增強型體外反搏對穩(wěn)定性勞累型心絞痛外周血單個核細(xì)胞損傷的影響

謝天鴿，謝天飛，劉 云，段繼豪

穩(wěn)定性心絞痛(stable angina pectoris，SAP)是冠狀動脈血流量不足所致的心肌缺血，導(dǎo)致胸部及附近部位的不適，可伴心功能障礙，但沒有心肌壞死。臨床上常表現(xiàn)為經(jīng)胸骨或胸骨后壓力或窒息感或疼痛，并伴有疲倦，對患者的健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生影響[1]。目前臨床治療主要是預(yù)防心肌梗死和猝死，延長生存期，緩解缺血癥狀，提高生活質(zhì)量。增強型體外反搏(enhanced external counterpulsation，EECP)治療冠狀動脈疾病為一種有效無創(chuàng)治療，可通過提高主動脈舒張壓，增加心臟輸出量增，提高靜脈回流[2]。EECP還可以改善ST段的心絞痛[3]，而且已有文獻報道了EECP長期治療后所產(chǎn)生的持續(xù)功效[4]。但其具體發(fā)揮臨床作用的機制并不是太明確，本研究通過分析體外反搏對穩(wěn)定性勞累型心絞痛患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)活性及其炎癥的影響，旨在探討其臨床療效和機制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015年1月至2018年1月在河南省漯河市第三人民醫(yī)院心血管內(nèi)科接受治療的484例穩(wěn)定性勞累型心絞痛患者作為研究對象，所有患者依據(jù)隨機數(shù)字表法分成觀察組和對照組：觀察組243例，其中男性151例，女性92例；年齡60～84(66.24±10.23)歲。對照組241例，其中男性155例，女性86例；年齡60～84(67.55±10.32)歲。兩組患者的性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、用藥情況等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。見表1。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國際心臟病學(xué)會及WHO提出的缺血心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。②均經(jīng)臨床、影像學(xué)等檢查確診。③年齡均≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤等終末期疾病和自身免疫性疾病的患者；②合并活動性感染疾病的患者。

1.3 方法對照組入院后按照病情接受β-阻滯劑、鈣阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑、硝酸鹽、降脂藥/阿司匹林/抗血小板藥、PCI等常規(guī)治療。觀察組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，采用加強型體外反搏器體外反搏治療，每天1 h，每周6 d，連續(xù)6周。反搏氣囊充氣壓力0.35～0.40 kg·cm-2。治療時嚴(yán)格按照說明書進行操作，執(zhí)行部件主要包括三副充氣囊套，分別包扎于小腿、大腿及臀部。在心電R波的觸發(fā)下，氣囊自小腿、大腿、臀部自下而上序貫充氣，在心臟舒張期加速回流，改善心、腦等重要臟器血流灌注；在心臟收縮期，三副充氣囊則同時排氣，使心臟射血的阻力降低。

表1 兩組患者一般資料比較 例(%)

1.4 臨床療效評價治療結(jié)束后，參考加拿大分級(Canadian Cardiovascular Society,CCS)標(biāo)準(zhǔn)，其中心絞痛至少改善>1級為有效，運動耐量主要參考患者主訴來確定有效性，以爬樓增加一層或平路行走增加50 m判斷運動耐量增加[6]。

1.5 樣本采集及外周血單個核細(xì)胞分離、培養(yǎng)治療后，患者均采集空腹靜脈血10 mL，取5 mL空腹靜脈血肝素抗凝3 000 r·min-1離心5 min，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，分成2份，其中1份調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個·mL-1，并接種于24孔板，加入脂多糖終濃度為10 mg·L-1的培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，另設(shè)置只加培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞，備用。取5 mL空腹靜脈血3 000 r·min-1離心5 min，分離血清，-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標(biāo)采用ELISA法檢測血清和細(xì)胞液中白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、IL-1β水平，試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號20170214、20170326、20170219)，按照說明書進行操作。

1.7 FQ-PCR檢測TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA的表達所有的PBMC采用Trizol提取RNA，測定純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，其中2×SYBRR Premix Ex-TaqⅡ10 μL，上游(10 μmol)和下游(10 μmol)各0.5 μL，cDNA 1 μL，PCR級高純水8 μL。采用light cycleR 96實時熒光定量PCR儀(Roche Diagnostics 公司，德國)同時對目的基因和內(nèi)參基因(β-actin)進行基因擴增，引物序列由上海英駿公司提供。TLR4上游序列：5’-CTTGGCGCTGTCTCTCCC-3’，下游序列：5’-AGGCGTGATTCTTCCCACAG，產(chǎn)物481 bp；MyD88 (NM_002468.4)上游序列：5’-GCTCATCGAAAAGAGGTGCC-3’，下游序列：5’-GGTTGGTGTAGTCGCAGACA-3’，產(chǎn)物206 bp；NF-κBp65上游序列：5’-GGCAGGAAGAGGAGGTTTCG-3’，下游序列：5’-TGAAGGTATGGGCCATCTGC-3’，產(chǎn)物554 bp；β-actin(NM_001101.4)上游序列：5’-GCCCTATAAAACCCAGCGGC-3’，下游序列：5’-TCGATGGGGTACTTCAGGGT-3’，產(chǎn)物332 bp。采用相對定量2-△△Ct法比較目的基因水平。

3 結(jié)果

3.1 兩組臨床療效及癥狀改善對比觀察組臨床總有效率明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)，并且心絞痛緩解、運動耐量增加的例數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 臨床療效比較 例(%)

3.2 血清中IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平比較與對照組比較，血清中IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 血清IL-6、Hs-CRP、IL-1β比較 ng·L-1

3.3 脂多糖刺激的PBMC培養(yǎng)液中IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平比較與對照組比較，培養(yǎng)液中IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 培養(yǎng)液IL-6、Hs-CRP、IL-1β比較 ng·L-1

3.4 未接受脂多糖刺激的PBMC中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平與對照組比較，觀察組外周血單個核細(xì)胞中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平

3.5 脂多糖刺激的PBMC中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平與對照組比較，觀察組外周血單個核細(xì)胞在脂多糖刺激后TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 脂多糖刺激后TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA水平

3 討論

EECP為一種非侵入性技術(shù)，用于治療不適合常規(guī)冠脈血管重建術(shù)的難治性患者， 而且已有文獻證明EECP可減少患有穩(wěn)定型心絞痛患者的運動誘發(fā)的局部缺血時間[7]。另外，還能減少嚴(yán)重左心室功能不全(射血分?jǐn)?shù)≤35%)患者的心絞痛發(fā)作并改善生活質(zhì)量，并且這些改善可持續(xù)5 a[8]。單核巨噬細(xì)胞為動脈粥樣硬化斑塊的成分，脂多糖與單核細(xì)胞脂多糖受體結(jié)合后，誘導(dǎo)單核細(xì)胞合成炎性細(xì)胞因子、黏附分子等[9]。本研究中，對照組患者的血清中IL-6、Hs-CRP、IL-1β維持較高水平，且受脂多糖刺激后，IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平升高更加顯著，均明顯高于觀察組，這也說明增強的體外反搏可能抑制了外周血單個核細(xì)胞的活性。然而，迄今為止，研究尚未闡明EECP治療心血管疾病的作用機制和總體療效。

研究表明，EECP的每個階段可以被認(rèn)為是通過增加脈動和振蕩流動，并提供直接劑量的血管藥物，從而對內(nèi)皮提供改善其功能的“按摩”形式[10]。文獻顯示，穩(wěn)定心絞痛患者常伴有較高水平的氧自由基，且自由基清除酶活性較低，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)氧自由基生成增多及脂質(zhì)過氧化堆積，并加速冠狀動脈痙攣和冠狀動脈硬化進展，而冠狀動脈痙攣和冠狀動脈硬化可導(dǎo)致患者產(chǎn)生缺血—再灌注損傷，并導(dǎo)致血管內(nèi)的促炎反應(yīng)[11]。本研究針對穩(wěn)定性勞累型心絞痛患者進行了增強型體外反搏治療，結(jié)果顯示觀察組患者的血清IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平明顯低于對照組，提示EECP降低了機體的炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清IL-6、Hs-CRP、IL-1β水平與脂多糖刺激分泌的IL-6、Hs-CRP、IL-1β顯著相關(guān)，表明增強型體外反搏可能觸發(fā)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)和自我修復(fù)功能，改善了器官和組織的血液灌注，從而改變血管內(nèi)皮細(xì)胞供氧水平和代謝能力[10]，減少炎癥介質(zhì)的分泌，減少炎癥損傷。

已有文獻顯示，穩(wěn)定性勞累型心絞痛患者伴有高水平的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)[12]，而高水平的ROS會促進IKB的釋放和NF-κB的核轉(zhuǎn)位，并通過對NF-κB亞基的修飾以及NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄輔助因子的修飾調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。而TLR4屬于TLR家族蛋白，能通過激活Toll樣受體信號通路中的接頭分子MyD88，傳遞上游信息并激活NF-κB等信號通路，級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)血管損傷。高水平的ROS可以直接或間接激活TLR4/NF-κB信號通路級聯(lián)反應(yīng)，增加炎性因子表達水平，促進機體的炎癥反應(yīng)[13]。本研究中，觀察組患者PBMC的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平明顯降低。而PBMC接受脂多糖刺激后，TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平整體增加，但與對照組比較，仍然呈現(xiàn)較低水平，這也驗證了EECP對TLR4/NF-κB信號通路的影響，通過抑制TLR4活性，減弱傳遞到NF-κB的炎癥信號，降低MyD88、NF-κB的表達水平，并反饋抑制外周血單個核細(xì)胞分泌IL-6、Hs-CRP、IL-1β。

總之，EECP可通過調(diào)節(jié)穩(wěn)定性勞累型心絞痛患者炎癥水平，減少機體損傷，其機制可能與TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)，從而達到臨床治療的目的。