黑木耳的酶法液化加工條件研究

魏文毅　苗家尉　牛廣財　王鶴霖　賈 建　魏春紅

摘要：為提高黑木耳的深加工水平，采用單因素和正交試驗，研究果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶對黑木耳液化效果的影響，優(yōu)化復合酶法液化條件。結果表明：多酶復合處理液化黑木耳漿料，能明顯提高其還原糖含量。適宜酶解條件為：固液比1∶6，三酶復合（果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶，1∶1∶8），總用酶量3.2%（m/m），加酶方式為同時添加，作用溫度55 ℃，適宜pH 5.5，時間4 h，處理樣中的還原糖含量可達1.96%。

關鍵詞：黑木耳;酶法水解;試驗;黏度;還原糖含量

中圖分類號：S646.4;TS201.1? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1674-1161（2019）04-0038-05

黑木耳（Auricularia auricula）是一種自然生長或人工栽培的藥食兩用真菌，具有較高的營養(yǎng)和保健價值。眾多研究表明，黑木耳多糖為黑木耳的重要功能活性成分，衍生出以此為目標產(chǎn)物的多種制備方法，主要有熱水浸提法、堿浸提法、酶解提取法、超聲波法等，這些方法都需要將黑木耳液態(tài)化，以獲得黑木耳多糖產(chǎn)品。其中，酶法具有條件溫和、工藝簡便、省時，產(chǎn)品提取率高、品質優(yōu)等優(yōu)點，相關的研究報道較多，所涉及的酶有果膠酶、纖維素酶和蛋白酶等，但絕大多數(shù)采用的是單一酶處理，用復合酶處理的較少，對液態(tài)化黑木耳（黑木耳提取液）的特性研究更少。以開發(fā)液態(tài)化及相關黑木耳制品為最終目的，深入研究復合酶法液化黑木耳的工藝條件，探討液態(tài)化黑木耳體系的黏度變化，為提高黑木耳的深加工水平提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳（干品）：大慶市九區(qū)果蔬批發(fā)市場;纖維素酶（ 3萬U/ g）和果膠酶（ 2萬U/ g）：北京奧博星生物技術有限責任公司;木瓜蛋白酶（ 120萬U/ g）：河北天旭實業(yè)有限責任公司.

氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、3，5-二硝基水楊酸（DNS），葡萄糖，三羥甲基胺基甲烷（Tris），濃鹽酸等均為分析純，來自天津金匯太亞化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

AR223CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司;L420臺式低速自動平衡離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司;NDJ-79型旋轉粘度計：上海精密儀器儀表有限公司;UV-1100紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司;SevenMulti pH計：梅特勒-托利多國際股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

1） 工藝流程。黑木耳→浸泡→清選→加水打漿→膠體磨細化→酶解→滅酶→冷卻→過濾→濾液→檢測

2） 操作要點。將稱重黑木耳用適量清水泡發(fā)（室溫，12 h）后清選除雜;按一定的固液比加水，用高速組織搗碎機打漿，再過一遍膠體磨;稱取一定量的黑木耳漿料漿在恒溫水浴鍋中預熱（10 min），添加適量活酶，在一定條件下水解;對酶解樣液酶滅活（100 ℃，5 min），冷卻;將滅酶樣液用潔凈尼龍濾布（80目）過濾，對濾液進行黏度和還原糖含量測定。

1.3.2 酶解條件的單因素試驗

1） 固液比。加水打漿時，設置固液比分別為1︰3、1︰4、1︰5和1︰6（質量比），取100 g漿料進行酶解，分別選取3種酶（果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶）單獨處理，其他條件固定（酶量1.2%、時間2 h、溫度50 ℃、自然pH），設不加酶處理組為對照。

2） 單酶處理。分別用上述3種酶進行酶解，加酶量設置0，0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%和2.8%共8個水平，酶解2 h，固液比1∶6，其他條件為3種酶各自的最適合條件。

3） 雙酶復合處理。將上述3酶兩兩組合，分別設置8∶2、6∶4、5∶5、4∶6和2∶8共6個水平。固液比1∶6，總用酶量均為2.4%，其他條件相同（溫度50 ℃、自然pH，時間2 h）。

4） 三酶復合處理。選取上述3種酶同時作用，設置4∶1∶5、3∶1∶6、2∶1∶7、1∶1∶8、1∶2∶7、1∶3∶6和1∶4∶5共7個水平。同時，酶總用量分別設置1.2%、1.6%和2.0%共3個水平。其他條件同3。

1.3.3 復合酶處理條件優(yōu)化 在上述試驗結果的基礎上，采用正交試驗L9（34）設置4個因素（加酶量、提取pH、提取溫度、時間）3水平試驗，對三酶復合水解條件進行優(yōu)化。復合酶（果膠酶∶纖維素酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶8）同時添加，以還原糖含量為考察指標，每水平重復3次。

1.3.4 測定指標與方法 采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）測定還原糖含量;黏度測定采用NDJ-79型旋轉粘度計。

2 結果與分析

2.1 料液比對黑木耳漿料黏度和還原糖含量的影響

料液比對黑木耳漿料黏度和還原糖含量的影響分別見圖1和圖2。

如圖1所示，單酶處理時，酶解液的黏度變化在不同料液比間具有差異，其中1∶3和1∶4與1∶5和1∶6之間差異顯著（p<0.05），但1∶5顯著高于1∶6。

由圖2所示，單酶處理時，酶解液中的還原糖含量均先升高后降低，但最高值所對應的料液比有所不同（果膠酶、纖維素酶為1∶4，木瓜蛋白酶為1∶5），且變化幅度不同。

試驗結果顯示：黑木耳漿料酶解液的黏度和還原糖含量均隨著料液比的增大而明顯降低;料液比對3種酶發(fā)生水解反應的影響具有一致性：當料液比偏小時，黏度較高，酶促反應在一定程度上受抑制，但因底物濃度較高，因此還原糖含量整體較高;隨料液比增加，反應效率亦增強，還原糖含量進一步增加;隨料液比繼續(xù)增加，雖反應效率較高，但稀釋效應導致還原糖含量降低。

與對照組相比，加酶處理組降低漿料體系黏度，提高還原糖含量，兩者的變化量均隨料液比的增大而增加（圖3和圖4）。進一步分析表明，對物料體系黏度的影響，纖維素酶和木瓜蛋白酶大強于果膠酶，對還原糖含量的影響則相反。

2.2 單酶和復合酶對黑木耳漿料黏度的影響

單酶處理時，酶解液黏度隨加酶量的增多均呈下降趨勢（圖5）。其中，纖維素酶處理組顯著低于果膠酶處理組（p<0.01）;但當加酶量>1.2%時，纖維素酶處理組與木瓜蛋白酶之間差異極顯著（p<0.01）;當加酶量>0.4%時，果膠酶處理組與木瓜蛋白酶之間存在顯著差異（p<0.05）。

上述結果表明：所用單酶處理均可降低黑木耳漿料體系的黏度，其中木瓜蛋白酶處理組的黏度下降最快，變化幅度最大。因此，可初步推測黑木耳漿料的高黏度特性受所含有的多糖、蛋白質及糖蛋白復合物等大分子物質影響，尤其是蛋白組分的影響最大。

雙酶處理時，各處理組樣液的黏度變化不同（圖6）。在果膠酶同纖維素酶的組合中，不同比例間差異不明顯，但樣液黏度隨纖維素酶比例增加呈降低趨勢，說明纖維素酶對體系黏度降低的影響較果膠酶大，這與上述結果一致;在果膠酶與木瓜蛋白酶的組合中，黏度最低值出現(xiàn)在6∶4，就整體而言，木瓜蛋白酶在組合中比例的增加使黏度呈升高，纖維素酶與木瓜蛋白酶組合中也出現(xiàn)此現(xiàn)象，這與前述結果不一致（圖3和圖5），需進一步研究其原因。

果膠酶與木瓜蛋白酶組合處理樣的黏度整體均顯著高于其它兩個組合的（p<0.01）。同時，三酶兩兩組后，雙酶處理樣的黏度均顯著高于對應單酶處理樣（p<0.01）。

三酶組合處理時，各處理對黏度的影響不同（圖7）。在三酶配比固定時，酶用量增加，樣液黏度降低明顯，其中酶用量為1.2%時，其與1.6%和2.0%之間分別具有顯著差異（p<0.05）和極顯著差異（p<0.01），但在3個酶用量水平中，1∶4∶5（果膠酶︰纖維素酶︰木瓜蛋白酶）的黏度最低，說明在復合酶體系中，較高比例的纖維素酶和木瓜蛋白酶對體系的黏度降低作用較大，這與兩者在單酶處理時的效應一致（圖5）。然而，復合酶（雙酶和三酶）與不加酶和加單酶處理樣相比，樣液黏度降低程度很小，有的甚至還略升高。其原因分析可能有：一是所用酶本身為蛋白質，酶促反應后未能從反應體系中去除，尤其是100 ℃，5 min滅酶操作可能使酶蛋白分子間反應形成大分子復合物，從而引起黏度略升高，抵消酶水解對體系黏度降低效應;二是復合酶處理較單一酶更能使黑木耳破壁，更有利于組織中可溶性多糖等可溶性組分溶出，使樣液處于較高黏度，甚至升高。

2.3 單酶和復合酶對黑木耳漿料還原糖含量的影響

單酶處理時，由圖8可知，隨酶用量的增加，各處理中還原糖含量變化不同，但均呈增加趨勢（圖8）。其中，單酶用量大于0.8%時，果膠酶和纖維素酶對還原糖含量的增加變化與木瓜蛋白酶之間的差異極顯著（p<0.01），其它處理間差異不顯著（p>0.05）。

雙酶處理時，各處理組樣的還原糖含量變化不同（圖9）。果膠酶與纖維素酶組合中，果膠酶對體系還原糖含量增加的貢獻較纖維素酶大，這與前述結果一致（圖4和圖8）;在木瓜蛋白酶組合中，較高比例的木瓜蛋白酶對還原糖含量增加的貢獻較大（圖9），這一點與上述結果相反（圖4和圖8）。

果膠酶與纖維素酶組合處理的還原糖含量均顯著低于其它2種組合（p<0.01），且該2種組合間差異不顯著（p>0.05）。另外，雙酶組合處理（除果膠酶︰纖維素酶=2∶8外）還原糖含量均明顯高于對應單酶處理（p<0.01）。

就對還原糖含量的影響而言，雙酶處理明顯高于單酶處理，其效應不是各單酶的簡單疊加，而是協(xié)同效應。

不同的三酶組合比例和總酶量差異，對樣品還原糖含量影響程度不同（圖10）。固定三酶配比時，隨酶用量增加，樣品中還原糖含量增加明顯。其中，1.2%加酶量與1.6%和2.0%之間的差異極顯著（p<0.01），但1.6%與2.0%間的差異不顯著（p>0.05）。在酶用量漸增的三水平中，最高還原糖含量值分別為0.414%、0.578%和0.679%，其對應的三酶配比（果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶）分別為1∶2∶7，1∶1∶8，1∶1∶8，說明木瓜蛋白酶占比例較高的復合酶處理體系中，樣品還原糖含量變化較大。

在單酶處理、雙酶處理和三酶復合中，三酶組合既能使酶用量降低，又能使黑木耳漿料中的還原糖含量升高。因此，選擇果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶組合比例為1∶1∶8。

2.4 復合酶對黑木耳漿料水解條件的優(yōu)化

同時添加三酶（果膠酶︰纖維素酶︰木瓜蛋白酶=1∶1∶8），設置四因素（溫度、酶量、pH、時間）和每因素三水平對黑木耳漿料進行酶解優(yōu)化處理，測定處理樣中還原糖含量及分析如表1所示。

對還原糖含量影響由大到小的因素分別為加酶量、酶解時間，作用溫度。復合酶水解處理條件的最佳優(yōu)化組合為A1B3C2D2，即作用溫度45 ℃，酶用量3.2%，pH為5.5，作用時間4 h。綜合分析試驗結果，確立復合酶液化黑木耳的適宜參數(shù)為：固液比1∶6，復合酶（果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶，1∶1∶8）酶總用量3.2%（m/m），溫度55 ℃，pH為5.5，作用時間為4 h。在該條件下進行驗證試驗，樣品中還原糖含量的平均值為1.963%，液化黑木耳中的還原糖含量經(jīng)復合酶處理后可明顯提高。

3 結論

對黑木耳漿料黏度和還原糖含量變化的影響而言，前者單一酶大于復合酶，后者則相反。單獨使用木瓜蛋白酶，對黑木耳漿料中還原糖含量變化的影響較弱，但在復合酶處理中，它在果膠酶和纖維素酶對還原糖含量增加作用中體現(xiàn)出協(xié)同性。多酶復合處理液化黑木耳漿料能明顯提高其還原糖含量，對其適宜酶解條件為：料液比1∶6，三酶復合（果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶，1∶1∶8），總用酶量3.2%（m/m），加酶方式為同時添加，作用溫度55 ℃，適宜pH 5.5，時間4 h。

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Abstract： In order to improve the processing level of black fungus， the effects of pectinase， cellulase and papain on liquefaction of the black fungus were studied by single factor and orthogonal test， and the compound enzymatic liquefaction conditions were optimized. The results showed that： The content of reducing sugar in the black fungus slurry can be improved multi-enzyme compound treatment. The suitable enzymolysis condition of the black fungus were as follows： The solid-liquid ratio 1∶6， compounded by three enzymes （pectinase， cellulase， papain = 1∶1∶8）， the total amount of enzyme 3.2% （m/m）， and the enzyme was added at the same time. The enzymatic hydrolysis conditions was at pH 5.5， temperature 55 ℃ for 4 h. Under these conditions， the reducing sugar content reached up to 1.96%.

Key words： black fungus; enzymatic hydrolysis; experiment; viscosity; reducing sugar content