姬松茸多糖的提取及其對D半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

李雨鑫,盛 瑜,杜培革,安麗萍,楊瑩瑩,郭長春,王佳琪

(北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林吉林 132013)

姬松茸(AgaricusblazeiMurill,ABM),又稱巴西蘑菇、小松菇、柏氏蘑菇,是一種可栽培的名貴食用真菌[1]。姬松茸含有多糖、甾醇類物質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、外源凝集素、維生素等活性物質(zhì)[2]。其中姬松茸多糖(Agaricusblazeipolysaccharide,ABP)是其主要活性成分之一,具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降低血糖、降低膽固醇、抗炎等功效,具有較高的藥用價值[3-4]。據(jù)報道,D-半乳糖(D-gal)可引發(fā)擬衰老反應(yīng),導(dǎo)致免疫功能下降,對氧自由基代謝的損傷,造成與人體衰老基本一致的模型[5]。目前,姬松茸多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用鮮有報道。大量文獻(xiàn)表明食用菌多糖一般能夠促進(jìn)動物的脾臟和胸腺的發(fā)育[6-8],尤其對于還沒有發(fā)育完善或已經(jīng)受到某種免疫抑制的動物機(jī)體的免疫器官作用明顯[9-11]。據(jù)報道,真菌多糖能夠提高脾指數(shù),促進(jìn)機(jī)體非特異性免疫和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,提高血液循環(huán)中細(xì)胞因子含量,起到免疫調(diào)節(jié)作用[12-15]。

因此,本實驗通過觀察姬松茸多糖對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響,測定脾細(xì)胞增殖,并通過檢測免疫細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量,探究姬松茸多糖的免疫調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步開發(fā)姬松茸免疫功能食品提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù),為姬松茸深入開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姬松茸 沈陽聚鑫北蟲草菌業(yè)有限公司;SPF級雄性ICR小鼠(4～5周齡,體重(20.0±2.0)g,40只,實驗動物許可證編號為SCXK(吉)-2016-0003)、基礎(chǔ)飼料 長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 Solarbio公司;D-半乳糖、D-Hank’s液、CCK-8 美國Genview公司;RPMI-1640培養(yǎng)基 塞默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司;刀豆蛋白A(ConA) 美國Sigma公司;TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒 ABclonal公司。

UV-2550型紫外可見分光光度計 島津國際貿(mào)易有限公司;Infinite M200型酶標(biāo)儀 TECAN;恒溫生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司;SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司;LIFE Countess全自動細(xì)胞計數(shù)儀 美國Life Technologies公司;低溫高速離心機(jī) 美國eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姬松茸多糖的提取 姬松茸子實體粉碎→無水乙醇除雜→濾渣→烘干至恒重→水浸提→過濾→濃縮→醇沉→Sevage法[16]除蛋白→透析→冷凍干燥→姬松茸多糖[17,18]。

操作要點:將姬松茸子實體常溫粉碎,過60目篩。加入無水乙醇除雜,采用紗布進(jìn)行濾渣,放入烘箱中烘干至恒重,設(shè)定一定的料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)在恒溫水浴鍋中進(jìn)行水提,過濾并收集濾液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮;用3倍體積的無水乙醇醇沉過夜;室溫下進(jìn)行Sevage法除去蛋白并過夜;用截留分子量為3500 Da的透析袋,于蒸餾水中透析48 h以除去小分子物質(zhì),-80 ℃冷凍干燥3 d,得到姬松茸多糖。

1.2.2 標(biāo)曲的制作及多糖得率的計算 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品(0.1 mg/mL),苯酚-硫酸法[19]測定冷凍干燥后固體樣品多糖含量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖得率。計算公式為:

多糖得率(%)=[(C×D×V)/(W×1000)]×100

式中:C-冷凍干燥樣品多糖濃度(mg/mL);D-樣品稀釋倍數(shù);V-樣品體積(mL);W-樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 溫度對多糖得率的影響 固定反應(yīng)條件為料液比1∶30 g/mL、提取時間為3 h、提取次數(shù)為3次,考察不同溫度(60、70、80、90、100 ℃)對多糖得率的影響。

1.2.3.2 時間對多糖得率的影響 固定條件為料液比1∶30 g/mL、提取溫度為80 ℃、提取次數(shù)為3次,考察不同提取時間(1、2、3、4、5 h)對多糖得率的影響。

1.2.3.3 料液比對多糖得率的影響 固定反應(yīng)條件為提取溫度80 ℃、提取時間為3 h、提取次數(shù)為3次,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對多糖得率的影響。

1.2.3.4 提取次數(shù)對多糖得率的影響 固定每次反應(yīng)條件為料液比1∶30 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間為3 h,考察不同提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對多糖得率的影響。

1.2.4 正交試驗 以單因素實驗為基礎(chǔ),進(jìn)行正交實驗工藝設(shè)計,對姬松茸多糖得率影響的因素有提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、提取次數(shù)(D),詳見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Level of form factors

1.2.5 實驗動物模型建立及給藥 本實驗需雄性ICR小鼠40只,小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,實驗期間小鼠自由飲食、飲水,動物室溫度20.0～22.0 ℃,相對濕度50%～60%,將小鼠隨機(jī)分成5組,即空白對照組(CON)、模型組(MOD)、姬松茸多糖低劑量組(ABP-L,200 mg/kg)、姬松茸多糖中劑量組(ABP-M,400 mg/kg)、姬松茸多糖高劑量組(ABP-H,800 mg/kg),每組8只。CON組頸部皮下注射生理鹽水,其他各組均頸部皮下注射D-半乳糖溶液復(fù)制衰老模型,注射劑量為400 mg/kg。建立模型的同時灌胃給藥,ABP-L、ABP-M、ABP-H組給予相應(yīng)劑量姬松茸多糖(采用蒸餾水配制),CON與MOD給予等體積蒸餾水,連續(xù)注射及給藥42 d。

1.2.6 測定小鼠臟器指數(shù) 末次給藥后,禁食不禁水12 h后,對小鼠進(jìn)行稱重,使用摘除眼球方法收集血液,并脫頸處死小鼠,取出胸腺及脾臟稱重,計算臟器質(zhì)量與體重的比值(mg/g)。

臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量(mg)/動物體重(g)

1.2.7 刀豆蛋白(ConA)引起的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 試劑配制:RPMI培養(yǎng)液加入10%胎牛血清配成脾細(xì)胞培養(yǎng)液。用RPMI培養(yǎng)液配制成50 μg/mL ConA液,用0.22 μm的微孔濾膜過濾,分裝后-20 ℃中存放備用。

脾細(xì)胞懸液的制備:實驗在無菌操作室內(nèi)進(jìn)行,末次給藥結(jié)束后將小鼠脫頸椎處死,并用75%的乙醇對小鼠進(jìn)行消毒處理。在無菌操作臺中解剖小鼠,在玻璃平皿中加入適量D-Hank’s液,用手術(shù)鑷子輕輕夾住脾臟,剪掉周圍組織,取出后將其放入平皿中。用注射器對脾臟進(jìn)行研磨使其分散成單個細(xì)胞懸液,用移液槍吸取該細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)濾入離心管中,并用D-Hank’s液沖洗2次,1000 r/min離心10 min。離心后加入適量配制好的培養(yǎng)基,吹打細(xì)胞至均勻,用全自動細(xì)胞計數(shù)儀計脾細(xì)胞數(shù),并調(diào)整其濃度為1×107個/mL。

淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng):將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板中,其中每個孔各加90 μL脾細(xì)胞懸液,分為兩組,一組每孔加入10 μL ConA液,另一組設(shè)對照組,加入10 μL培養(yǎng)液,置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)終止,用全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm處的光密度(OD)值。

小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化(ΔOD570)=ODConA-OD無ConA

1.2.8 血清中TNF-a、IL-6含量測定 將小鼠摘除眼球取血后,離心取上清液。參照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的方法測定TNF-α、IL-6的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

在490 nm波長處測定的吸光度值,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)(mg/mL),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,計算得回歸方程Y=14.662X-0.0041,決定系數(shù)R2=0.9997,線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 單因素實驗結(jié)果

由圖2可知,隨著提取溫度的升高,多糖得率呈上升趨勢,在100 ℃時多糖得率最高,為了獲得高得率的同時降低工業(yè)化生產(chǎn)的能耗,本實驗選擇提取溫度80、90、100 ℃三個水平進(jìn)行正交試驗。由圖3可得,多糖得率隨著提取時間的延長而升高,提取時間高于3 h,多糖得率降低,可能由于提取時間較長會導(dǎo)致植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞,使有效成分流出,造成多糖得率緩慢下降,因此選擇臨近的2、3、4 h三個水平進(jìn)行正交試驗。由圖4可知,當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時,多糖得率最高,料液比偏小時,固液相中的有效成分的濃度差較小,會使溶液黏性增大,不利于姬松茸多糖的提取,隨著料液比的增大,兩相濃度差增大,多糖在溶劑中的量增大,但料液比過高時,濃度差過大,反而不利于多糖的溶出,因此選擇1∶10、1∶20、1∶30 g/mL進(jìn)行正交試驗。由圖5可知,當(dāng)提取次數(shù)為3次時,多糖得率最高,隨著提取次數(shù)的增加,消耗的材料和資源也較多,并且得率也受到影響,因此選擇2、3、4次三個水平進(jìn)行正交試驗。

圖2 提取溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

圖3 提取時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on polysaccharides yield

圖4 料液比對多糖得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on polysaccharides yield

圖5 提取次數(shù)對多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on polysaccharide yield

2.3 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果如表2。

表2 正交試驗結(jié)果及極差分析Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

根據(jù)表1中正交試驗結(jié)果及極差分析可知,各因素對姬松茸多糖影響由大到小依次為提取溫度>提取時間>料液比>提取次數(shù)。最佳因素的水平組合為A3B2C2D2。

根據(jù)姬松茸多糖提取最佳條件進(jìn)行三次平行實驗,姬松茸多糖平均得率為8.814%±0.109%。確定的最佳提取工藝與正交試驗中的得率最高組接近,且重復(fù)性良好,進(jìn)一步確定了提取姬松茸多糖的提取工藝A3B2C2D2,即料液比為1∶20 g/mL,100 ℃水浴浸提3次,每次3 h。

2.4 姬松茸多糖對小鼠臟器指數(shù)的影響

如圖6、圖7顯示,與空白對照組相比,模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)極顯著降低(p<0.01),說明建立模型成功。與模型組相比,姬松茸多糖低劑量組、中劑量組胸腺指數(shù)沒有顯著差異,而姬松茸多糖中劑量脾臟指數(shù)顯著升高(p<0.05),姬松茸多糖高劑量組胸腺指數(shù)顯著升高(p<0.05),脾臟指數(shù)極顯著升高(p<0.01),說明姬松茸多糖高劑量組可以顯著改善臟器指數(shù),由于胸腺與脾臟作為免疫器官,直接能反應(yīng)動物整體的健康良好狀況,因此姬松茸多糖能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。

圖6 姬松茸多糖對小鼠胸腺指數(shù)的影響(n=8)Fig.6 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on the proportion of thymus in mice(n=8)注:與CON相比,#代表差異顯著p<0.05,##代表差異極顯著p<0.01;與MOD相比,*代表差異顯著p<0.05,**代表差異極顯著p<0.01;圖7～圖10同。

圖7 姬松茸多糖對小鼠脾臟指數(shù)的影響(n=8)Fig.7 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on spleen specific gravity in mice(n=8)

2.5 刀豆蛋白(ConA)引起的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化結(jié)果

如圖8所示,與空白對照組相比,模型組小鼠ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞極顯著降低(p<0. 01),表明建模成功。與模型組對比,姬松茸多糖低劑量組小鼠ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖無顯著性差異,姬松茸多糖中劑量組小鼠ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖顯著提高(p<0.05),姬松茸多糖高劑量組小鼠ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖極顯著提高(p<0.01)。說明增加姬松茸多糖劑量促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng),并顯示量效關(guān)系,姬松茸多糖能夠獨立活化小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,并且能夠協(xié)同促進(jìn)ConA刺激的脾細(xì)胞增殖,側(cè)面表明姬松茸多糖能夠通過促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

圖8 姬松茸多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響Fig.8 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on the proliferation of mouse splenic lymphocytes

2.6 血清中TNF-α、IL-6含量測定結(jié)果

細(xì)胞因子是一類由活化的免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的高活性、具有多種生理功能的蛋白質(zhì)多肽分子或糖蛋白,是免疫系統(tǒng)的重要組成部分[20],也是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝的主要介質(zhì),細(xì)胞因子含量的高低表明了免疫系統(tǒng)的自身代謝狀態(tài)。TNF-α對免疫反應(yīng)、機(jī)體代謝、炎癥反應(yīng)具有明顯的調(diào)節(jié)和介導(dǎo)作用,可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。IL-6是由單核細(xì)胞、激活的淋巴細(xì)胞及多種活性細(xì)胞分泌的具有生物活性物質(zhì),可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖、分化,在活化、增殖的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞的過程中起關(guān)鍵作用,對機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫都具有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖9～圖10顯示,與空白對照組相比,模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6含量顯著(p<0.05)減少;與模型組相比,隨著姬松茸多糖劑量的增加,可促進(jìn)血清中TNF-α、IL-6的分泌,并且姬松茸多糖高劑量組能極顯著(p<0.01)促進(jìn)衰老小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌,并且TNF-α、IL-6的分泌趨勢相近。說明姬松茸多糖可促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生,從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖,有誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化,最終調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。

圖9 姬松茸多糖對衰老小鼠血清中TNF-α含量的影響Fig.9 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on serum TNF-α in aging mice

圖10 姬松茸多糖對衰老小鼠血清中IL-6含量的影響Fig.10 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on serum IL-6 in aging mice

3 結(jié)論

采用水提醇沉法提取姬松茸多糖,通過單因素實驗和正交實驗篩選并優(yōu)化姬松茸最佳提取工藝為:提取溫度100 ℃,提取時間3 h,料液比1∶20 g/mL,提取次數(shù)3次,此時姬松茸多糖平均得率為8.814%±0.109%。小鼠注射D-半乳糖后,與空白對照組小鼠相比,胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均極顯著下降,經(jīng)ConA刺激的模型組小鼠脾細(xì)胞增殖也同時受到抑制,說明D-半乳糖導(dǎo)致小鼠免疫力下降模型建立成功。與模型組相比,姬松茸多糖高劑量組極顯著提高小鼠脾臟(p<0.01),顯著提高胸腺指數(shù)(p<0.05),姬松茸多糖高劑量組極顯著促進(jìn)衰老小鼠脾細(xì)胞增殖(p<0.01),極顯著增加衰老小鼠血清中TNF-α、IL-6(p<0.01)含量。

本實驗研究中姬松茸多糖能顯著增加小鼠胸腺指數(shù),并促進(jìn)脾細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化,促進(jìn)小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌來調(diào)節(jié)免疫功能。因此姬松茸多糖對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用,為開發(fā)姬松茸系列產(chǎn)品奠定理論和實踐基礎(chǔ)。