保溫發(fā)酵魚露中細(xì)菌群落的16S rDNA分子生態(tài)分析

王香君,段 杉

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,四川南充 637000; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

魚露,又名魚醬油,是一種在高鹽條件下利用魚體自身酶系和多種微生物的協(xié)同作用,將海產(chǎn)低值魚等原料中蛋白質(zhì)、脂肪等成分進(jìn)行數(shù)年發(fā)酵分解而成的營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的液體調(diào)味品[1]。

目前,關(guān)于魚露中微生物的研究多采用平板計(jì)數(shù)、分離等傳統(tǒng)的純培養(yǎng)法,基于此方法在魚露微生物的研究中取得了一定的成果[2-3]。Kilinc等[4]和Harikedua等[5]利用平板計(jì)數(shù)法研究魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌、真菌的數(shù)量變化情況,而一些文獻(xiàn)報(bào)道從發(fā)酵魚產(chǎn)品中篩選出一些耐鹽或嗜鹽的乳酸菌[3-4]。但由于自然環(huán)境樣品中僅有不到1%的微生物可培養(yǎng),因此用純培養(yǎng)法不能很好反映微生物群落存在的真實(shí)狀態(tài)。而基于高通量測序的16S rDNA分子生態(tài)分析技術(shù),通過對(duì)細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增、分析,可以準(zhǔn)確分析樣品中細(xì)菌群落的組成,利于鑒定低豐度物種,現(xiàn)已成為研究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的重要手段[6]。胡小喜等[7]利用此技術(shù)研究了不同發(fā)酵條件的蝦油細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成情況,結(jié)果檢測出蝦油中細(xì)菌多達(dá)1285屬,全面的揭示蝦油中的細(xì)菌組成,相對(duì)于篩選和計(jì)數(shù)微生物的平板計(jì)數(shù)法具有明顯優(yōu)勢(shì)。

傳統(tǒng)魚露生產(chǎn)常采用露天發(fā)酵方式,工藝受氣候條件影響較大,工藝穩(wěn)定性差,衛(wèi)生條件不易控制,大量雜菌滋生,安全性低。胡小喜等[7]研究指出,35 ℃條件下,蝦油中蛋白酶失活較少,且存在大量產(chǎn)生良好風(fēng)味的細(xì)菌。張豪等[8]、黃紫燕等[9]對(duì)(30±5) ℃發(fā)酵條件下的魚露進(jìn)行研究。王香君等[10]用FQ-PCR法和平板計(jì)數(shù)法檢測到發(fā)酵魚露樣品的真菌總數(shù)遠(yuǎn)低于細(xì)菌總數(shù)。Kilinc等[4]和Harikedua等[5]研究指出在魚露發(fā)酵過程中真菌數(shù)量很少,在魚露發(fā)酵過程中真菌作用很小。因此試驗(yàn)采用16S rDNA高通量測序技術(shù)研究35 ℃發(fā)酵條件下魚露的細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu),從而揭示魚露發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的演替規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚露原材料:5種新鮮魚(包括頭、內(nèi)臟等)混合而成,質(zhì)量百分比分別是雙斑瓦鰈(Poecilopsettaplinthus)2.3%、短尾大眼鯛(Priacanthusmacracanthus)5.2%、翼紅娘魚(Lepidotriglaalata)5.4%、鲬(Platycephalusindicus)6.3%、眶棘雙邊魚(Ambassisgymnocephalus)80.8% 陽江市海陵島,加冰塊方式及時(shí)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室快速處理；D6005真菌/細(xì)菌DNA提取試劑盒 ZYMO RESEARCH生物科技公司；GeneJET膠回收試劑盒 Thermo Scientific公司;NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒 New England Biolabs公司;食鹽 廣東省鹽業(yè)集團(tuán)有限公司;硝酸銀、鉻酸鉀等均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DPX-9082B-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備公司;LX-C50L立式壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;JA2003電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1FDA 型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;5415D高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;TL-MM-1型微量振蕩器 廣州云薈貿(mào)易有限公司;DYCP-31CN水平電泳儀 北京六一儀器廠;GEL-DOL 2000電泳凝膠成像分體系統(tǒng) BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚露樣品的制備 按照工廠生產(chǎn)魚露的工藝進(jìn)行制備,將原料魚與食鹽按3∶1的質(zhì)量比直接混勻,然后再將魚露樣品放置于35 ℃的恒溫箱中恒溫發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間12個(gè)月,發(fā)酵過程中每隔5 d取樣測定含鹽量后,用無菌水補(bǔ)加蒸發(fā)的水分以保持鹽度恒定(25%,w/w)。并于發(fā)酵0、2、8、12個(gè)月時(shí)用滅菌的100 mL離心管取樣(取樣時(shí),將魚露發(fā)酵液混勻),備用。

1.2.2 魚露樣品中細(xì)菌DNA的提取 將1.2.1取得的樣品在無菌條件下先用快速濾紙(滅菌處理)過濾掉粗顆粒后,用0.22 μm無菌濾膜過濾菌體,然后用無菌水將濾膜上的菌體洗下來。使用D6005真菌/細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌體總DNA。所有DNA樣品均于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)菌計(jì)數(shù) 根據(jù)Castillo等[11]報(bào)道,采用FQ-PCR法對(duì)魚露中的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),并照王香君等[10]方法對(duì)樣品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4 16S rDNA 分子生態(tài)分析 以稀釋后的細(xì)菌總DNA為模板,用帶Barcode的16S rDNA V4區(qū)特異引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增16S rDNA 的V4區(qū),用GeneJET 膠回收試劑盒回收純化后的PCR產(chǎn)物,再使用NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測,合格后,使用MiSeq進(jìn)行上機(jī)由北京諾禾致源科技股份有限公司完成測序,測序得到原始數(shù)據(jù)(Raw Data)。

原始數(shù)據(jù)包含一定的接頭污染序列、低質(zhì)量數(shù)據(jù)等,會(huì)影響后續(xù)的分析,為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠,需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。數(shù)據(jù)過濾得到clean data后,根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系,將成對(duì)雙端reads拼接為一條序列,再以97%序列相似性為閾值,對(duì)clean data進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析,并將OTUs和物種注釋結(jié)合,從而得到每個(gè)樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。通過對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、α-多樣性、β-多樣性分析,同時(shí)對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析,得到細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)。

1.2.5 指標(biāo)測定 含鹽量(以氯化鈉計(jì)):參照GB/T 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測定和分析結(jié)果采用Excel進(jìn)行處理,結(jié)果采取均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)及物種注釋分析

圖1、表1顯示,發(fā)酵0、2、8、12個(gè)月的魚露中細(xì)菌分別測得78524、44031、29512、26744條序列,在科水平上,各樣品的序列占比在70%以上,在屬水平上,各樣品的序列占比在50%以下。其中分別有69869、33520、21531、19742條注釋到科,分別有34919、21182、12453、11777條注釋到屬。4個(gè)樣品測得的序列分別聚類了1197、1385、1286、1170個(gè)OTUs,圖2中有492個(gè)OTUs是所有發(fā)酵魚露樣品共同的,而8個(gè)月和12個(gè)月共同的OTU數(shù)量最多,達(dá)到818個(gè),這說明發(fā)酵8個(gè)月和發(fā)酵12個(gè)月的魚露中細(xì)菌群落構(gòu)成差異小。

表1 各分類水平上的序列數(shù)以及各自占比Table 1 The numbers of tags and their proportions at the different levels

圖1 不同樣品的序列和OTUs數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig.1 Statistics of the numbers of tags and OTUs in different samples

圖2 OTU交集韋恩圖Fig.2 Intersected Venn diagram analysis of OTU注:圖中數(shù)字代表樣品的OTUs數(shù)量。

熱圖展示了每個(gè)樣品中的物種組成及豐度信息,圖3顯示,不是所有的序列聚類到OTU后都能注釋到種,部分OTUs只能注釋到目、科、屬,有的只能注釋到界。結(jié)合表1可知,由于注釋到種的序列較少,并且種與種之間的差異性不明顯,會(huì)存在測序錯(cuò)誤等情況,同時(shí)所有細(xì)菌OTUs中有50%左右的未能注釋到屬,因此本文選擇對(duì)注釋到目和科的物種進(jìn)行研究。

圖3 不同樣品的OTU及分類注釋結(jié)果的熱圖Fig.3 Heatmap analysis of OTU and species annotation from different samples注:熱圖中的顏色表示一個(gè)OTU或分類所包括的序列數(shù)目的高低水平(顏色越深表示越高), 數(shù)字表示某個(gè)樣品中某個(gè)OTU或分類所包括的序列數(shù);k:界,p:門,c:綱,o:目,f:科,g:屬,s:種。

2.2 魚露樣品中細(xì)菌群落的α-多樣性分析

多樣性分析用于分析樣品內(nèi)的群落多樣性,主要包含指標(biāo):稀釋曲線、Chao1指數(shù)曲線、Shannon指數(shù)曲線,結(jié)果分別見圖4、圖5、圖6。

由稀釋曲線(見圖4)可知,當(dāng)隨機(jī)抽取的測序條數(shù)逐漸增加時(shí),4個(gè)樣品的稀釋曲線均逐漸趨于平緩,說明4個(gè)樣品的測序結(jié)果基本反映了魚露樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。分析Chao1指數(shù)曲線(見圖5)可知,當(dāng)樣品測序量在5000～10000條之間時(shí),Chao1指數(shù)曲線逐漸趨于平緩,當(dāng)達(dá)到10000條后,Chao1指數(shù)曲線幾乎保持水平,進(jìn)入一個(gè)穩(wěn)定的平臺(tái)期。韓亞飛等[12]指出Chao1指數(shù)值越高表明群落物種的豐富度越高,而除了發(fā)酵0個(gè)月的樣品外,各發(fā)酵魚露樣品的Chao1指數(shù)值是發(fā)酵2個(gè)月>發(fā)酵8個(gè)月>發(fā)酵12個(gè)月,這說明發(fā)酵過程中魚露中細(xì)菌群落的豐富度逐漸降低。樣品的Shannon指數(shù)曲線(見圖6)顯示,當(dāng)樣品的測序條數(shù)在1000左右時(shí),曲線逐漸趨向平坦,并進(jìn)入平臺(tái)期,說明測序數(shù)據(jù)量足夠大,可以反映樣品中絕大多數(shù)的細(xì)菌群落信息。韓亞飛等[12]指出Shannon指數(shù)值越大說明群落多樣性越高,魚露發(fā)酵0個(gè)月時(shí)Shannon指數(shù)值為4.4,魚露發(fā)酵2個(gè)月、8個(gè)月、12個(gè)月時(shí)Shannon指數(shù)值為6.7,其中8個(gè)月時(shí)Shannon指數(shù)值最高,這說明2個(gè)月、8個(gè)月、12個(gè)月的發(fā)酵魚露中細(xì)菌群落多樣性明顯比0個(gè)月的高。

圖4 稀釋曲線Fig.4 Rarefaction curve

圖5 Chao1指數(shù)曲線Fig.5 Chao1 index curve

圖6 Shannon指數(shù)曲線Fig.6 Shannon index curve

2.3 魚露樣品中細(xì)菌群落的β-多樣性分析

β-多樣性分析是對(duì)不同樣品的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較,反應(yīng)不同樣品的微生物群落構(gòu)成的主要指標(biāo)有加權(quán)Unifrac(定量)/非加權(quán)Unifrac(定性)距離、主成分/主坐標(biāo)分析、樣品聚類分析等,其中以(非)加權(quán)Unifrac距離繪制的β-多樣性指數(shù)熱圖的結(jié)果見圖7。

圖7 β-多樣性指數(shù)熱圖Fig.7 β-diversity heatmap analysis注:同一方格中,上下兩個(gè)值分別代表加權(quán)unifrac和非加權(quán)unifrac距離。

由于兩個(gè)樣品間的相異系數(shù)是由加權(quán)Unifrac距離來衡量,距離越小,表示這兩個(gè)樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。圖7顯示,魚露發(fā)酵0個(gè)月和2個(gè)月之間、0個(gè)月和8個(gè)月之間、0個(gè)月和12個(gè)月之間的加權(quán)Unifrac和非加權(quán)Unifrac距離值分別為(0.249,0.432)、(0.332,0.423)、(0.318,0.426);發(fā)酵12個(gè)月和2個(gè)月之間、12個(gè)月和8個(gè)月之間的加權(quán)Unifrac和非加權(quán)Unifrac距離值分別為(0.134,0.357)、(0.042,0.328)?？梢?魚露發(fā)酵前(0個(gè)月)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與后期(8、12個(gè)月)的群落結(jié)構(gòu)差異較大;而發(fā)酵后期,8個(gè)月與12個(gè)月的群落結(jié)構(gòu)差異較小。這說明在魚露發(fā)酵初期,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化較大,越到發(fā)酵后期,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化越小,群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

2.4 魚露中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 發(fā)酵魚露中細(xì)菌群落在各分類水平上的組成 根據(jù)物種注釋結(jié)果顯示,發(fā)酵魚露中細(xì)菌多達(dá)37個(gè)門、99個(gè)綱、144個(gè)目、200個(gè)科,有的序列甚至無法鑒定,細(xì)菌群落構(gòu)成復(fù)雜。由于部分分類相對(duì)豐度較低,推測這些細(xì)菌屬污染的細(xì)菌,因此我們只選取了相對(duì)豐度排名前10的分類進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并根據(jù)FQ-PCR測得細(xì)菌總數(shù)算出它們各自的數(shù)量,結(jié)果分別見圖8、圖9、圖10、表2、表3、表4。

表2 魚露發(fā)酵各階段中細(xì)菌群落在門分類水平上的各自數(shù)量(lg(個(gè)/mL))Table 2 Comparison of the number of bacteria in fish sauce at the level of phylum(lg(個(gè)/mL))

表3 魚露發(fā)酵個(gè)階段中細(xì)菌群落在目分類水平上的各自數(shù)量(lg(個(gè)/mL))Table 3 Comparison of the number of bacteria in fish sauce at the level of order

表4 魚露發(fā)酵個(gè)階段中細(xì)菌群落在科分類水平上的各自數(shù)量(lg(個(gè)/mL))Table 4 Comparison of the number of bacteria in fish sauce at the level of family

圖8 魚露中細(xì)菌群落在門分類水平上的組成Fig.8 Composition of bacterial community in fish sauce at the level of phylum

圖9 魚露中細(xì)菌群落在目分類水平上的組成Fig.9 Composition of bacterial community in fish sauce at the level of order

圖10 魚露中細(xì)菌群落在科分類水平上的組成Fig.10 Composition of bacterial community in fish sauce at the level of family

圖8和表2顯示,通過16S rDNA高通量測序分析得出發(fā)酵魚露在各個(gè)發(fā)酵階段中的細(xì)菌主要分布在變形菌門和厚壁菌門,其他優(yōu)勢(shì)菌所屬的門還有酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門。變形菌門的相對(duì)豐度逐漸增加,由發(fā)酵0個(gè)月的43.69%逐漸增加到發(fā)酵12個(gè)月的68.79%,相對(duì)豐度波動(dòng)相對(duì)較小,數(shù)量從1.07×105個(gè)/mL逐漸減少到2.82×104個(gè)/mL。而厚壁菌門的相對(duì)豐度波動(dòng)相對(duì)較大,從發(fā)酵0個(gè)月的52.63%逐漸減少到發(fā)酵12個(gè)月的19.39%,數(shù)量從1.29×105個(gè)/mL逐漸減少到7.94×103個(gè)/mL,推測是由于魚露發(fā)酵是開放式的,不斷受到環(huán)境中各種微生物的污染,同時(shí)在發(fā)酵過程中要定時(shí)攪拌,促使魚鹽混勻,因此可能使得魚露中污染的細(xì)菌數(shù)量增加、厭氧微生物和兼性厭氧微生物的生長受到抑制。在好氧微生物和厭氧微生物的分類中,變形菌門中假單胞菌目、交替單胞菌目基本都是好氧微生物,而厚壁菌門中乳桿菌目、芽孢桿菌目的大部分是厭氧或兼性厭氧微生物[13]。

在目類水平上(見圖9、表3),魚露在各個(gè)發(fā)酵階段中的細(xì)菌主要分布在假單胞菌目、芽孢桿菌目、乳桿菌目。芽孢桿菌目的相對(duì)豐度在發(fā)酵初期降低明顯,從0個(gè)月的39.42%降低到2個(gè)月的11.84%,數(shù)量從9.55×104個(gè)/mL降到4.17×103個(gè)/mL;假單胞菌目的相對(duì)豐度變化不明顯,0個(gè)月和12個(gè)月相對(duì)豐度分別為31.31%和 30.12%,但數(shù)量呈降低趨勢(shì),數(shù)量分別為7.59×104個(gè)/mL和1.23×104個(gè)/mL;乳桿菌目的相對(duì)豐度呈先增加后降低、再趨于平緩的變化趨勢(shì),數(shù)量從0個(gè)月的2.82×104個(gè)/mL降低到12個(gè)月的3.24×103個(gè)/mL。

圖10和表4顯示,在科類水平上,主要分布在葡萄球菌科、莫拉菌科、鏈球菌科、乳桿菌科、假單胞菌科,其中芽孢桿菌目所包含的葡萄球菌科的相對(duì)豐度波動(dòng)較大,從0個(gè)月的38.77%降低到12個(gè)月的9.12%,數(shù)量從9.33×104個(gè)/mL降到3.72×103個(gè)/mL,數(shù)量降低明顯,降低了1.4個(gè)數(shù)量級(jí),推測可能是由于發(fā)酵初期高鹽抑制了大部分的葡萄球菌科細(xì)菌的生長。假單胞菌目所包含的莫拉菌科相對(duì)豐度和數(shù)量在發(fā)酵初期迅速降低,然后再緩慢增加,而假單胞菌科的相對(duì)豐度一直呈增長趨勢(shì),數(shù)量變化不明顯,數(shù)量在3.0～5.9×103個(gè)/mL范圍內(nèi),但這些細(xì)菌部分是食品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌,會(huì)產(chǎn)生腥臭味、硫化氫味等不良?xì)馕?影響魚露的風(fēng)味和安全性[14]。乳桿菌目所包含的鏈球菌科、乳桿菌科的相對(duì)豐度呈先降低、后增加、再降低、后再趨于平緩的曲線增減,而數(shù)量分別從0個(gè)月的1.32×104個(gè)/mL、7.59×103個(gè)/mL降低到12個(gè)月的1.48×103個(gè)/mL、1.38×103個(gè)/mL,數(shù)量降低了1個(gè)數(shù)量級(jí)左右,這說明鏈球菌科、乳桿菌科能在高鹽的環(huán)境中生存,并隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌。

2.4.2 發(fā)酵魚露中乳酸菌類群細(xì)菌的構(gòu)成分析 16S rDNA測序結(jié)果顯示發(fā)酵魚露中細(xì)菌多達(dá)238個(gè)屬,同時(shí)在測序得到的所有細(xì)菌OTUs中有50%左右的未能注釋到屬,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜。而現(xiàn)有報(bào)道指出一些耐鹽或嗜鹽的乳酸菌是發(fā)酵魚產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)菌群,產(chǎn)生的蛋白酶能將蛋白質(zhì)分解成活性肽、游離氨基酸等風(fēng)味物質(zhì),對(duì)魚露發(fā)酵過程中風(fēng)味的形成具有重要作用[2-3]。參考《乳酸菌:生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用》[15]中Bergey氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)、《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[16]以及盛海圓等[17]對(duì)于乳酸菌類群細(xì)菌的分類,對(duì)魚露發(fā)酵過程中乳酸菌的菌屬構(gòu)成進(jìn)行分析,結(jié)果見表5。

表5 魚露中乳酸菌類群細(xì)菌的構(gòu)成分析結(jié)果Table 5 Composition of lactic acid bacteria in fish sauce at different fermentation stages

由表5可知,檢測到魚露樣品中有10個(gè)為乳酸菌的屬或其中部分種為乳酸菌的屬,主要分布在鏈球菌屬、乳桿菌屬、葡萄球菌屬,他們的相對(duì)豐度分別由發(fā)酵0個(gè)月的5.34%、3.05%、2.11%逐漸變?yōu)?2個(gè)月的3.62%、3.23%、1.20%,鏈球菌屬、乳桿菌屬的相對(duì)豐度變化呈先增加、后降低、再趨于平緩的曲線增減趨勢(shì),其中鏈球菌屬的相對(duì)豐度波動(dòng)較大;葡萄球菌屬呈先降低、后增加的趨勢(shì),但相對(duì)豐度波動(dòng)較小。乳桿菌很少有致病菌,是食品發(fā)酵的主要功能菌,部分種能水解精氨酸產(chǎn)NH3;鏈球菌部分種能產(chǎn)生吡咯烷基芳酰胺酶以及水解精氨酸、馬尿酸;葡萄球菌屬能在高鹽的環(huán)境中生存,具有較強(qiáng)耐鹽性,部分種具有蛋白酶和脂肪酶活性,對(duì)于發(fā)酵肉制品風(fēng)味成分的形成具有重要作用[18]。同時(shí)在魚露中還檢測到低豐度的芽孢桿菌屬、片球菌屬、氣球菌屬、營養(yǎng)缺陷菌屬、魏斯氏菌屬、奇異菌屬、雙歧桿菌屬等乳酸菌。其中芽孢桿菌屬中少數(shù)種屬于乳酸菌,如凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、斯密氏芽孢桿菌(Bacillussmithii)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)等,部分種會(huì)產(chǎn)吲哚;氣球菌屬是鹽水腌肉的菌系,能耐高鹽環(huán)境,部分種會(huì)產(chǎn)亮氨酸氨肽酶、吡咯烷基芳酰胺酶;營養(yǎng)缺陷菌屬部分種會(huì)產(chǎn)亮氨酸氨肽酶;雙歧桿菌屬的部分種能產(chǎn)生丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸等多種氨基酸;片球菌屬、魏斯氏菌屬、奇異菌屬中部分種能水解精氨酸產(chǎn)NH3[16]。此外,由于50%左右的OTUs無法注釋到屬,在這些OTUs中是否是乳酸菌不得而知。

2.4.3 發(fā)酵12個(gè)月時(shí)魚露中細(xì)菌群落分析 對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行物種分類,可以篩選出特別關(guān)注的物種。現(xiàn)有研究表明微生物對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵魚產(chǎn)品風(fēng)味和生物活性成分的形成具有重要作用[19]。選擇對(duì)發(fā)酵12個(gè)月的魚露中細(xì)菌進(jìn)行物種分類樹統(tǒng)計(jì)(默認(rèn)在屬水平上,選擇樣品中最大相對(duì)豐度前10的屬所對(duì)應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行展示),見圖11。

發(fā)酵到12個(gè)月時(shí),發(fā)酵魚露的細(xì)菌在變形菌門(68.79%)、厚壁菌門(19.39%)、放線菌門(3.19%)、酸桿菌門(2.19%)、擬桿菌門(1.17%)等10個(gè)門類中均有分布,其中主要是變形菌門和厚壁菌門(見2.4.1)。變形菌門中以乳桿菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬為主,而厚壁菌門中以不動(dòng)菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬為主(見圖11)。多數(shù)研究報(bào)道指出乳桿菌屬中部分細(xì)菌即有產(chǎn)蛋白酶能力又能對(duì)發(fā)酵食品風(fēng)味的形成發(fā)揮重要作用,所以國內(nèi)外學(xué)者都致力于從魚露里篩選乳酸菌,并將它們應(yīng)用于魚露發(fā)酵中[20]。但在本試驗(yàn)中,乳酸菌目(7.93%)相對(duì)豐度和數(shù)量并不算高,推測是由于魚露在發(fā)酵過程中要定時(shí)攪拌,促使魚鹽混勻,使得乳桿菌屬中部分厭氧和兼性厭氧細(xì)菌的生長受到抑制。

圖11 發(fā)酵12個(gè)月的發(fā)酵魚露中細(xì)菌群落的特定物種分類樹Fig.11 Classification tree of bacterial community in fish sauce during fermentation from 12th month注:不同顏色的圓圈表示不同的分類水平,對(duì)應(yīng)左側(cè)圖例;圓圈的大小表示該分類的相對(duì)豐度大小;分類名下方的兩個(gè)數(shù)字均表示相對(duì)豐度百分率,前者表示該分類占所有分類中的百分率(相對(duì)豐度前10的屬占此分類的百分率);后者則表示該分類占所選取的分類中的百分率(以相對(duì)豐度前10的屬為百分制計(jì))。

現(xiàn)有研究在魚露中發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)菌還包括嗜鹽四鏈球菌屬、枝芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、鹽單胞菌屬、片球菌屬等[3,21-22]。本文也發(fā)現(xiàn)了高豐度的葡萄球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、嗜鹽單胞菌屬、片球菌屬,但未發(fā)現(xiàn)嗜鹽四鏈球菌、枝芽孢桿菌屬等細(xì)菌,這可能是由于原料、發(fā)酵環(huán)境等不同導(dǎo)致細(xì)菌菌相的差異。

3 結(jié)論

研究表明,用16S rDNA技術(shù)檢測出在35 ℃發(fā)酵條件下制得的魚露中細(xì)菌多達(dá)37個(gè)門、238個(gè)屬,能夠比較真實(shí)地反映其細(xì)菌群落構(gòu)成,較篩選和計(jì)數(shù)微生物的平板計(jì)數(shù)法具有明顯優(yōu)勢(shì)。發(fā)酵前期菌相結(jié)構(gòu)差異性較大,到發(fā)酵后期,菌相結(jié)構(gòu)逐漸趨于穩(wěn)定。在魚露發(fā)酵各階段都是優(yōu)勢(shì)菌的菌屬有鏈球菌屬、乳桿菌屬、不動(dòng)菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬。在發(fā)酵過程中,魚露中假單胞菌目中嗜冷桿菌屬、不動(dòng)菌屬、假單胞菌屬的相對(duì)豐度波動(dòng)較大,而耐鹽和嗜鹽的乳酸菌目中鏈球菌屬、乳桿菌屬的相對(duì)豐度波動(dòng)較小。