響應面優(yōu)化白花酸藤果浸泡酒抗氧化活性及成分分析

李思敏，張言，高定烽，熊華斌，高云濤

(云南民族大學 化學與環(huán)境學院，昆明 650500)

白花酸藤果為紫金牛科酸藤子屬植物，又名牛脾蕊(廣東)、羊公板仔(海南島)、水林果、槍子果(云南)、馬桂郎(云南傣語)，分布于廣東、海南、云南等地，生長在海拔50～2000 m的林內(nèi)、灌木叢、路邊，在云南普洱、思茅等地均可見。民間以其根(中藥名：咸酸)、果(藏藥名：齊當嘎)入藥，治婦女閉經(jīng)、小兒頭瘡、跌打損傷、絳蟲等[1]。隨著生活水平的提高，人們對食品保健和營養(yǎng)價值的關(guān)注度越來越高。信維平[2]從果蔬中分離出抗氧化物質(zhì)，可對飲料調(diào)味和作為預防癌癥等疾病的功能性食品。農(nóng)仲文等[3]通過對山竹果皮中活性物質(zhì)做浸泡酒的研究，發(fā)現(xiàn)酒中活性成分高，抗氧化作用好。楊占南等[4]對魚腥草作為酒的調(diào)味品進行了研究，發(fā)現(xiàn)酒中含有豐富的營養(yǎng)及藥理成分物質(zhì)，具有保健功能。但是，鮮見對白花酸藤果浸泡酒的研究報道。本試驗在單因素分析基礎上利用響應面法對白花酸藤果浸泡酒的抗氧化活性進行了分析，為進一步開發(fā)利用白花酸藤果浸泡酒調(diào)味提供了理論技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用白花酸藤果：購自云南省普洱市，該地區(qū)屬于低緯高原南亞熱帶季風氣候區(qū)。

95%乙醇(分析純)、乙醇(優(yōu)級純)、DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)：美國Sigma公司；實驗室用水為超純水。

1.2 儀器與設備

SJIA-2012型超聲波細胞破碎機 寧波雙嘉儀器有限公司；8453型紫外可見分光光度計 美國安捷倫公司；FA2004型電子分析天平 上海上平儀器有限公司；水浴鍋 力辰科技有限公司；Agilent 7890A氣相色譜儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 白花酸藤果提取物最大吸收峰的測定

按照液固比為10∶1(mL/g)的比例加入95%的乙醇，取3.0 g的白花酸藤果，置于60 ℃水浴中萃取2 h，以4000 r/min離心萃取液10 min，靜置后取上清液，備測。備測樣品均用對應的溶劑稀釋50倍，再進行200～800 nm的光譜掃描，得到白花酸藤果溶液的吸收光譜和最大吸收峰。

1.3.2 白花酸藤果乙醇浸泡液對DPPH的清除效果

準備200 mL的燒杯，并準確稱取6份3.0 g的白花酸藤果置于其中，再配制酒精體積分數(shù)為0%、10%、30%、50%、70%、95%的液體，按液固比為10∶1加入液體和白花酸藤果，瓶口以保鮮膜封口，置于60 ℃的水浴中浸提2 h，然后取濾液離心，離心條件與1.3.1中相同。取10 mL配制好的DPPH(A=0.7±0.1)溶液于比色管中，加入0.5 mL的白花酸藤果濾液，測定其吸光度，并計算溶液對DPPH的清除率。

1.3.3 不同超聲功率的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

取6個200 mL的燒杯，并精確稱取3.0 g的白花酸藤果共6份分別置于其中，按液固比為10∶1并以保鮮膜封口后置于60 ℃的水浴中浸提2 h，然后取出燒杯，設置超聲時間為20 min，分別以超聲功率150，300，450，600，750，900 W提取，然后取濾液離心，離心條件與1.3.1中相同。取10 mL配制好的DPPH(A=0.7±0.1)溶液于比色管中，加入0.5 mL的白花酸藤果濾液，測定其吸光度，并計算溶液對DPPH的清除率。

1.3.4 不同超聲時間的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

取6個200 mL的燒杯，并精確稱取3.0 g的白花酸藤果共6份分別置于其中，按液固比為10∶1以保鮮膜封口后置于60 ℃的水浴中浸提2 h，然后取出燒杯，設置超聲功率為900 W，分別設置超聲時間為5，10，20，30，40，50，60 min進行提取，然后取濾液離心，離心條件與1.3.1中相同。取10 mL配制好的DPPH(A=0.7±0.1)溶液于比色管中，加入0.5 mL的白花酸藤果濾液，測定其吸光度，并計算溶液對DPPH的清除率。

1.3.5 不同液固比的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

取6個200 mL的燒杯，并精確稱取3.0 g的白花酸藤果共6份分別置于其中，按液固比(mL/g) 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入95%的乙醇開展實驗，以保鮮膜進行封口，每個平行組均置于60 ℃水浴中浸提2 h，然后取濾液離心，離心條件與1.3.1中相同。取10 mL配制好的DPPH(A=0.7±0.1)溶液于比色管中，加入0.5 mL的白花酸藤果濾液，測定其吸光度，并計算溶液對DPPH的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物的最大吸收峰

圖1 提取物的最大吸收峰Fig.1 The maximum absorption peak of extracts

由圖1的UV-Vis吸收光譜掃描結(jié)果可知，白花酸藤果溶液的吸收光譜在300～800 nm之間并沒有吸收峰，DPPH溶液在328，517 nm處出現(xiàn)2個較強的特征吸收峰，而白花酸藤果溶液在202 nm處出現(xiàn)較強的特征吸收峰。所以本試驗選用的白花酸藤果溶液的最大吸收波長為202 nm。

2.2 不同提取溫度的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

圖2 不同提取溫度的白花酸藤果溶液對DPPH自由基的清除Fig.2 The effect of Embelia ribes solution with different extraction temperatures on DPPH free radical scavenging

由圖2可知，在整個提取溫度區(qū)間的白花酸藤果溶液對DPPH的影響隨提取溫度的升高而升高，即提取溫度對白花酸藤果提取的影響是逐步上升的。但60 ℃之后的白花酸藤果溶液，隨著提取溫度的升高，清除率的變化速率減慢。如對綠茶多糖體外抗氧化活性的研究顯示，提取溫度不但會影響多糖的提取率，而且會影響多糖的抗氧化活性[5]。這主要是因為許多抗氧化物質(zhì)對溫度都比較敏感，在高溫條件下容易導致活性的降低。所以，考慮到白花酸藤果浸泡酒的保健價值，本研究在后續(xù)步驟中選用60 ℃作為提取溫度。

2.3 白花酸藤果乙醇浸泡液對DPPH的清除效果

圖3 白花酸藤果乙醇浸泡液對DPPH自由基的清除Fig.3 The effect of ethanol soaking solution of Embelia ribes on DPPH free radical scavenging

在10∶1的液固比、60 ℃的水浴條件下加熱2 h，研究了不同乙醇體積分數(shù)對DPPH清除的影響。由圖3可知，隨著液體中乙醇含量的增加，在50%～100%內(nèi)，清除率呈上升趨勢，證明用乙醇對白花酸藤果進行浸泡，能使白花酸藤果內(nèi)的抗氧化成分析出，其析出效果遠高于水。當乙醇體積分數(shù)高于70%時，有略微下降趨勢，這是由于某些有效成分溶于水，隨著乙醇體積分數(shù)的升高，提取液對DPPH的清除率會略微降低。由于生活中常見的酒度數(shù)多為50度左右，這種酒浸泡調(diào)味后不但具有較好的飲用口感[6,7]，而且廣受消費者歡迎。故本試驗選用體積分數(shù)為50%的乙醇溶液作為浸提液。

2.4 不同液固比的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

圖4 不同液固比的白花酸藤果溶液對DPPH自由基的清除Fig.4 The effect of Embelia ribes solution with different liquid-solid ratios on DPPH free radical scavenging

由圖4可知，液固比在10∶1～30∶1，清除率隨液固比的增加呈下降趨勢，液固比在10∶1時對DPPH的清除率達到最大值，液固比大于10∶1時，清除率反而隨液固比的增加而顯著變化，這是由于隨著白花酸藤果占比減小，溶解增加，白花酸藤果溶液的濃度越來越低，提取液中的有效成分被稀釋，所以清除率下降。

2.5 不同超聲功率的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

圖5 不同超聲功率的白花酸藤果溶液對DPPH自由基的清除Fig.5 The effect of Embelia ribes solution with different ultrasonic power on DPPH free radical scavenging

許多研究顯示，超聲技術(shù)有助于植物提取過程中抗氧化物質(zhì)的釋放[8]，增加抗氧化物質(zhì)的利用價值，故本研究對超聲輔助提取白花酸藤果的各參數(shù)進行了優(yōu)化。由圖5可知，超聲功率在整個區(qū)間范圍內(nèi)的清除率呈整體上升趨勢。相對于超聲功率為600～900 W時的清除率上升較為緩慢。

2.6 不同超聲時間的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

圖6 不同超聲時間的白花酸藤果溶液對DPPH自由基的清除Fig.6 The effect of Embelia ribes solution with different ultrasonic time on DPPH free radical scavenging

在液固比10∶1、超聲功率900 W的條件下，研究了不同超聲時間對DPPH清除的影響。由圖6可知，在10～40 min，隨著超聲時間的延長，清除率呈直線上升趨勢；當時間超過40 min后清除率出現(xiàn)下降趨勢，可能是在超聲功率900 W、超聲時間40 min后對白花酸藤果的組織結(jié)構(gòu)造成破碎現(xiàn)象[9]，白花酸藤果原有的色素融入了試液中，增加了色素積累，導致清除率降低。

2.7 超聲輔助提取的響應面法優(yōu)化

2.7.1 CCD設計及其試驗結(jié)果

本研究利用響應面分析建立了影響因素與響應值之間的關(guān)系，從而選擇出最優(yōu)工藝[10]。在探究對DPPH清除的過程中，適當超聲的引入有利于提高乙醇對白花酸藤果有效物質(zhì)的浸出，從而使清除率增加，由此可見，超聲功率是構(gòu)建白花酸藤果乙醇浸出物對DPPH清除的關(guān)鍵性因素，故選取超聲功率作為響應面分析的影響因素。此外，在單因素試驗中，一定范圍內(nèi)的超聲功率和超聲時間對清除率的影響較為顯著，故將其作為響應面分析的影響因素。因此，采用Design Expert 8.1.6軟件中的Central Composite Design(CCD)法對清除體系中超聲功率、超聲時間和提取溫度對DPPH清除率的影響進行探究。根據(jù)CCD設計原理，超聲功率、超聲時間和提取溫度各設置3個水平，見表1。

表1 響應面優(yōu)化超聲輔助清除DPPH試驗的因素與水平值Table 1 The factors and levels of ultrasound-assisted DPPH scavenging test optimized by response surface method

根據(jù)CCD試驗設計，以超聲功率、超聲時間和提取溫度3個因素作為自變量A，B，C，以白花酸藤果乙醇的浸出物對DPPH的清除率作為響應值R，通過Design Expert 8.1.6分析軟件獲得的試驗方案及采用該方案獲得的試驗結(jié)果見表2。

表2 CCD試驗設計及試驗結(jié)果Table 2 CCD experimental design and experimental results

續(xù) 表

2.7.2 回歸和方差分析

以白花酸藤果乙醇浸出物對DPPH的清除率為響應值，在響應面分析軟件中對超聲功率、超聲時間和提取溫度進行回歸擬合，響應值R清除率與各影響因子間的回歸方程為：

R清除率=90.90+4.28A+1.23B-2.95C+0.050AB+2.60AC+2.40BC-4.68A2-3.83B2-1.22C2。

所得模擬方程具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9495。此外，對回歸模型進行了方差分析，結(jié)果見表3。

表3 清除DPPH回歸方差分析結(jié)果Table 3 The results of regression variance analysis of DPPH scavenging

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01；“***”表示P<0.001。

所建立模型的P<0.0001，具有極顯著性；失擬項的P>0.1，無顯著性，由此可見，所建模型可用于色素提取的響應面分析。此外，A、C、AC、BC、A2、B2、C2項的P值均小于0.05，表現(xiàn)出顯著性，這表明超聲功率、超聲時間和提取溫度均為清除DPPH過程中影響清除率的主要因素，其中，A、A2、B2項的P<0.001，即超聲功率和超聲時間對DPPH清除率的影響極為顯著，而C項的P<0.01，表明提取溫度對DPPH清除率的影響效果要明顯弱于超聲功率和超聲時間。BC、C2項的P<0.05，這表明超聲時間和提取溫度對DPPH清除率的影響在一定程度上表現(xiàn)出交互作用，而其他因素間則無此效應。

2.7.3 響應面分析

超聲功率(A)、超聲時間(B)和提取溫度(C)3 個因素對DPPH清除的3D響應面圖(a，b，c)見圖7。

圖7 各因素及其交互作用對超聲輔助提取影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagrams of the influence of various factors and their interactions on ultrasound- assisted extraction

由圖7中a可知，在B因素方向，響應面曲線較為平緩，說明超聲時間對DPPH清除率的影響較小，隨超聲時間的增加，色素提取有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著，而沿A因素方向則出現(xiàn)了較為明顯的變化，響應面曲線較陡，超聲功率引起清除率的變化較大，說明超聲功率對DPPH清除率的影響大于超聲時間。

圖7中b則顯示了A因素(超聲功率)和C因素(提取溫度)對DPPH清除率的影響。由 3D響應面圖可知，在A因素方向響應面曲線有一定的坡度，但是在C因素方向，響應面曲線較為平緩，說明提取溫度對DPPH清除率的影響較小，隨著提取溫度的增加，對DPPH清除率有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著。由此可見，A因素變化對結(jié)果的影響要高于C因素，即相對于提取溫度，超聲功率的影響更大。

由圖7中c可以比較 B因素(超聲時間)和C因素(提取溫度)對DPPH清除率的影響。由兩因素3D響應面圖中響應面曲線的陡峭程度可以看出，B，C兩因素的影響也存在較大差異，相對于超聲時間，提取溫度的影響較弱一些。響應面分析直觀反映了各因素的影響情況，其效果優(yōu)于單因素試驗，綜合分析可以發(fā)現(xiàn)，3個因素對清除率的影響有所不同，其程度大小為：超聲功率>超聲時間>提取溫度。

此外，通過響應面分析模型對DPPH清除率條件進行了優(yōu)化分析，預測的最優(yōu)條件是超聲功率617 W、超聲時間38 min、提取溫度50 ℃，預測的最優(yōu)清除率為92.86%。通過試驗檢驗最優(yōu)預測條件下的提取效果，清除率與預測值相接近，達到90.9%，相差僅1.96%，說明該方案是可行的[11]。通過引入超聲技術(shù)和對參數(shù)的優(yōu)化，白花酸藤果的自由基清除率得到了明顯的改善，這與核桃抗氧化肽和雪蓮薯多糖的研究結(jié)果相一致[12,13]。

2.8 白花酸藤果浸泡酒的GC-MS分析

本研究采用氣相色譜儀對白花酸藤果浸泡液以及浸泡液清除DPPH自由基的成分進行了分析，并利用氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀[14]對色譜中出現(xiàn)的各峰進行了解析，結(jié)果見表4和表5。白花酸藤果在色譜級的乙醇中浸泡24 h的氣相色譜圖見圖8。

表4 白花酸藤果溶液成分分析 Table 4 Component analysis of Embelia ribes solution

表5 加入白花酸藤果后的DPPH自由基成分分析Table 5 DPPH free radical component analysis after adding Embelia ribes

圖8 白花酸藤果溶液氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of Embelia ribes

由圖8和表4可知，從浸泡液中分離出了3種物質(zhì)。把浸泡液加入DPPH自由基溶液中的氣相色譜圖見圖9，從中分離出了2種物質(zhì)。表5顯示在10 mL DPPH自由基中加入500 μL的浸泡液，相對于浸泡酒的氣相色譜峰有2種物質(zhì)的氣相色譜峰消失，分別為葉綠醇、棕櫚酰胺，并且也有新物質(zhì)二苯胺的氣相色譜峰出現(xiàn)。從氣質(zhì)圖中可以看出浸泡液中的很多成分都可以使DPPH自由基分解。

圖9 加入白花酸藤果后的DPPH自由基氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of DPPH free radical after adding Embelia ribes

3 結(jié)論

白花酸藤果浸泡酒提取的最優(yōu)條件是液固比10∶1、乙醇體積分數(shù)50%、超聲功率617 W、超聲時間38 min、提取溫度50 ℃。使白花酸藤果浸泡酒的抗氧化作用充分發(fā)揮，有利于提高酒的風味。

響應面優(yōu)化后預測的最優(yōu)清除率為92.86%，通過實驗測得的清除率為90.9%，與預測值僅相差1.96%。

白花酸藤果浸泡酒中含有較高的抗氧化活性成分，有利于清除人體內(nèi)雜余自由基，可作為特色優(yōu)勢資源進一步開發(fā)利用。