地椒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

常小強(qiáng)， 趙一帆， 馬 悅， 王 坤， 孫 鵬， 張 東， 楊 嵐（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所， 北京100700）

地椒為唇形科百里香屬植物百里香Thymus mongolicus （Ronn.） Ronn. 或興凱百里香Thymus przewalskii （Kom） Nakai 的干燥地上部分[1], 主要分布于河北、 山西、 陜西、 甘肅、 寧夏等地[2]。地椒, 始載于《嘉佑本草》, 味辛, 溫, 有小毒,具有溫中散寒、 驅(qū)風(fēng)止痛的功效[3]。 百里香和興凱百里香的化學(xué)成分研究主要集中在揮發(fā)油, 已報(bào)道化學(xué)成分有芝麻素、 木栓酮、 表木栓醇、 β-谷甾醇等[4]。 藥理學(xué)研究表明, 地椒具有抗炎、 抗氧化、 抗腫瘤、 抑菌、 抑制血栓形成、 減輕過敏反應(yīng)等作用[5-8]。 有關(guān)地椒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 在1977 年版《中國(guó)藥典》、 2009 年版《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 和2013 年版《山西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 中, 僅見“來源、性狀、 顯微鑒別、 炮制、 性味與歸經(jīng)、 功能與主治、 用法與用量、 貯藏” 項(xiàng)目, 2013 年版《山西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 增加檢查項(xiàng)下“雜質(zhì)、 水分、 總灰分、 酸不溶性灰分、 浸出物”, 均未收載薄層鑒別、 含有量測(cè)定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

同 屬 植 物 Thymus vulgaris、 Thymus zygis、Thymus serpyllum 收載于《歐洲藥典》 （EP 8.0）和《英國(guó)藥典》 （BP 2013）, 入藥部位為干燥葉和花、 全草或干燥帶花地上部分, 薄層鑒別藥材中含有麝香草酚和香荊芥酚； 含有量測(cè)定采用氣相色譜法, 測(cè)定揮發(fā)油中麝香草酚和香荊芥酚, 不得少于40%。 歐洲藥典（EP 9.0） 修改薄層鑒別為以蘆丁、 迷迭香酸為對(duì)照品, 檢識(shí)藥材中含有迷迭香酸, 而不含蘆丁[9-10]。 本研究參考國(guó)外藥典同屬植物相關(guān)標(biāo)準(zhǔn), 選取具有抗炎、 抗氧化、 抗腫瘤、 抑菌、 抑制血栓形成、 抗過敏作用的迷迭香酸[11-13]作為薄層鑒別和含有量測(cè)定指標(biāo)性成分[14-15], 對(duì)20 批樣品進(jìn)行薄層鑒別和含有量測(cè)定, 并測(cè)定了藥材的水分、 灰分和浸出物, 以期建立地椒定性和定量評(píng)價(jià)方法, 完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 材料 迷迭香酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院, 批號(hào)111871-201706, 含有量90.5%）；乙腈（色譜純, 賽默飛世爾科技有限公司）； 磷酸（色譜純, 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）； 其他試劑為分析純（北京化工廠）。 20 批地椒樣品,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為唇形科百里香屬植物百里香Thymus mongolicus Ronn. 或興凱百里香Thymus przewalskii Nakai 的干燥全草, 信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 儀器 LC-2010AHT 色譜儀 （日本島津公司）； XS105 DualRange 電子天平、 AL204-lC 電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）； DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）； RJM-2810 茂福電阻爐（北京電爐廠）； ZF-90 多功能暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；KQ-300E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； DHG-9 140 A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）； 高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 取地椒粉末5 g 至錐形瓶中,加甲醇50 mL, 超聲處理10 min, 濾過, 濾液作為供試品溶液。 另取迷迭香酸對(duì)照品, 加甲醇制成每1 mL 含64 μg 的溶液, 作為對(duì)照品溶液。 照薄層色譜法（通則0502） 試驗(yàn)[15], 吸取上述2 種溶液各2 μL, 分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上, 以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（3 ∶10 ∶0.2） 為展開劑, 展開, 取出, 晾干, 置紫外光燈（365 nm） 下檢視,供試品色譜中, 在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上, 顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。 見圖1。 結(jié)果表明不同產(chǎn)地地椒均含有迷迭香酸。

圖1 地椒薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of thyme

2.2 迷迭香酸含有量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[16]Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸溶液（17 ∶83）； 檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm； 柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min； 進(jìn)樣量10 μL。 在上述色譜條件下, 迷迭香酸峰與相鄰色譜峰分離度大于1.5, 且樣品中無其他成分干擾, 理論板數(shù)按迷迭香酸峰計(jì)算不低于6 000。 見圖2。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取迷迭香酸對(duì)照品適量,精密稱定, 加60%丙酮制成每1 mL 含0.352 mg 的溶液, 經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾, 取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取地椒粉末（過40 目篩） 約0.5 g, 精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 精密加入60%丙酮25 mL, 密塞, 稱定質(zhì)量, 加熱回流30 min, 放冷, 再稱定質(zhì)量, 用60%丙酮補(bǔ)足減失質(zhì)量, 搖勻, 經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾, 取續(xù)濾液, 即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液, 加60%丙酮分別制成每1 mL 含迷迭香 酸 352、 176、 88、 44、 22、 11、 5.5、 2.75、1.375、 0.687 5、 0.343 7 μg 的溶液, 經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾, 取續(xù)濾液, 在“2.2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣。 以迷迭香酸對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X）、 峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）, 得回歸方程Y=3 454.101 47 X-33 768.504 57, r=0.999 9, 表明迷迭香酸在3.44 ～3 520.45 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 迷迭香酸HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of rosmarinic acid

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取T-4 號(hào)樣品, 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下, 連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次, 連續(xù)測(cè)3 d, 記錄峰面積。 測(cè)得3 d 日內(nèi)精密度RSD 分別為0.202%、0.290%、 0.072%, 日間精密度為0.294%, 表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取T-4 號(hào)樣品, 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下, 分別于0、 3、 6、 12、 24、 36、 48 h 進(jìn)樣,記錄峰面積。 測(cè)得迷迭香酸峰面積RSD 1.015%,表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取T-4 號(hào)樣品, 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份, 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 記錄峰面積并計(jì)算迷迭香酸含有量, 測(cè)得迷迭香酸的平均含有量2.92 mg/g, RSD 0.479%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的T-4 號(hào)地椒約0.25 g 精密稱定9 份, 分別精密加入迷迭香酸對(duì)照品, 對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)成分量之比為0.5 ∶1、 1 ∶1、 1.5 ∶1, 然后按“2.2.3” 項(xiàng) 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液, 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定, 計(jì)算回收率, 結(jié)果見表2。

表2 迷迭香酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests for rosmarinic acid（n=9）

2.2.9 樣品含有量測(cè)定 取20 批樣品, 分別按“2.2.3” “2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液、 對(duì)照品溶液, 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。 結(jié)果見表3。

表3 迷迭香酸含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g， n=3）Tab.3 Results of content determination of rosmarinic acid（mg/g， n=3）

2.3 檢查項(xiàng)及浸出物測(cè)定 采用2015 年版《中國(guó)藥典》 （四部） 中的烘干法測(cè)定藥材中水分,總灰分測(cè)定法測(cè)定總灰分、 酸不溶性灰分, 熱浸法測(cè)定醇溶性浸出物[16], 每批樣品平行測(cè)定2次, 結(jié)果見表4。 根據(jù)測(cè)定結(jié)果, 確定地椒水分不得過10.0%, 總灰分和酸不溶性灰分分別不得過17.0% 和 8.0%, 醇溶性浸出物不得少于6.0%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)便易行, 能夠準(zhǔn)確、 科學(xué)地評(píng)價(jià)地椒質(zhì)量, 相比現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 增加了薄層鑒別和含有量測(cè)定, 補(bǔ)充完善檢查項(xiàng), 使地椒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更完善全面。

表4 水分、 總灰分、 酸不溶性灰分、 醇溶性浸出物含有量測(cè)定結(jié)果（%， n=2）Tab.4 Results of content determination of water， total ash， acid-insoluble ash and alcohol-soluble extracts （%， n=2）

薄層鑒別試驗(yàn), 考察不同類型薄層板, 硅膠板Si 60 （德國(guó)默克公司）、 DC-Fertigplatten SIL G-25（德國(guó)Macherey-Nagel 公司）、 硅膠板G （青島海洋化工有限公司）, 對(duì)展開結(jié)果的影響, 結(jié)果顯示該方法耐用性良好。 展開后, 直接365 nm 紫外燈下檢視熒光斑點(diǎn), 操作簡(jiǎn)便。

本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[17-19]考察了提取溶劑（甲醇、 80% 甲醇、 稀乙醇）, 提取方法（超聲提取法、 回流提取法）, 提取時(shí)間 （60、 90、 120、150 min）, 發(fā)現(xiàn)稀乙醇回流提取60 min 提取迷迭香酸更充分, 見表5。 在方法學(xué)考察中, 加樣回收率83.00% ～100.94%, 平均值 94.94%, RSD 6.05%, 未達(dá)到藥典要求。 查閱文獻(xiàn)[20-21], 并對(duì)比迷迭香酸對(duì)照品在稀乙醇回流提取60 min 前后HPLC 檢測(cè)結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)迷迭香酸在含水溶劑中長(zhǎng)時(shí)間高溫加熱不穩(wěn)定。 后進(jìn)一步考察提取溶劑（乙腈、 80%乙腈、 20%鹽酸甲醇、 8%鹽酸甲醇、 4%乙酸甲醇、 60%丙酮）, 最終確定最佳提取方法為60%丙酮回流提取30 min。

表5 提取方法考察結(jié)果（n=2）Tab.5 Results of extraction methods （n=2）

分析20 批不同產(chǎn)地樣品中迷迭香酸含有量,購(gòu)于安徽亳州的T-5 樣品含有量較低為2.10 mg/g,其他批次含有量均高于2.10 mg/g, 故將本品迷迭香酸的含有量暫定為不得低于2.00 mg/g, 即按干燥品計(jì)算迷迭香酸的含有量不得低于0.20%。