芡莖多糖單糖組成及抗炎活性

王 倩， 吳啟南，2*， 吳達維， 黃志恒， 薛 敏， 喬晶晶， 桑夢如

（1. 南京中醫(yī)藥大學藥學院， 江蘇 南京210023； 2. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京210023）

植物多糖作為一類重要的天然大分子活性物質(zhì), 具有抗氧化[1-2]、 抗炎[3]、 抗病毒[4]、 抗腫瘤[5]、 降血糖[6-7]、降血脂[8]以及提高免疫[9]等廣泛的生物活性, 多糖研究也成為當前天然產(chǎn)物研究最活躍的領(lǐng)域之一。

芡Euryale ferox Salisb 為睡蓮科單屬種水生植物, 有蘇芡和刺芡2 個品種[10]。 芡莖是芡的葉柄和花梗又稱雞頭菜, 嫩莖在夏秋季節(jié)常作為時令蔬菜食用[11]。 據(jù)《本草綱目》 記載, 芡莖有“止煩渴, 除虛熱” 之功效[12]。 芡莖中豐富的氨基酸和膳食纖維為多糖的獲得提供了豐富的原材料[13]。 通過芡實種植基地調(diào)研, 發(fā)現(xiàn)芡莖作為芡的非藥用部位被丟棄, 造成了巨大的資源浪費, 而現(xiàn)代藥理實驗證明芡莖多糖具有良好的降糖、 調(diào)脂、 抗氧化等作用[14]。 但目前有關(guān)芡莖多糖的抗炎活性未見有相關(guān)報道, 因此, 本研究從廢棄資源利用的角度出發(fā), 首先對其進行回收, 其次對回收的芡莖通過干燥, 粉碎等前處理, 從中提取純化多糖成分, 并利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）、 高效液相凝膠色譜（HPGPC） 等方法對其多糖單糖組成、 分子量進行分析, 并對芡莖多糖（EFPP） 的抗炎活性進行初步探究, 以期為后續(xù)化妝品及食品的研發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； Alltech 6000 ELSD （美國Alltech 公司）； Hypersil NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）； AY220 型電子分析天平（日本島津公司）； SAGA-10TY 型易普易達超純水儀（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）； UV-1100 型紫外分光光度計 南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司； FreeZone2.5L型真空冷凍干燥機（美國Labconnco 公司）； BSZ-100 型自動部分收集器（上海青浦滬西儀器廠）； 其他試劑均為分析純。

1.2 材料 DEAE 纖維素（上海寶曼生物科技有限公司）；L-鼠李糖、 D-木糖、 L-阿拉伯糖、 D-果糖、 D-甘露糖、 D-葡萄糖（上海源葉生物科技有限公司）； Dextran 標準葡聚糖（上海源葉生物科技有限公司）； 二甲苯（江蘇永華精細化學品有限公司）； 小鼠白介素-1? （IL-1?）、 白細胞介素-6 （IL-6）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α） Elisa 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）。 芡莖2017 年9 月采集于江蘇高郵界首, 經(jīng)南京中醫(yī)藥大學吳啟南教授鑒定為睡蓮科芡屬芡Euryale ferox Salisb. 的葉柄和花梗。

2 方法與結(jié)果

2.1 芡莖多糖提取

2.1.1 原料預處理 將芡莖切3 ～5 cm 小段, 50 ℃烘干,粉碎過20 目篩。 稱取500 g 芡莖粉末, 加10 倍量無水乙醇, 回流提取3 次, 每次2 h, 抽濾, 棄濾液, 濾渣揮干溶劑, 以除去芡莖中的有顏色物質(zhì)、 小分子多糖、 低聚糖及小分子化合物, 得到預處理的芡莖粉末備用。

2.1.2 提取 精密稱取預處理的芡莖粉末250 g, 加入10倍體積超純水, 超聲提?。?0 kHz, 80 ℃） 32 min。 抽濾,濾液加無水乙醇使得含醇量為80%, 4 ℃過夜, 離心, 棄濾液, 無水乙醇洗滌3 次, 冷凍干燥, 即得[15]。

2.2 純化 芡莖多糖采用優(yōu)化后的木瓜蛋白酶結(jié)合三氯乙酸法[16]脫蛋白, 進行初步純化。 取經(jīng)脫蛋白處理后的芡莖多糖, 采用離子交換柱色譜進行分離純化。 依次以蒸餾水和梯度NaCl 溶液為洗脫液, 體積流量0.5 mL/min, 流出液5 mL/管, 蒽酮-硫酸[17]法隔管跟蹤檢測, 在波長620 nm下測定吸光度, 收集同一洗脫峰的多糖樣品, 以管號為橫坐標, 多糖洗脫液的吸光度為縱坐標, 繪制洗脫曲線, 見圖1。 按洗脫峰收集、 合并、 透析、 濃縮、 醇沉和凍干,處理得到純化芡莖多糖3 個組分EFPP1、 EFPP2、 EFPP3,均為白色粉末, 其中EFPP1 洗脫液為蒸餾水, EFPP2 洗脫液為0.1 mol/L NaCl, EFPP3 洗脫液為0.2 mol/L NaCl。

圖1 芡莖多糖DEAE-52 洗脫曲線

2.3 相對分子量測定

2.3.1 色譜條件 TSK-gel G5000 PWxl 色譜柱（7.8 mm×30 cm, 日本Tosoh 公司）； 流動相蒸餾水； 體積流量0.8 mL/min； 柱溫30 ℃； 進樣量10 μL。 蒸發(fā)光散射器的檢測條件為漂移管溫度110 ℃； 載氣流量1.8 mL/min； 增益1[18-19]。

2.3.2 供試品溶液制備 分別取Dextran T5、 T10、 T40、T70、 T380、 T2000 等已知相對分子質(zhì)量葡聚糖對照品, 以蒸餾水配成2 g/L 的溶液, 過0.45 μm 微孔濾膜, 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣。 以對照品分子量（Mw） 的對數(shù)與其相對應(yīng)的保留時間（tR） 進行回歸, 得回歸方程log Mw= a+btR[20]。 分 別 取 芡 莖 多 糖 組 分EFPP1、 EFPP2、EFPP3 以蒸餾水配成質(zhì)量濃度為2 g/L 的多糖溶液, 測得各組分相對分子質(zhì)量。 見圖2。

EFPP1 中有2 個明顯峰, 保留時間分別為5.783、8.737 min； EFPP2 中也存在2 個明顯峰, 保留時間分別為5.340、 6.668 min； EFPP3 不但多糖分子量太大且在制備過程中得率較低, 故主要對EFPP1 和EFPP2 進行研究。 以對照品分子量（Mw） 的對數(shù)與其相對應(yīng)的保留時間（tR）進行回歸, 得方程log Mw = -0.437 8 tR+9.117 9, r =0.999 0, 根據(jù)標準曲線可計算出EFPP1 組分中保留時間8.737, EFPP2 組分中保留時間6.668 min 下多糖相對分子量分別為1.96×102、 1.58×103KDa。 另外EFPP1、 EFPP2組分保留時間分別為5.783、 5.340 min, 多糖分子量均大于2.00×103KDa。

圖2 各成分HPGPC 圖

2.4 單糖組成分析

2.4.1 色譜條件 Hypersil NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）； 流動相乙腈-水（85 ∶15）； 體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃； 進樣量10 μL。 蒸發(fā)光散射器的檢測條件為漂移管溫度110 ℃； 載氣流量1.8 L/min； 增益1[21]。

2.4.2 混合單糖對照品及供試品溶液制備 精密稱取單糖對照品各20 mg, 用蒸餾水配成4 g/L 的混合單糖對照品溶液, 再將其稀釋成系列濃度對照品, 同時將每種單糖配成4 g/L的標準單糖對照品溶液。

分別取芡莖多糖EFPP1、 EFPP2 各10 mg, 加入到2 mL的安瓿瓶中, 向瓶中加入1.5 mL 2 mol/L H2SO4溶液, 鋁蓋壓口封管, 將瓶置于105 ℃烘箱, 水解8 h, 冷卻,BaCO3調(diào)pH 7, 12 000 r/min 離心10 min, 上清液過0.45 μm微孔濾膜備用。 分析結(jié)果見圖3。

可知, EFPP1、 EFPP2 都含有4 種單糖, 出峰時間分別為鼠李糖、 阿拉伯糖、 甘露糖、 葡萄糖。 EFPP1 中4 種單糖其物質(zhì)的量之比12.06 ∶9.544 ∶3.967 ∶9.131。 EFPP2中4 種單糖其物質(zhì)的量之比13.69 ∶11.64 ∶18.14 ∶6.616。

2.4.3 方法學考察

2.4.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品適量, 用超純水稀釋成混合對照品系列溶液。 在“2.4.1” 項色譜條件下測定。 以單糖峰面積的對數(shù)為縱坐標（Y）, 對照品進樣量的對數(shù)為橫坐標（X）, 進行線性回歸, 結(jié)果測得6 種單糖在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系

2.4.3.2 精密度試驗 精密吸取一定濃度的混合對照品溶液, 在“2.4.1” 項色譜條件下連續(xù)進樣6 次, 測得各單糖峰面積的RSD 1.04% ～1.92%, 表明儀器精密度良好。

2.4.3.3 重復性試驗 精密稱取芡莖多糖樣品EFPP1 6份, 按“2.4.2” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.4.1”項色譜條件下進樣, 測得EFPP1 中各單糖峰面積RSD 1.02% ～2.78%, 表明該方法重復性良好。

2.4.3.4 穩(wěn)定性試驗 取芡莖多糖樣品EFPP1 供試品溶液, 在“2.4.1” 項色譜條件下, 分別于0、 2、 4、 8、 12、24 h 進樣, 測得EFPP1 中各單糖峰面積RSD 0.82% ～2.27%, 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖3 各成分HPLC-ELSD 圖

2.4.3.5 加樣回收率試驗 稱取已知含有量的同一批樣品9 份, 精密稱定, 加入樣品中各單糖成分含有量80%、100%、 120%的對照品溶液, 按“2.4.2” 項下方法水解,在“2.4.1” 項色譜條件下進樣, EFPP1 中各單糖平均加樣回收率95.81% ～97.35%, RSD 1.26% ～2.43%, 結(jié)果見表2。

2.5 抗炎活性評價

2.5.1 分組與給藥 ICR 小鼠36 只, 隨機分為空白組、 模型組、 陽性組、 芡莖多糖高、 中、 低6 組。 每組6 只。 二甲苯致炎前, 每天上午9： 00 和下午4： 00 灌胃給藥, 連續(xù)給藥3 d。 陽性藥組給予阿司匹林混懸液, 芡莖多糖高、中、 低劑量組分別給予不同質(zhì)量濃度的芡莖多糖溶液, 空白組和模型組給予等體積的生理鹽水, 各組小鼠每次給藥體積為10 mL/kg。

2.5.2 芡莖多糖對耳腫脹度、 各炎癥因子的影響 末次給藥1 h 后, 除空白組外, 各組小鼠于右耳正反兩面涂0.04 mL二甲苯致炎, 左耳作對照。 1 h 后眼眶取血, 血樣靜置30 min 后3 000 r/min 離心10 min, 取上清, ELISA 法檢測血清中TNF-α、 IL-1?、 IL-6 水平。 將取完血后小鼠脫頸椎處死, 沿耳廓線剪下兩耳, 用直徑7 mm 的打孔器在同一部位打下圓耳片, 稱定質(zhì)量, 以左右耳片質(zhì)量之差與左耳的比值為腫脹度。 結(jié)果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

表3 芡莖多糖對小鼠耳廓腫脹度以及血清中TNF-α， IL-1?， IL-6 水平的影響， n=6）

表3 芡莖多糖對小鼠耳廓腫脹度以及血清中TNF-α， IL-1?， IL-6 水平的影響， n=6）

注：與空白組比較,aP＜0.01；與模型組比較,bP＜0.01,cP＜0.05

images/BZ_234_236_2458_2244_2508.png空白組 - 0b 250.30±22.89b 35.61±4.76b 63.20±4.74b模型組 - 0.55±0.30a 351.19±8.57a 51.48±0.91a,b 82.49±1.56a,c陽性組 0.06 0.06±0.02c 272.83±15.69b 36.79±3.62b 64.56±5.85c芡莖多糖高劑量組 0.4 0.10±0.37c 280.92±19.77b 36.58±6.64b 68.15±8.50c芡莖多糖中劑量組 0.2 0.13±0.18c 293.48±31.20a,b 38.31±4.73b 87.02±8.75a芡莖多糖低劑量組 0.1 0.23±0.03 304.72±30.58a,c 43.40±9.01 104.64±15.65a,b

圖3 可知, 與空白組比較, 模型組小鼠耳腫脹度顯著（P＜0.01） 增加, 芡莖多糖各劑量組均能降低小鼠耳廓腫脹度, 其中高、 中劑量作用尤其顯著（P＜0.05）。 與空白組比較, 模型組小鼠血清中TNF-α、 IL-1?、 IL-6 的水平顯著（P＜0.01） 增加。 與模型組比較, 陽性藥能顯著降低小鼠血清 中TNF-α、 IL-1?、 IL-6 的 水 平 （P ＜0.01 或P ＜0.05）； 芡莖多糖各給藥組中, 其中高劑量組能顯著降低小鼠血清中TNF-α、 IL-1?、 IL-6 的水平（P ＜0.01 或P ＜0.05）, 中劑量組能顯著降低TNF-α、 IL-1? 的水平（P ＜0.01）, 低劑量組僅能顯著降低TNF-α 的水平（P＜0.05）?？偟膩碚f, 芡莖多糖各劑量組都能在一定程度上抑制炎癥因子的表達, 具有較好的抗炎活性。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 實驗結(jié)果采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析,用單因素方差分析組間差異的顯著性, 結(jié)果采用s） 表示, P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

本研究對芡莖多糖分離、 純化, 并對其組成進行分析,結(jié)果表明芡莖多糖水洗脫組分EFPP1、 EFPP2 各含有4 種單糖。 另外可能還有少量未被標識的單糖。 與文獻[22]報道的結(jié)果存在少量差異, 該文獻中芡莖多糖共存在6 種單糖, 而本實驗只檢測到4 種, 可能是這2 種糖含有量太低。 二甲苯所致小鼠耳廓腫脹模型屬于炎癥反應(yīng)早期, 主要反應(yīng)炎癥對毛細血管通透性改變的影響, 主要以局部血管擴張和毛細血管通透性增加為特征。 因此該模型可用于評價藥物對炎癥早期血管通透性增加的影響程度, 從而反映藥物對急性炎癥的作用。 本研究對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹實驗結(jié)果表明, EFPP 各劑量組可以顯著抑制由二甲苯所致小鼠耳廓腫脹, 表明EFPP 對急性炎癥有一定的抑制作用。 IL-1? 對中性粒細胞、 巨噬細胞和淋巴細胞有激活、趨化作用, 并誘導TNF-α、 IL-6 等多種細胞因子分泌引起炎癥反應(yīng)。 本實驗中芡莖多糖能抑制二甲苯所致小鼠耳廓中IL-1?、 TNF-α、 IL-6 的異常升高。 通過對芡莖多糖分子量、 單糖組成的測定以及抗炎活性的初步探究, 本課題組對芡莖這一廢棄資源有了更近一步的認識, 以期為后續(xù)資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。