黃芪總黃酮對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激、 炎癥、 凋亡的影響

馬歷歷， 李 浩， 孫立明， 董 陽(yáng)， 衣柏慧

（吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 吉林 吉林132000）

腦血管病是中老年人群常見(jiàn)慢性病, 危害嚴(yán)重, 以缺血性腦血管病發(fā)病率最高, 約占80%[1],故及時(shí)恢復(fù)腦組織缺血（即血液再灌注） 可減少腦損傷, 但在某些情況下缺血后血流恢復(fù)時(shí)反而進(jìn)一步引起功能障礙和組織損傷, 稱(chēng)為腦缺血再灌注損傷[2]。 目前, 治療腦缺血再灌注損傷的藥物往往毒副作用較大, 作用機(jī)制單一, 效果不佳, 而中藥可從多環(huán)節(jié)、 多層次、 多靶點(diǎn)上發(fā)揮作用[3],故闡明相關(guān)作用機(jī)制具有重大意義。

中醫(yī)認(rèn)為, 黃芪具有利尿托毒、 益氣補(bǔ)中等作用, 臨床上用于治療氣虛、 脾虛、 肺虛、 陽(yáng)虛、 體虛等多種虛證, 其主要活性成為氨基酸、 皂苷、 多糖、 黃酮[4], 其中黃酮具有多種生理作用, 如抑制黑色素生成、 降血糖、 抗過(guò)敏、 抗病毒、 抗癌等[5], 而且黃芪總黃酮也具有抑制氧化應(yīng)激、 減少炎癥反應(yīng)及抗凋亡等活性[6-8]。 氧化應(yīng)激、 炎癥反應(yīng)、 凋亡與腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9], 但關(guān)于黃芪總黃酮對(duì)腦缺血再灌注損傷影響的報(bào)道較少, 故本實(shí)驗(yàn)旨在探討該成分對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激、 炎癥反應(yīng)及凋亡的影響, 為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性健康SD 大鼠, SPF 級(jí), 體質(zhì)量180～220 g, 購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK （吉） 2016-0001, 定時(shí)喂食,飲水不限, 在清潔級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)。

1.2 試藥 黃芪總黃酮購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司, 批號(hào)20170125, 含有量≥90.0%； 尼莫地平購(gòu)自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司, 批號(hào)20161218。 丙二醛（MDA）、 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、 超氧化物岐化酶（SOD） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所； 白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D 公司； M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司； 磷酸化-磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K）、 磷酸化-蛋白激酶B （p-AKT） 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

1.3 儀器 752 N 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精科儀器公司）； BG-XM496 酶標(biāo)儀（常州三豐儀器公司）； LightCycler?480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （瑞士羅氏公司）； DYCZ-40 A 轉(zhuǎn)移電泳儀（北京六一生物科技公司）。

2 方法

2.1 分組、 給藥、 造模 將適應(yīng)環(huán)境1 周后的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、 模型組, 尼莫地平 （15 mg/kg） 組及黃芪總黃酮高（60 mg/kg）、 低劑量（30 mg/kg） 組, 造模前15 d 灌胃給藥, 1 次/d。末次給藥后, 按照Longa 等[10]報(bào)道的線栓法制備腦缺血模型, 于缺血2 h 后拔出線栓, 恢復(fù)血流供應(yīng), 進(jìn)行24 h 再灌注。

2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、 腦含水量檢測(cè) 再灌注24 h 后, 各組隨機(jī)選取8 只大鼠, 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分采用Berderson 評(píng)分法[11]。 然后, 各組大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（60 mg/kg） 麻醉后斷頭取腦, 干濕重法測(cè)定腦組織含水量。

2.3 腦組織抗氧化活性、 炎癥因子水平檢測(cè) 再灌注24 h 后, 各組隨機(jī)選取8 只大鼠, 經(jīng)戊巴比妥鈉（60 mg/kg） 麻醉后斷頭取腦, 取部分腦組織, 精密稱(chēng)定質(zhì)量后, 加入10 倍量預(yù)冷生理鹽水,勻漿后制備10%腦組織勻漿液, 4 ℃、 3 000 r/min離心5 min, 吸取上清液, 于-20 ℃冰箱中保存。按照試劑盒操作步驟, 分光光度法檢測(cè)腦組織MDA 水平及GSH-Px、 SOD 活性, 放射免疫法檢測(cè)IL-1β、 TNF-α 水平。

2.4 腦組織Bcl-2、 Bax、 caspase-3 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取大鼠剩余腦組織, 液氮下反復(fù)研磨, Trizol法提取總RNA, 經(jīng)M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 在LightCycler?480 實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x中,SYBR 法檢測(cè)腦組織凋亡相關(guān)基因caspase-3、 Bcl-2、 Bax mRNA 表達(dá)。 然后, 通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量, 以GAPDH 為內(nèi)標(biāo), 所需引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成, 引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.5 腦組織p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取“2.3” 項(xiàng)下10%腦組織勻漿液, 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白量, 12% SDS-PAGE 垂直板電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜, 脫脂奶粉封閉2 h, PBST 洗膜2 次（10 min/次）, 4 ℃下將膜放入p-PI3K、 p-AKT 稀釋液中（1 ∶1 000） 孵育12 h, PBST 洗膜后, 常溫下將膜放入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液中（1 ∶500） 孵育2 h, PBST 洗膜后進(jìn)行DAB 染色。拍照后, 通過(guò)圖像處理軟件進(jìn)行分析, 以目的蛋白條帶、 內(nèi)標(biāo)蛋白條帶灰度值之比表示相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以表示, 2 組間比較采用LSD 法, 多組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪總黃酮對(duì)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、 腦組織含水量的影響 表2 顯示, 與假手術(shù)組比較, 模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、 腦組織含水量顯著升高 （P ＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者顯著降低（P＜0.05）。

表2 黃芪總黃酮對(duì)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦組織含水量的影響s， n=8）Tab.2 Effects of Astragali Radix total flavonoids on neurobehavioral score and water content in brain tissue ±s， n=8）

表2 黃芪總黃酮對(duì)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦組織含水量的影響s， n=8）Tab.2 Effects of Astragali Radix total flavonoids on neurobehavioral score and water content in brain tissue ±s， n=8）

注：與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

images/BZ_62_236_976_2244_1025.png假手術(shù)組 — 0 68.68±8.82模型組 — 2.75±0.32* 85.20±9.23*尼莫地平組 15 1.74±0.19＃ 71.78±8.53＃黃芪總黃酮高劑量組 60 2.28±0.40＃ 72.46±6.71＃黃芪總黃酮低劑量組 30 2.47±0.31＃ 73.05±8.39＃

3.2 黃芪總黃酮對(duì)MDA 水平及GSH-Px、 SOD 活性的影響 表3 顯示, 與假手術(shù)組比較, 模型組MDA 水平顯著升高（P＜0.05）, GSH-Px、 SOD 活性顯著降低（P＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組MDA 水平顯著降低 （P ＜0.05）, GSH-Px、SOD 活性顯著升高（P＜0.05）。

表3 黃芪總黃酮MDA 水平及GSH-Px、 SOD 活性的影響±s， n=8）Tab.3 Effects of Astragali Radix total flavonoids on MDA level and GSH-Px， SOD activities （±s， n=8）

表3 黃芪總黃酮MDA 水平及GSH-Px、 SOD 活性的影響±s， n=8）Tab.3 Effects of Astragali Radix total flavonoids on MDA level and GSH-Px， SOD activities （±s， n=8）

注：與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

images/BZ_62_236_1670_2244_1720.png假手術(shù)組 — 11.15±1.28 95.61±10.30 224.95±26.26模型組 — 18.58±2.18* 41.33±5.47* 105.42±12.71*尼莫地平組 15 13.66±1.25＃ 76.79±8.66＃ 196.72±20.63＃黃芪總黃酮高劑量組 60 14.36±1.37＃ 70.18±9.34＃ 190.85±22.38＃黃芪總黃酮低劑量組 30 15.45±1.68＃ 58.67±7.85＃ 178.06±19.42＃

3.3 黃芪總黃酮對(duì)IL-1β、 TNF-α 水平的影響 表4 顯示, 與假手術(shù)組比較, 模型組IL-1β、 TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者水平顯著降低（P＜0.05）。

表4 黃芪總黃酮對(duì)IL-1β、 TNF-α 水平的影響（s， n=8）Tab.4 Effects of Astragali Radix total flavonoids on IL-1β and TNF-α levels ， n=8）

表4 黃芪總黃酮對(duì)IL-1β、 TNF-α 水平的影響（s， n=8）Tab.4 Effects of Astragali Radix total flavonoids on IL-1β and TNF-α levels ， n=8）

注：與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1）IL-1β/（pg·mg prot-1）TNF-α/（mg·mg prot-1）假手術(shù)組 — 27.04±3.49 126.55±14.15模型組 — 52.69±6.64* 218.70±25.52*尼莫地平組 15 34.28±3.62＃ 144.13±14.16＃黃芪總黃酮高劑量組 60 36.76±4.95＃ 153.08±17.64＃黃芪總黃酮低劑量組 30 39.44±4.87＃ 169.84±16.39＃

3.4 黃芪總黃酮對(duì)caspase-3、 Bcl-2、 Bax mRNA表達(dá)的影響 表5 顯示, 與假手術(shù)組比較, 模型組caspase-3、 Bax mRNA 表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）,Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組caspase-3、 Bax mRNA 表達(dá)顯著降低 （P ＜0.05）, Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

表5 黃芪總黃酮對(duì)caspase-3、 Bcl-2、 Bax mRNA 表達(dá)的影響（s， n=8）Tab.5 Effects of Astragali Radix total flavonoids on caspase-3， Bcl-2 and Bax mRNA expressions s， n=8）

表5 黃芪總黃酮對(duì)caspase-3、 Bcl-2、 Bax mRNA 表達(dá)的影響（s， n=8）Tab.5 Effects of Astragali Radix total flavonoids on caspase-3， Bcl-2 and Bax mRNA expressions s， n=8）

注：與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1） caspase-3 Bcl-2 Bax假手術(shù)組 — 0.62±0.07 0.94±0.11 0.39±0.04模型組 — 1.48±0.15* 0.32±0.03* 1.20±0.14*尼莫地平組 15 0.87±0.00＃ 0.81±0.09＃ 0.63±0.07＃黃芪總黃酮高劑量組 60 1.04±0.11＃ 0.73±0.07＃ 0.78±0.08＃黃芪總黃酮低劑量組 30 1.16±0.13＃ 0.60±0.06＃ 0.91±0.10＃

3.5 黃芪總黃酮對(duì)p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達(dá)的影響 表6、 圖1 顯示, 與假手術(shù)組比較, 模型組p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

表6 黃芪總黃酮對(duì)p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達(dá)的影響±s， n=8）Tab.6 Effects of Astragali Radix total flavonoids on p-PI3K and p-AKT protein expressions （，n=8）

表6 黃芪總黃酮對(duì)p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達(dá)的影響±s， n=8）Tab.6 Effects of Astragali Radix total flavonoids on p-PI3K and p-AKT protein expressions （，n=8）

注：與假手術(shù)組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1）p-PI3K/GAPDH p-AKT/GAPDH假手術(shù)組 — 1.45±0.16 1.24±0.10模型組 — 0.34±0.04* 0.22±0.02*尼莫地平組 15 0.97±0.11＃ 0.85±0.09＃黃芪總黃酮高劑量組 60 0.78±0.07＃ 0.61±0.07＃黃芪總黃酮低劑量組 30 0.56±0.06＃ 0.32±0.06＃

圖1 各組p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達(dá)Fig.1 p-PI3K and p-AKT protein expressions in various groups

4 討論

由于局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ筒恍枰_(kāi)顱, 可極大減少顱內(nèi)感染幾率, 同時(shí)重復(fù)性較好, 故使用頻率最高[12]。 本實(shí)驗(yàn)采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型, 發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能?chē)?yán)重?fù)p傷, 腦組織含水量增加, 提示建模成功； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、 腦組織含水量明顯下降, 表明該成分對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注損傷的主要病理機(jī)制, 由于腦組織代謝旺盛、 需氧量高, 導(dǎo)致生成較多的ROS, 但腦組織自身缺少抗氧化物質(zhì), 更容易受到后者侵害[13], 而且它也會(huì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和代謝反應(yīng)應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生, 直接損傷蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)、 核酸等細(xì)胞內(nèi)大分子, 導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]；MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物, 其水平高低可反映氧化應(yīng)激程度； GSH-Px、 SOD 是體內(nèi)最重要的抗氧化物酶, 可清除細(xì)胞中ROS, 具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用[15]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 模型組大鼠腦組織MDA 水平明顯升高, 而GSH-Px、 SOD活性明顯下降； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組大鼠腦組織MDA 水平明顯下降, 而GSH-Px、 SOD 活性明顯升高, 表明該成分對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與抑制氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

炎癥反應(yīng)是存在于腦缺血再灌注損傷中的另一重要機(jī)制, 會(huì)導(dǎo)致毒性酶激活、 自由基超載等, 從而引起一系列組織病變。 在腦缺血狀態(tài)下, 星形膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞會(huì)分泌大量IL-1β, 它是參與炎癥級(jí)聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)和腦缺血早期炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子[16]； TNF-α 是由巨噬細(xì)胞、 單核細(xì)胞分泌的一種促炎因子, 在腦缺血發(fā)生時(shí)炎性相關(guān)細(xì)胞被過(guò)度激活, 從而使其分泌增加, 進(jìn)而刺激腦組織局部炎癥反應(yīng), 加重腦損傷[17], 而且當(dāng)IL-1β 被激活時(shí)會(huì)促進(jìn)TNF-α 分泌, 同時(shí)兩者又會(huì)增加其他炎癥因子表達(dá), 使腦損傷程度加重[18]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腦組織IL-1β、 TNF-α 水平明顯升高；與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者水平明顯下降,表明該成分對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與減少炎癥反應(yīng)有關(guān)。

凋亡也是腦缺血再灌注損傷伴隨的重要機(jī)制,在發(fā)生腦缺血時(shí)缺血中樞區(qū)周?chē)纳窠?jīng)元死亡以凋亡為主[19]。 caspase 家族成員蛋白在線粒體依賴(lài)途徑和非線粒體依賴(lài)途徑的凋亡進(jìn)程中均起著主導(dǎo)作用, 其中caspase-3 是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)之一[20]。 Bcl-2 家族分為抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白, 在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用, 當(dāng)細(xì)胞處于腦缺血等應(yīng)激狀態(tài)時(shí), 抑凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低, 而促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增加[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 模型組大鼠腦組織caspase-3、 Bax mRNA 表達(dá)明顯升高, 而B(niǎo)cl-2 mRNA 表達(dá)明顯下降； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組前兩者mRNA表達(dá)明顯下降, 而后者mRNA 表達(dá)明顯升高, 表明該成分對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與抗凋亡作用有關(guān)。

研究表明, PI3K/AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腦缺血時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程, 其中AKT 既可促進(jìn)caspase-3 等凋亡蛋白磷酸化, 使其失活, 也能促進(jìn)抗凋亡基因（如Bcl-2） 轉(zhuǎn)錄和表達(dá), 使細(xì)胞存活[22]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 模型組大鼠腦組織p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)明顯下降； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者蛋白表達(dá)明顯升高, 表明該成分對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與激活PI3K/AKT 信號(hào)通路引起的抗凋亡作用有關(guān)。

綜上所述, 黃芪總黃酮對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用, 其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激水平、 減少炎癥反應(yīng)、 抗凋亡作用有關(guān)。