檢測(cè)4種有機(jī)磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條的研制

朱亮亮 王琳琛 王兆芹 崔海峰 張坤 馮才偉 萬(wàn)宇平*

檢測(cè)4種有機(jī)磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條的研制

朱亮亮①③王琳?、佗弁跽浊邰诖藓７澧佗蹚埨あ佗垴T才偉①③萬(wàn)宇平*①③

（①北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 102206 ②北京望爾生物技術(shù)有限公司 北京 ③北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心）

本文通過(guò)制備有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原，研制出一種能夠檢測(cè)蔬菜、水果中有機(jī)磷農(nóng)藥的膠體金免疫層析試紙條，辛硫磷、對(duì)硫磷、丙溴磷、氯唑磷等有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)限均為200μg/kg，檢測(cè)時(shí)間僅為15min，假陽(yáng)性率和假陰性率均為0，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，試紙條能夠應(yīng)用到基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測(cè)，具有實(shí)際意義。

有機(jī)磷農(nóng)藥 膠體金免疫層析試紙條 快速檢測(cè)

有機(jī)磷農(nóng)藥是一種含有磷元素的有機(jī)化合物農(nóng)藥，它種類多，藥性強(qiáng)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常常用作殺蟲(chóng)劑。然而，不科學(xué)地使用農(nóng)藥導(dǎo)致了蔬菜瓜果的農(nóng)藥殘留超標(biāo)，威脅到人類的健康，嚴(yán)重地還會(huì)對(duì)人的臟器、生殖系統(tǒng)等造成損壞，影響代謝功能[1-3]。因此，我國(guó)規(guī)定了食品中農(nóng)藥殘留限量要求。農(nóng)業(yè)部、國(guó)家衛(wèi)計(jì)委、食監(jiān)局聯(lián)合發(fā)布2016年第16號(hào)公告《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB2763-2016)等107項(xiàng)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，公布了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)所涉及的食品中農(nóng)藥產(chǎn)品殘留量的檢測(cè)方法。

目前，檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的多為儀器方法，比如氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[3-14]。儀器方法較難應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測(cè)，因此本文介紹的有機(jī)磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條較好地解決了該問(wèn)題。該試紙條能夠檢測(cè)蔬菜、水果中的有機(jī)磷農(nóng)藥(對(duì)硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷)殘留，靈敏度較高、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)方便，是理想的初篩方法，并具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對(duì)硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷等標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)購(gòu)自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，氯金酸(HAuCl4·3H2O)、牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，檸檬酸三鈉、碳酸鉀購(gòu)自北京百欣試劑公司；樣本提取劑、樣本復(fù)溶液、膠體金分析儀由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供；渦旋儀、均質(zhì)器均購(gòu)自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原的制備 （1）取化合物a 1.0g，加甲醇30ml溶解，取鹽酸羥胺0.27g，加水1ml溶解，加入到甲醇溶液中，加碳酸鉀0.46g，加熱回流24h，停止反應(yīng)，冷卻到室溫，得到A液；取鋅粉0.31g，加水5ml，攪拌，加冰乙酸0.2ml，90℃攪拌30min，加入全部的A液，繼續(xù)攪拌4h，停止反應(yīng)，加水100ml，乙酸乙酯70ml×3，萃取三次，合并有機(jī)相，蒸干，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/10)120ml重結(jié)晶，得到化合物b0.81g，收率81%；（2）取化合物b 0.81g，加氫溴酸50ml溶解，100℃回流反應(yīng)3h，停止反應(yīng)，加6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到7，加乙酸乙酯100ml×3，萃取三次，合并有機(jī)相，蒸干，上硅膠柱，乙酸乙酯/石油醚(v/v，1/5)洗脫，得到化合物c 0.7g，收率92.1%；（3）取化合物c 0.7g，加甲醇30mL溶解，加二乙氧基-氯硫磷0.55g，加KOH 0.78g，55℃反應(yīng)5h，停止反應(yīng)，加水，加6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值到6，加二氯甲烷120ml×3，萃取三次，合并有機(jī)相，蒸干，無(wú)水乙醇/乙腈(v/v，1/1)60ml重結(jié)晶，得到化合物d 1.3g，收率86.67%，即為半抗原產(chǎn)物。

圖1 有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原合成

1.2.2 有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物合成 取化合物d半抗原產(chǎn)物38mg，加DMF 2ml溶解，加N-琥珀酰亞胺17mg，加EDC 29mg，室溫?cái)嚢?h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白100mg，加0.05mol/L CB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4℃攪拌24h，0.02mol/L PB緩沖液透析純化3d，每天換液3次，得到有機(jī)磷-BSA免疫原，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備 在磁力攪拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至7.2，每毫升膠體金溶液中加入70μg有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體，混勻，靜置10min，加入10% BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10min。離心、洗滌、重懸，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 將有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上 將100μl有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物加入到微孔試劑微孔板中，置于冷凍干燥機(jī)，冷阱溫度為-50℃，預(yù)凍3h，再真空干燥15h，即得到有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干的微孔試劑。

1.2.5 檢測(cè)方法 向微孔中加入100ml待檢樣本溶液，混勻，室溫下孵育3min，吸取70ul滴至試紙條上，反應(yīng)10min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果或通過(guò)膠體金分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果。其它時(shí)間判讀無(wú)效。

圖2 有機(jī)磷農(nóng)藥膠體金試紙條結(jié)果判定示意圖

1.2.6 樣本檢測(cè)限 在空白白菜、蘋果樣本中分別添加有機(jī)磷農(nóng)藥(對(duì)硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷)標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、100、150、200、250、300μg/L，用三批試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限。

1.2.7 試紙條的特異性 分別配制500μg/L的克百威、呋喃丹和敵敵畏等藥物，用此試紙條檢測(cè)，重復(fù)3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.8 準(zhǔn)確性 農(nóng)業(yè)部文件要求：以假陽(yáng)性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性。取50份空白白菜、蘋果樣品，分別添加有機(jī)磷農(nóng)藥質(zhì)量濃度至200μg/kg，用該試紙條進(jìn)行檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥藥物殘留，計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定：試紙條假陽(yáng)性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零。

1.2.9 試紙條的穩(wěn)定性 將試紙條保存于2~8℃環(huán)境中，每隔1個(gè)月檢測(cè)試紙條的準(zhǔn)確性，連續(xù)測(cè)定15個(gè)月。具體方法為：分別檢測(cè)20份空白白菜、蘋果樣品，添加有機(jī)磷農(nóng)藥質(zhì)量濃度至200μg/kg，重復(fù)測(cè)定2次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本檢測(cè)限

配置有機(jī)磷農(nóng)藥濃度分別為0、100、150、200、250、300μg/L的蔬菜、水果樣品，按照1.2.6步驟進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)限。該試紙條的檢測(cè)限為200μg/kg，見(jiàn)表1。

表1 有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限 (μg/L)

注：- 表示陰性，+ 表示陽(yáng)性。

2.2 特異性

該試紙條檢測(cè)500μg/L的克百威、呋喃丹和敵敵畏等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.3 準(zhǔn)確性

用試紙條檢測(cè)50份空白蔬菜、水果樣品，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明假陽(yáng)性率低于5%；添加有機(jī)磷農(nóng)藥質(zhì)量濃度為200μg/kg的50份陽(yáng)性蔬菜、水果樣品，試紙條檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明試紙條假陰性率為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。

2.4 穩(wěn)定性

12個(gè)月內(nèi)，試紙條的假陽(yáng)性率和假陰性率均符合要求，從第13個(gè)月起，試紙條會(huì)出現(xiàn)少量失效、假陰性等現(xiàn)象。

3 討論

目前，利用儀器方法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的文獻(xiàn)較多，但是利用膠體金免疫層析試紙條能夠同時(shí)檢測(cè)4種有機(jī)磷農(nóng)藥的文獻(xiàn)較少。劉瑩在《有機(jī)磷農(nóng)藥的膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的研制》一文記錄了能夠檢測(cè)9種有機(jī)磷農(nóng)藥(殺螟硫磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、殺撲磷、甲拌磷、毒死蜱、三唑磷、喹硫磷、倍硫磷)殘留的試紙條檢測(cè)方法，檢測(cè)限在250~1500μg/kg[15]。丁國(guó)興等人在《酶促反應(yīng)試紙條快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥》一文中記錄了用酶促反應(yīng)試紙條檢測(cè)敵敵畏、甲基對(duì)硫磷、滅多威、異丙威、涕滅威等6種有機(jī)磷農(nóng)藥的技術(shù)方法，靈敏度為2000μg/kg[16]。王菡等人在《膠體金側(cè)向流免疫層析技術(shù)檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留》一文中記錄了檢測(cè)毒死蜱的膠體金技術(shù)，檢測(cè)限為4000μg/kg[17]。經(jīng)過(guò)查閱有機(jī)磷快速檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)能夠同時(shí)檢測(cè)辛硫磷、對(duì)硫磷、丙溴磷、氯唑磷等4種有機(jī)磷農(nóng)藥，并且檢測(cè)限為200μg/kg的文獻(xiàn)。

本文通過(guò)制備有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原，讓其與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，對(duì)試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等性能測(cè)試，均符合要求。試紙條的檢測(cè)時(shí)間僅為15min，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中儀器方法用時(shí)更短，操作更簡(jiǎn)便。試紙條檢測(cè)限為200μg/kg，未見(jiàn)免疫方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

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（2019–05–23）

典型性農(nóng)殘多靶標(biāo)高效快速檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用（Z181100009318006）項(xiàng)目資助

S859.79+7

A

1007-1733(2019)08-0010-03