(qū)分，區(qū)分效果見圖2。

圖2 蜂蜜產(chǎn)地區(qū)分效果圖Fig.2 The classification of different places honeys

從圖2可以看出，同一蜜源、不同產(chǎn)地的蜂蜜自動聚集為不同的組，同一產(chǎn)地同一蜜源蜂蜜樣本聚集為一組。對于每一種蜂蜜，12 個研究樣本自動聚集為3組，分別對應(yīng)于本工作中所檢測的3 個產(chǎn)地的蜂蜜樣本，實現(xiàn)了蜂蜜產(chǎn)地的成功區(qū)分，結(jié)果令人滿意。研究結(jié)果將為蜂蜜的產(chǎn)地溯源提供新的方法，對于蜂蜜質(zhì)量監(jiān)控具有一定的實際意義。

2.2.2 蜂蜜種類的區(qū)分

基于果糖、葡萄糖和蔗糖的含量，對上海市的3 種蜂蜜（洋槐蜜、棗花蜜和椴樹蜜）嘗試進行了種類區(qū)分，區(qū)分效果見圖3。

3 個蜜源種類的蜂蜜自動區(qū)分為3 組，正方形的符號代表洋槐蜜，六邊形的符號代表棗花蜜，菱形代表椴樹蜜。3 種蜂蜜區(qū)分效果較好，說明該種方法可以推廣嘗試應(yīng)用于不同蜂蜜種類的區(qū)分，對于蜂蜜的品質(zhì)控制具有一定的理論意義和實際意義。

2.2.3 蜂蜜摻假鑒別分析

真蜂蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜中5 種糖類的檢測結(jié)果如表5所示。

圖3 蜂蜜種類區(qū)分效果圖Fig.3 The classification of different floral honeys

表5 棗花蜜和摻假棗花蜜中5 種糖類的定量結(jié)果Table 5 The quantitative results of five sugars in jujube nectar honey and adulteration honey

因果葡糖漿的主要成分為葡萄糖和果糖，所以果葡糖漿摻假蜂蜜中檢測得到的果糖和葡萄糖的含量均高于棗花蜜，而其他糖類的含量較棗花蜜低。我們可以基于真蜂蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜中糖類含量的不同進行摻假鑒別。

利用棗花蜜和果葡糖漿摻假棗花蜜中蔗糖、果糖和葡萄糖含量的不同進行真假蜂蜜的區(qū)分，效果圖見圖4。

圖4 蜂蜜摻假鑒別效果圖Fig.4 Discrimination of adulterated honeys and real ones by the content of sugars

從圖4可以看出，假蜂蜜和真蜂蜜自動聚集為不同的組，白色星型符號代表真的棗花蜂蜜，黑色星型符號代表果葡糖漿摻假棗花蜂蜜，區(qū)分效果十分明顯。該方法可以為解決目前蜂蜜市場上摻假造假問題提供一定的參考和指導(dǎo)。

3 結(jié)論

本研究方法在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上，綜合考慮了方法的準確性和實用性，在不需要借助大型儀器的情況下，成功實現(xiàn)了蜂蜜品質(zhì)的鑒別分析。本論文基于蜂蜜中5 種糖類的定量結(jié)果，構(gòu)建了三維立體圖形，結(jié)合類似化學(xué)計量學(xué)中的“聚類方法”進行綜合分析，其中，不同種類、產(chǎn)地和摻假蜂蜜自動聚集為不同的組，可以很直觀的進行區(qū)分。該方法基于一種巧妙的構(gòu)思，使用者不需要具備化學(xué)計量學(xué)知識，也可以輕松進行簡單“聚類”，對蜂蜜的品質(zhì)控制進行了有效分析。從試驗結(jié)果可以看出，該方法可行有效，不同種類、不同產(chǎn)地以及摻假蜂蜜都能進行很好的區(qū)分。本研究方法操作簡單易行，而且可以節(jié)約時間和檢測成本，減少有害有機溶劑的用量，是一種綠色環(huán)保、簡單可靠的方法，且具有普遍使用性，能很好的推廣使用。