禽沙門菌分離鑒定方法的建立與優(yōu)化

張富友 宋艷 崔治中 孫淑紅

禽沙門菌分離鑒定方法的建立與優(yōu)化

張富友 宋艷 崔治中 孫淑紅*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271018）

本研究旨在建立和優(yōu)化禽沙門菌分離鑒定的方法。選擇山東省某地方品種雞疑似發(fā)生沙門菌病的未出殼死胚樣品24份，通過4組不同的培養(yǎng)基組合比較沙門菌的分離情況，選擇沙門菌通用引物兩對(duì)和雞白痢特異性引物一對(duì)進(jìn)行分離株的PCR檢測(cè)，比較其特異性，然后進(jìn)行血清分型和MLST分型，確定沙門菌類型并研究其相關(guān)性。結(jié)果表明，該批樣品中TTB比SC增菌效果好，XLD和XLT4選擇培養(yǎng)基對(duì)沙門菌分離效果相同，最終通過PCR方法鑒定出沙門菌陽性率為58.3%；發(fā)現(xiàn)兩對(duì)通用引物特異性一致，表明可任選一對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定；用雞白痢沙門菌特異性引物完成的PCR鑒定結(jié)果顯示，14株沙門菌中有7株為雞白痢沙門菌；血清型鑒定結(jié)果表明，14株沙門菌中有7株雞白痢沙門菌、7株腸炎沙門菌，共兩種血清型；MLST分子分型結(jié)果表明，14株沙門菌分為3個(gè)ST型，分別是7株ST11、3株ST92和4株ST2151，其中ST11為腸炎沙門菌，ST92和ST2151為雞白痢沙門菌；本研究表明，疑似沙門菌感染樣品經(jīng)BPW和TTB增菌、XLD或XLT4選擇培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，最后通過PCR方法可準(zhǔn)確完成沙門菌的分離鑒定；同時(shí)，應(yīng)用該方法可完成對(duì)雞白痢沙門菌的鑒定，并與血清分型和MLST分子分型結(jié)果一致。

禽沙門菌 PCR 血清型 MLST 相關(guān)性分析

禽沙門菌是一種革蘭氏陰性菌，兼性厭氧。雞感染沙門菌后會(huì)引發(fā)雞沙門菌病，包括雞白痢桿菌病、雞副傷寒和雞傷寒等病[1]。其中雞白痢是國際動(dòng)物衛(wèi)生組織法定報(bào)告的B類傳染病，也是我國農(nóng)業(yè)部要求的重點(diǎn)檢測(cè)的十四種動(dòng)物疫病之一[2]。各種品種的雞對(duì)沙門菌均易感，尤其是3周齡以內(nèi)的雛雞感染后，死亡率最高[3]。成年雞感染呈慢性或陰性經(jīng)過[4]。沙門菌傳播途徑廣，主要經(jīng)過種蛋傳播，此外環(huán)境、飲水、飼料等污染后，可以造成雞群感染[5]。沙門菌病一年四季均可發(fā)生，死亡率和造成的經(jīng)濟(jì)損失與雞場凈化程度和飼養(yǎng)管理水平密切相關(guān)[6]。

近年來沙門菌感染的事件頻發(fā)，其中從雞蛋和禽肉中都檢測(cè)到沙門菌感染，威脅人類飲食安全和健康，同時(shí)沙門菌感染雞群后，造成雛雞死亡、育成雞和成雞生長發(fā)育遲緩，產(chǎn)蛋率下降等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[7]。目前對(duì)沙門菌沒有有效的治療方法，只有通過凈化淘汰陽性雞，加強(qiáng)衛(wèi)生檢疫和管理，保護(hù)陰性群體等一系列措施，才能有效控制沙門菌造成的損害[8]。對(duì)于保種場，只能通過凈化淘汰來保證雞群的百分之百陰性[9]。本研究針對(duì)此問題建立并優(yōu)化了沙門菌的檢測(cè)方法，為沙門菌凈化提供指導(dǎo)建議和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料來源 山東省某地方品種雞疑似發(fā)生沙門菌病的未出殼死胚樣品，共24份。

1.2 試劑 沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(chǔ)(TTB)、碘液、0.1%煌綠、XLT4瓊脂均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；2×Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 分離培養(yǎng) 無菌取雞胚肝臟、部分腸段樣品，剪碎，加入BPW預(yù)增菌，37℃、220rpm/min培養(yǎng)12~18h，然后共分為四個(gè)組合，即分別用SC培養(yǎng)基和TTB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、220rpm/min培養(yǎng)18~22h，再分別用三線法接種到XLD和XLT4平板，37℃培養(yǎng)24~48h。

1.4 PCR鑒定 合成兩對(duì)沙門菌通用引物FimW和invA以及雞白痢沙門菌特異性檢測(cè)引物ipaJ[10-12]，由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物詳情見表1。

表1 FimW和ipaJ引物序列及片段大小

從XLD和XLT4平板上分別挑取2~4個(gè)可疑菌落，接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用菌液作為模板，PCR擴(kuò)增體系為25μl，其中2×PCR Master Mix(含有2×Taq DNA聚合酶、2×PCR Buffer和2×dNTP) 12.5μl、以可疑菌落LB增菌液為模板1μl、上下游引物(10pmol/μl)各1μl、ddH2O 9.5μl。FimW引物反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5min(預(yù)變性)，94℃ 45s(變性)，50℃ 45s(退火)，72℃ 1min(延伸)，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 7min(延伸)，4℃結(jié)束。invA引物反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10min(預(yù)變性)，95℃ 30s(變性)，55℃ 45s(退火)，72℃ 45s(延伸)，共30個(gè)循環(huán)，72℃ 10min(延伸)，4℃結(jié)束。ipaJ引物反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 10min(預(yù)變性)，94℃ 45s(變性)，58℃ 45s(退火)，72℃ 1min(延伸)，共30個(gè)循環(huán)，72℃ 10min(延伸)，4℃結(jié)束。PCR擴(kuò)增結(jié)束后取8μl用于電泳檢測(cè)，用1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，電泳45min，以DNA Marker DL2000為參照用凝膠成像儀成像觀察。

1.5 血清學(xué)鑒定 參考沙門菌屬診斷血清試劑盒說明書進(jìn)行沙門菌血清型的鑒定。

1.6 多位點(diǎn)基因序列分型(MLST) （1）MLST引物設(shè)計(jì)：參考MLST官方網(wǎng)站(http://mlst.Warwi ck.ac.uk/mlst/dbs/Senterica)上公布的七對(duì)管家基因的片段序列(aroC，dnaN，hemD，hisD，purE，sucA，thrA)，并由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成所需引物。引物序列見表2。（2）細(xì)菌DNA的提?。簠⒖技?xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取沙門菌分離株的DNA。（3）PCR反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增體系為50μl，其中2×PCR Master Mix(含有2×Taq DNA聚合酶、2×PCR Buffer和2×dNTP) 25μl、DNA模板2μl、上下游引物(10pmol/μl)各2μl、ddH2O 19μl。反應(yīng)程序：94℃ 5min(預(yù)變性)，94℃ 45s，55℃ 45s(退火)，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 7min(延伸)，4℃結(jié)束。（4）PCR產(chǎn)物純化：將PCR產(chǎn)物全部用于電泳檢測(cè)，用1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，電泳45min，以DNA Marker DL2000為參照用凝膠成像儀成像觀察，并將有目的片段的瓊脂凝膠切下，裝到預(yù)先準(zhǔn)備好的離心管中，然后參考膠回收試劑盒說明書繼續(xù)PCR產(chǎn)物的純化。（5）測(cè)序及結(jié)果分析：將上述純化后的PCR產(chǎn)物交于上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。下載沙門菌管家基因全部數(shù)據(jù)庫，然后建立本地?cái)?shù)據(jù)庫，對(duì)測(cè)序結(jié)果剪切后進(jìn)行序列比對(duì)，記錄七對(duì)管家基因的等位基因數(shù)值，然后通過PubMLST網(wǎng)站查詢ST型。

表2 沙門菌七對(duì)管家基因的引物序列

1.7 相關(guān)性分析 將菌落形態(tài)觀察、PCR鑒定、血清學(xué)鑒定和MLST分子分型等結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 SC增菌液、TTB增菌液分別在XLT4和XLD兩種選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后，部分樣品均出現(xiàn)無色半透明的菌落或有黑色中心的菌落(疑似雞白痢沙門菌或其他沙門菌)，比例分別為13/24、13/24、14/24和14/24。結(jié)果表明，該批樣品中TTB比SC增菌效果好，XLD和XLT4對(duì)沙門菌分離效果相同(表3)。

表3 不同培養(yǎng)基組合對(duì)沙門菌分離結(jié)果

2.2 PCR鑒定結(jié)果 用invA和FimW兩對(duì)引物分別用PCR方法鑒定，結(jié)果表明：兩對(duì)通用引物檢測(cè)結(jié)果相同，可以隨意任意選擇一種使用(圖1、2)；用ipaJ引物進(jìn)行PCR方法鑒定，結(jié)果顯示有7株雞白痢沙門菌(圖3)。

2.3 血清分型結(jié)果 平板凝集試驗(yàn)結(jié)果表明，14株沙門菌分為2種血清型，即腸炎沙門菌7株(50%)和雞白痢沙門菌7株(50%)(表4)。

圖1 用invA引物對(duì)部分菌株的PCR鑒定結(jié)果

圖2 用FimW引物對(duì)部分菌株的PCR鑒定結(jié)果

圖3 用ipaJ引物對(duì)部分菌株的PCR鑒定結(jié)果

2.4 多位點(diǎn)基因序列分型(MLST)結(jié)果 利用MLST技術(shù)對(duì)14株沙門菌分離株進(jìn)行基因分型，14株沙門菌共有3種ST型，分別是ST11、ST92和ST2151，其中ST11為腸炎沙門菌(表4)，ST92和ST2151為雞白痢。

表4 沙門菌分離株的ST型

2.5 相關(guān)性分析結(jié)果 XLT4和XLD培養(yǎng)基上有14個(gè)樣品疑似沙門菌，其中有7個(gè)樣品呈現(xiàn)有黑色中心的菌落形態(tài)，7個(gè)樣品呈現(xiàn)無色半透明小菌落形態(tài)(疑似雞白痢沙門菌)；PCR結(jié)果顯示，有14株沙門菌，其中7株為雞白痢沙門菌；血清學(xué)結(jié)果顯示，14株沙門菌分為2種血清型，分別為7株腸炎沙門菌和7株雞白痢沙門菌；MLST結(jié)果顯示，14株沙門菌分為3種ST型，分別為ST11、ST92和ST2151，其中ST11為腸炎沙門菌，ST92和ST2151為雞白痢沙門菌。通過對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)觀察、PCR鑒定、血清分型和MLST分子分型結(jié)果一致。

3 討論

（1）雞白痢沙門菌在XLD和XLT4培養(yǎng)基上形態(tài)為無色半透明菌落，生長較慢，培養(yǎng)48h左右，菌落直徑大約0.5㎜，其他沙門菌在該培養(yǎng)基上形態(tài)為有黑色中心的菌落，但是在密度較大的情況下，菌落沒有黑色中心，并且存在其他形態(tài)類似的細(xì)菌干擾，因此，只從菌落形態(tài)進(jìn)行判斷有一定難度。考慮到雞白痢沙門菌菌落比較小，通過挑取單菌落接種到LB培養(yǎng)基，更利于PCR結(jié)果準(zhǔn)確性，并且方便分離菌株的保存。我們參照文獻(xiàn)合成雞白痢特異性引物，并進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其可靠性較高，且快速方便。沙門菌屬診斷學(xué)清可以通過檢測(cè)沙門菌的抗原結(jié)構(gòu)，從而判斷血清型，但是由于結(jié)果需要眼觀判斷，主觀性較強(qiáng)，存在誤差。MLST分型作為一種分子分型技術(shù)，準(zhǔn)確性高，但是需要對(duì)七對(duì)管家基因分別測(cè)序，對(duì)細(xì)菌DNA質(zhì)量要求較高，并且需要對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理分析，綜合七對(duì)管家基因的等位基因數(shù)值，通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)對(duì)比確認(rèn)相應(yīng)菌株的ST型，由于ST管家基因存在點(diǎn)突變，ST會(huì)改變，因此不能只根據(jù)此結(jié)果判斷菌株的分型。此外還有PFGE方法以及全基因組對(duì)菌株進(jìn)行分型，但是成本高、操作難度大，目前只適用于科學(xué)研究。（2）本研究中，觀察XLD和XLT4選擇培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，可以看到無色透明小菌落和有黑色中心的疑似沙門菌菌落，也存在一些透明但是正面觀察呈現(xiàn)褐色的菌落干擾，顯然，眼觀判斷不夠準(zhǔn)確；需補(bǔ)充PCR鑒定。本研究結(jié)果表明，經(jīng)分離培養(yǎng)后，眼觀判斷可疑的菌落再選擇沙門菌通用引物經(jīng)PCR方法鑒定可完成沙門菌的分離鑒定，結(jié)果可靠、快速；該方法同樣適用于雞白痢沙門菌的分離鑒定。（3）血清型鑒定表明，14株沙門菌主要血清型是腸炎沙門菌(50%)和雞白痢沙門菌(50%)；MLST結(jié)果表明，14株沙門菌分為三種ST型，分別是ST11、ST92和ST2151，其中ST92和ST2151為雞白痢沙門菌，ST11為腸炎沙門菌，該結(jié)果與血清分型結(jié)果一致。一種ST型對(duì)應(yīng)著一種血清型或者幾種ST型對(duì)應(yīng)著一種血清型，說明這兩種方法可以對(duì)沙門菌進(jìn)行準(zhǔn)確分型，而兩種方法的相互驗(yàn)證，可確保沙門菌分型準(zhǔn)確結(jié)果。（4）本研究發(fā)現(xiàn)，禽沙門菌的分離鑒定可通過菌落形態(tài)觀察與PCR方法結(jié)合等完成其準(zhǔn)確鑒定；并發(fā)現(xiàn)其與血清分型、MLST分子分型結(jié)果完全一致。

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（2019–07–21）

國家十三五重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目: 2016YFD0501608；山東農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目(SD2019XM009)

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