戊己胃漂浮緩釋片抗家兔胃潰瘍譜效關系

卿勇軍， 劉 文， 杜 平， 姚曉艷， 金 陽， 石 亞， 陳淮臣， 何 利

[1. 貴州中醫(yī)藥大學藥學院， 貴州 貴陽550000； 2. 國藥集團同濟堂（貴州） 制藥有限公司， 貴州 貴陽550000； 3. 貴州醫(yī)科大學藥學院， 貴州 貴陽550002]

戊己胃漂浮緩釋片是課題組將經典名方戊己丸結合現(xiàn)代藥用高分子材料及新制劑技術進行劑型改革, 制備的新型胃漂浮緩釋制劑, 其抗炎抗胃潰瘍等作用較傳統(tǒng)戊己丸更加顯著, 具有使用方便、 可定時定位釋放藥物的特點[1]。 中藥譜效關系已廣泛用于中藥的藥效物質基礎研究[2-4], 但關于新制劑的物質基礎分析相對較少。 本實驗采用不同產地來源的原藥材提取制備干浸膏后制備不同批次的新制劑戊己胃漂浮緩釋片, 通過建立制劑的指紋圖譜并比較其主要成分的差異, 同時對不同批次制劑的抗胃潰瘍藥效作用進行評價； 采用灰色關聯(lián)度分析法[5-7]建立指紋圖譜共有峰（以峰面積計） 與抗胃潰瘍藥效作用指標表皮生長因子（EGF） 的譜效關系模型[8-10], 最終確定其主要藥效成分, 為科學闡明新制劑戊己胃漂浮緩釋片的抗胃潰瘍作用藥效物質基礎提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀、 DAD 型紫外-可見光檢測器（美國安捷倫公司）； TDP-5 型單沖壓片機（長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠）； Auy220 型電子天平（日本島津公司）； SK8210HP 型臺式超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）； HC-2062 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）； HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）； TB-1-1 型電子調溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）； 酶標儀（芬蘭雷勃公司）； 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海簡戶儀器設備股份有限公司）。

1.2 試藥 對照品鹽酸小檗堿（批號110713-201212）、 鹽酸巴馬汀 （批號110732-201309）、 鹽酸藥根堿 （批號110733-201108）、 吳茱萸堿（批號110802-201409）、 吳茱萸次堿（批號110801-201207）、 吳茱萸內酯（批號110800-20120）、 芍藥苷（批號110736-201640）, 均購于中國食品藥品檢定研究院； 黃連堿（批號GZDD-0426）、 表小檗堿（批號GZDD-0833）、 芍藥內酯苷（批號GZDD-0690）, 均購于貴州迪達科技有限責任公司。 乙腈（國藥集團化學試劑有限公司）； 磷酸二氫鉀（西隴化工股份有限公司）； 其他試劑均為分析純。 復方丙谷胺西咪替丁片 （批號5170202, 東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司）； EGF 試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司, HL20040, 96T）； 娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團）。

黃連、 吳茱萸、 白芍藥材購于國內不同藥材市場或者藥店, 見表1, 不同產地及品種黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、 三角葉黃連Coptis deltoidea C. K.Cheng et Hsiao 或云連Coptis teeta Wall. 的干燥根莖, 吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.、石 虎 Euodia rutaecarpa （ Juss.） Ben -th. var. officinalis（Dode） Huang 或 疏 毛 吳 茱 萸Euodia rutaecarpa （Juss.）Benth. var. bodinieri （Dode） Huang 的干燥近成熟果實, 白芍為毛莨科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根, 經貴州中醫(yī)藥大學周漢華教授鑒定為正品。 11 批戊己胃漂浮緩釋片由本實驗室制備。

表1 樣品信息

1.3 動物 健康新西蘭家兔, 體質量2 ～2.5 kg, 雌雄各半, 均由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供, 實驗動物生產許可證號0201602。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿3.06 mg、 鹽酸巴馬汀4.69 mg、 鹽酸藥根堿5.43 mg、 黃連堿4.06 mg、 表小檗堿5.38 mg、 吳茱萸內酯5.25 mg、 吳茱萸堿4.64 mg、吳茱萸次堿4.45 mg、 芍藥內酯苷5.25 mg、 芍藥苷4.98 mg, 分別置于10 mL 棕色量瓶中, 加甲醇至刻度, 作為對照品母液冷藏備用。 依次精密吸取各母液2.60、 2.00、0.20、 0.50、 0.60、 0.20、 0.20、 0.10、 0.68、 1.20 mL,置于同一10 mL 棕色量瓶中, 加甲醇至刻度, 即得, 冷藏備用。

2.2 供試品溶液制備 取11 批戊己胃漂浮緩釋片適量,充分研磨, 分別精密稱取0.1 g, 置具塞錐形瓶中, 分別精密加入25 mL 甲醇, 稱定質量, 超聲提取30 min, 放冷,甲醇補足減失的質量, 搖勻, 過0.45 μm 微孔濾膜, 取續(xù)濾液, 即得。

2.3 色譜條件 Agilent ZORBAX 色 譜 柱 XDB-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動相乙腈（A） -KH2PO4溶液（B）, 梯度洗脫, 程序見表2； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 進樣時間55 min； 檢測波長225 nm； 進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.4 抗胃潰瘍藥效指標考察

2.4.1 胃潰瘍模型及給藥 除正常對照組外的各組家兔均灌胃70%乙醇-0.15 mol/L 鹽酸混合溶液以誘導家兔產生胃潰瘍[11-12], 以1 mL/kg 劑量灌胃相應體積混合液。 將家兔隨機分為以下14 組： 對照組、 模型組、 陽性組（丙谷胺西咪替丁片）、 11 個給藥組, 每組6 只, 雌雄各半。

家兔造模后第2 天, 各給藥組給予相應受試藥物12 d,正常對照組和模型組給予等量生理鹽水, 戊己胃漂浮緩釋片按人體劑量（以60 kg 計） 換算為0.400 g/kg； 陽性組為0.027 g/kg, 其間正常喂予由動物提供中心配送的標準飼料。

2.4.2 血清及胃組織液中EGF 檢測 家兔治療結束后,禁食不禁水24 h, 采用5 mL 注射器于家兔耳中央動脈取血（取血前先剔除家兔耳中央動脈血管周圍部分毛發(fā), 然后使用酒精棉反復擦拭或用手指反復來回按摩, 使血管擴張,緩慢拉動抽取, 避免溶血） 約5 mL, 放置于10 mL 離心管中, 室溫靜置20 min 左右, 待離心管上端有血清液分層析出時, 即可轉移至離心機中離心血液。 家兔取血完成后,采用空氣栓塞法處死, 剪取胃潰瘍瘢痕周圍組織約0.3 g,正常組取同一部位組織, 用適量生理鹽水制成10%組織勻漿液, 兩者均以10 000 r/min 轉速離心10 min, 移液器吸取上清液, 留樣檢測。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A 版軟件處理圖譜數(shù)據(jù), SPSS16.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析,各組計量數(shù)據(jù)資料以示, 當資料滿足正態(tài)分布且組間方差齊時, 選用單因素方差分析進行處理； 如不滿足上述條件, 則采用非參數(shù)檢驗, 即秩和檢驗, 數(shù)據(jù)按α=0.05 為檢驗水準。 P＜0.05 表示差異顯著, P＜0.01 表示差異極顯著。

3 結果

3.1 指紋圖譜建立 取11 批戊己胃漂浮緩釋片, 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.3” 項色譜條件下進樣, 將色譜圖導入相似度評價系統(tǒng)分析軟件, 共確定16 個共有峰, 色譜圖見圖1, 共有模式疊加圖見圖2。 并對共有峰進行定性分析, 結合對照品和文獻信息, 結果見表3。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

圖2 11 批樣品HPLC 指紋圖譜

3.2 EGF 檢測 由表4 可知, 模型組大鼠血清及胃組織勻漿液中EGF 水平明顯較高, 與對照組比較差異顯著（P＜0.01）； 11 個給藥組均能不同程度降低大鼠血清及胃組織勻漿液中EGF 水平, S1、 S2、 S3、 S9、 S10 效果較好, 與模型組和對照組比較均差異顯著（P＜0.01）。

表3 11 批樣品峰面積

表4 各組EGF 水平比較（ng/mL， n=6）

表4 各組EGF 水平比較（ng/mL， n=6）

注：與模型組比較,△△P＜0.01；與對照組比較,**P＜0.01

images/BZ_238_236_2295_1194_2353.png對照組 2 201.23±7.08△△ 2 659.71± 26.77△△模型組 4 694.00±32.96** 4 608.21±15.16**陽性組 3 018.40±12.49△△** 2 827.17±27.19△△**S1 組 3 219.24±21.76△△** 3 451.16±14.21△△**S2 組 2 853.92±19.19△△** 3 415.34±9.16△△**S3 組 3 009.57±13.23△△** 3 152.04±10.52△△**S4 組 3 442.29±17.37△△* 3 585.29±16.76 S5 組 3 953.18±37.72 3 611.94±47.43 S6 組 3 630.10±20.56 3 138.66±34.67△△**S7 組 3 232.33±15.69△△ 3 473.46±12.64△△**S8 組 3 810.45±48.45 3 183.67±24.91△△**S9 組 3 352.85±10.42△△** 3 352.81±12.60△△**S10 組 2 907.11±11.26△△** 3 464.91±26.54△△**S11 組 3 961.21±19.25 3 831.29±10.13

3.3 灰色關聯(lián)分析

3.3.2 譜效關系 按關聯(lián)度大小進行排序, 見表5, 可知指紋圖譜中共有峰峰面積與抗胃潰瘍作用藥效指標表皮生長因子 （EGF） 的降低有高度關聯(lián)性, 關聯(lián)度均大于0.550 0。 各色譜峰對藥效指標EGF 促進作用的貢獻依次為13＞6＞8＞10＞15＞7＞9＞12＞4＞14＞16＞1＞5＞11＞3＞2, 其中13號峰（鹽酸小檗堿）、 6 號峰（芍藥苷）、 8 號峰（表小檗堿）、 10 號峰（黃連堿）、 15 號峰（吳茱萸堿） 關聯(lián)度均在0.750 0 以上, 表明戊己胃漂浮緩釋片抗胃潰瘍是通過有效組分群共同發(fā)揮藥效作用。

表5 關聯(lián)度測定結果

灰色關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn), 5 種藥效成分對抗胃潰瘍作用的貢獻程度最大, 提示接下來研究的重點方向應為制劑體內藥效成分作用規(guī)律及機制[14], 實現(xiàn)離體與在體實驗相補充、 微觀與宏觀相結合, 建立更加符合科學理論的藥效篩選及評價體系, 為制劑抗胃潰瘍作用機制與藥效物質基礎研究開辟新的道路。

4 討論

已有研究表明[15-16], EGF 具有抑制胃酸、 胃蛋白酶的分泌, 降低其對黏膜的損傷, 抑制胃黏膜細胞凋亡, 維持黏膜完整性的作用； 增加胃黏膜的血流量, 促進血管生成、結締組織再生、 黏膜分泌重碳酸鹽, 保護胃黏膜免受損傷因子破壞； 增加上皮細胞的合成, 促進胃黏膜損傷修復和潰瘍愈合, 減少潰瘍復發(fā), 是抗炎、 抗胃潰瘍作用的重要機制之一[17-18]。

本實驗對11 批戊己胃漂浮緩釋片進行了HPLC 指紋圖譜分析, 確定了16 個共有峰, 明確了其中10 個所代表的化學成分, 可較好表征制劑成分的信息。 采用灰色關聯(lián)分析方法建立了共有色譜峰與抗胃潰瘍藥效之間的譜效關系,表明各共有峰與抗胃潰瘍作用均有不同程度的關聯(lián)性, 關聯(lián)度在0.598 7～0.832 6 之間, 其中鹽酸小檗堿、 芍藥苷、表小檗堿、 黃連堿、 吳茱萸堿抗胃潰瘍作用關聯(lián)度較強,進一步明確了制劑譜效關系, 為相關效物質基礎研究提供參考依據(jù)。