槲皮素對LPS 誘導(dǎo)小鼠RAW264.7 細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用

任改艷， 張步有， 黃劍林

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科， 陜西 延安716000）

炎癥是一種非常重要的基本病理過程, 通常伴隨著多種疾病的發(fā)生發(fā)展, 不僅會(huì)加重疾病進(jìn)程,有時(shí)甚至?xí)a(chǎn)生惡性腫瘤。 在炎癥分子機(jī)制研究中, 基于炎癥信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子篩選抗炎藥物受到廣泛關(guān)注, 其中NF-κB 是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子, 參與多種炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 包括前炎性細(xì)胞因子（TNF-α、 IL-6、 IL-1β 等）、 趨化因子、 免疫受體等[1-2], 在其上游信號(hào)分子中Toll 樣受體（TLRs） 在炎癥反應(yīng)及相關(guān)疾病中的角色備受關(guān)注[3]。 機(jī)體或細(xì)胞在LPS 刺激下, TLRs 通過髓樣分化因子88 （MyD88） 依賴性途徑活化NF-κB,IκBα 發(fā)生磷酸化并降解, NF-κB 異源二聚體轉(zhuǎn)移到核內(nèi), 啟動(dòng)炎癥靶基因的轉(zhuǎn)錄, 進(jìn)而放大炎癥信號(hào)[4]。 因此, 針對性抑制NF-κB 活化及其炎癥信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá), 被認(rèn)為是防治炎癥反應(yīng)及相關(guān)疾病的有效策略。

槲皮素是多羥基黃酮類化合物, 廣泛存在于多種植物中, 目前已知有100 多種中草藥中含有該成分, 如敗醬草、 魚腥草、 旋復(fù)花、 車前子、 槐花等, 具有抗腫瘤、 抗氧化、 抗炎、 保護(hù)心血管、 降壓等多方面生物活性[5-7]。 大量研究表明, 槲皮素抑制細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 級聯(lián)激活[8]、 一氧化氮合酶[9]（iNOS）、 環(huán)氧合酶-2[10]（COX-2） 異常上調(diào)與NF-κB 信號(hào)通路有關(guān), 但尚無基于TLRs/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑考察該成分抗炎活性及其機(jī)制的報(bào)道, 故本實(shí)驗(yàn)研究槲皮素對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥的保護(hù)作用,探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料

槲皮素由廣東一方制藥有限公司提供（含有量≥98%, 編 號(hào) P0242）。 小 鼠 巨 噬 細(xì) 胞 系RAW264.7 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所； DMEM 培養(yǎng)基、 胎牛血清、 脂多糖（LPS） 購自美國Bio-Rad 公司； CCK-8 試劑盒、 Griess 試劑盒、 TRIzol regent、 DMSO、 ECL 顯影試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 熒光定量PCR 試劑盒、 BCA 蛋白定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司； β-actin、 iNOS、 IκBα、 p-IκBα 及p-NF-κB p65抗體購自美國CST 公司； TLR4 抗體購自美國Santa Cruz 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng), 置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中, 每2 d 換液1 次, 取對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞活力檢測 RAW264.7 細(xì)胞懸液按照1×106/mL 的密度接種于96 孔板中, 每孔100 μL,設(shè)置空白組（培養(yǎng)基）、 對照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、槲皮素組（1、 5、 15、 25、 35、 50 μmol/L）, 每組4 個(gè)復(fù)孔, 藥物干預(yù)12 h, 24 h 后棄去培養(yǎng)基,每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵育1 h, 450 nm 波長處測定吸光度（A）, 計(jì)算細(xì)胞存活率, 公式為存活率=[（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對照組-A空白組）] ×100%。

2.3 NO 水平檢測 采用Griess 法。 RAW264.7 細(xì)胞懸液按照1×105/mL 的密度接種于96 孔板, 1、5、 15、 25、 35、 50 μmol/L 槲皮素預(yù)處理2 h 后,加入LPS （2 μg/mL） 共同孵育12 h, 設(shè)置空白組（培養(yǎng)基）、 對照組 （細(xì)胞+培養(yǎng)基）、 LPS 組、LPS+槲皮素組, 每組6 個(gè)復(fù)孔, 按照Griess 試劑盒操作步驟測定上清亞硝酸鹽（NO2-） 含有量。

2.4 炎癥因子mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-PCR 法。RAW264.7 細(xì)胞懸液按照1×106/mL 的密度接種于6 孔板中, 每孔3 mL, 同法處理、 培養(yǎng)細(xì)胞, 每組3 個(gè)復(fù)孔, 培養(yǎng)結(jié)束后TRIzol 試劑提取總RNA, 定量蛋白。 按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成槲皮素, SYBR Green PCR 試劑聯(lián)合熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和檢測, 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min, 95 ℃變性15 s, 60 ℃退火60 s, 共43 個(gè)循環(huán)。 再通過Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物, 并采用Blast 程序進(jìn)行驗(yàn)證, 涉及引物由西安西今生物科技公司合成, 見表1, 每次擴(kuò)增以β-Actin 基因?yàn)閮?nèi)標(biāo), 對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析, 比較各組mRNA表達(dá)。

2.5 NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot 法。 同法處理、 培養(yǎng)細(xì)胞, 培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清, 預(yù)冷PBS 液洗滌, 使用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液于冰上裂解蛋白, 離心取上清, 按照BCA 試劑盒操作步驟定量蛋白, 95 ℃滅活15 min, 10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白, 濕轉(zhuǎn)100 min 后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上, 5%脫脂牛奶封閉2 h, 分別用一抗iNOS、 COX-2、 TLR4、IκBα、 p-IκBα、 p-NF-κB p65、 β-actin 于4 ℃下孵育過夜。 PBST 緩沖液洗膜3 次, 每次10 min, 與二抗共孵1 h 后ECL 顯影。 以β-actin 為內(nèi)標(biāo), 定量分析蛋白表達(dá)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以±s） 表示, 組間比較采用單向方差分析及LSD 檢驗(yàn)。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 圖1顯示, RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)0 ～50 μmol/L 槲皮素處理12、 24 h 后, 其活力無明顯變化（P＞0.05）。

圖1 槲皮素對RAW264.7 細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of quercetin on RAW264.7 cell viability

3.2 槲皮素對NO 釋放及iNOS、 COX-2 蛋白表達(dá)的影響 圖2 顯示, 與對照組比較, LPS 組NO 釋放顯著升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素（25、 50 μmol/L） 組其釋放顯著降低（P ＜0.05）。 圖3 顯示, 與對照組比較, LPS 組iNOS、COX-2 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素組能劑量依賴性地顯著抑制兩者蛋白表達(dá)（P＜0.05, P＜0.01）。

3.3 槲皮素對炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響 圖4顯示, 與對照組比較, LPS 組TNF-α、 IL-6、 IL-1β、 iNOS、 COX-2、 MCP-1 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素組六者mRNA 表達(dá)不同程度地下調(diào), 有些差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, P＜0.01）。

圖2 槲皮素對NO 釋放的影響Fig.2 Effects of quercetin on NO release

圖3 槲皮素對iNOS、 COX-2 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of quercetin on iNOS and COX-2 protein expressions

3.4 槲皮素對NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 圖5 顯示, 與對照組比較, LPS 組p-IκBα、 p-NF-κB p65 蛋 白 表 達(dá) 顯 著 升 高 （P ＜0.05, P ＜0.01）, IκBα 蛋白表達(dá)顯著降低（P ＜0.01）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素（25 μmol/L） 組前兩者蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）, 后者蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

3.5 槲皮素對Toll 樣受體及其信號(hào)分子表達(dá)的影響 圖4 顯示, 與對照組比較, LPS 組TLR2、TLR4、 MyD88 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào) （P ＜0.01）；與LPS 組比較, 槲皮組TLR2 mRNA 表達(dá)無顯著變化 （P ＞0.05）, 而 TLR4 （15、 25 μmol/L）、MyD88 （5、 25 μmol/L） mRNA 表 達(dá) 顯 著 下 調(diào)（P＜0.05, P＜0.01）。 圖5 顯示, 與對照組比較,LPS 組TLR4 蛋白表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素（25 μmol/L） 組其蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖4 槲皮素對TNF-α、 IL-6、 IL-1β、 iNOS、 COX-2、 MCP-1、 TLR2、 TLR4、 MyD88 mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of quercetin on TNF-α， IL-6， IL-1β， iNOS， COX-2， MCP-1， TLR2， TLR4 and MyD88 mRNA expressions

圖5 槲皮素對TLR4、 IκBα、 p-IκBα、 p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of quercetin on TLR4， IκBα， p-IκBα and p-NF-κB p65 protein expressions

4 討論

炎癥為常見的基本病理過程, 是對刺激產(chǎn)生的防御性免疫反應(yīng), 各種細(xì)菌、 病毒、 內(nèi)毒素等都能導(dǎo)致人體各組織、 器官、 細(xì)胞炎癥的發(fā)生[11]。 在炎癥反應(yīng)及相關(guān)疾病發(fā)生過程中, 巨噬細(xì)胞是主要的炎癥細(xì)胞, 以LPS 誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7作為體外炎癥模型, 可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)、 細(xì)胞因子、 趨化因子等[12], 均可促進(jìn)炎癥反應(yīng), 故該模型被廣泛用于抗炎藥物篩選評價(jià)。 本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度槲皮素處理RAW264.7 細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)在0～50 μmol/L 時(shí)對細(xì)胞活力無明顯影響, 提示安全用藥范圍為≤50 μmol/L。

iNOS 與炎癥密切相關(guān), 主要在炎癥及LPS 刺激下表達(dá), 可催化L-精氨酸持續(xù)產(chǎn)生NO, 過量NO 將導(dǎo)致細(xì)胞損傷、 組織壞死, 進(jìn)而促進(jìn)炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展, 而且其產(chǎn)生能活化自身的環(huán)氧合酶COX, 其中COX-2 是誘生型表達(dá)的酶, 與炎癥性疾病關(guān)系密切, 其表達(dá)與炎癥嚴(yán)重程度有關(guān), 各種炎癥反應(yīng)中均發(fā)現(xiàn)其蛋白、 mRNA 表達(dá)升高[13]。本實(shí)驗(yàn)用1、 5、 15、 25、 35、 50 μmol/L 槲皮素分別預(yù)處理RAW264.7 細(xì)胞2 h, 與LPS 共同作用后通過Griess 試劑法檢測細(xì)胞上清亞硝酸鹽含有量,Western blot 法檢測iNOS、 COX-2 表達(dá), RT-PCR法檢測iNOS、 COX-2 mRNA 表達(dá), 發(fā)現(xiàn)中、 高劑量組（25、 50 μmol/L） 呈濃度依賴性地抑制由LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞NO 的釋放, 并且不同程度地下調(diào)iNOS、 COX-2 蛋白、 mRNA 表達(dá), 初步驗(yàn)證該成分的體外炎癥保護(hù)作用。

RAW264.7 細(xì)胞表面具有天然免疫的TLRs 病原模式識(shí)別受體, 能識(shí)別外源性同源配體LPS, 后者信號(hào)分子通過TLRs 轉(zhuǎn)導(dǎo)至RAW264.7 細(xì)胞內(nèi), 激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB, 進(jìn)而啟動(dòng)TNF-α、 IL-1β、 IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 （MCP-1） 等炎癥級聯(lián)效應(yīng)酶mRNA 表達(dá), 引發(fā)系列免疫炎癥反應(yīng), 后者又可誘導(dǎo)NF-κB 進(jìn)一步活化, 形成正反饋?zhàn)饔? 加重炎癥反應(yīng)[14-16]。 TLRs 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要包括MyD88 依賴性、非依賴性途徑, 前者介導(dǎo)大部分TLRs, 而后者僅介導(dǎo)TLR3, 而且TLR4 由2 種途徑共同介導(dǎo)[17]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后TLR2、 TLR4、MyD88 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào), 表明RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)是由TLRs 識(shí)別LPS 后引起的TLRs 級聯(lián)免疫炎癥反應(yīng)； 槲皮素能下調(diào)MyD88、 TLR4 mRNA 表達(dá),但對TLR2 mRNA 表達(dá)無明顯作用； 25 μmol/L 濃度下能明顯下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中TLR4 蛋白表達(dá), 表明該成分可通過下調(diào)RAW264.7 細(xì)胞TLR4蛋白、 mRNA 表達(dá), 抑制其募集接頭分子MyD88, 進(jìn)而抑制NF-κB 活化。

TNF-α、 IL-1β、 IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1） 主要是由LPS 誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的前炎細(xì)胞因子, 是機(jī)體早期炎癥標(biāo)志物, 可在損傷、 感染、 免疫反應(yīng)等情況下大量分泌釋放, 為炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑[1]。 本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR 法檢測細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子、 趨化因子mRNA 表達(dá), 發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后RAW264.7 細(xì)胞中TNF-α、 IL-1β、IL-6、 MCP-1 mRNA 表達(dá)均升高, 而槲皮素對其均有劑量依賴性的抑制作用。

NF-κB 是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子, 靜息狀態(tài)下以非活性NF-κB/IκB 復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中, 當(dāng)細(xì)胞受到LPS 等刺激后, IκB 發(fā)生磷酸化并降解, NF-κB、 IκB 解離, 然后轉(zhuǎn)移至核內(nèi)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、 趨化因子表達(dá)及炎癥反應(yīng)[18]。 本實(shí)驗(yàn)通過Western blot 法對NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測, 發(fā)現(xiàn)RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后,細(xì)胞中p-IκB、 p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)增加, IκB 蛋白表達(dá)減少, 而25 μmol/L 槲皮素能下調(diào)前兩者蛋白表達(dá), 上調(diào)后者蛋白表達(dá), 提示該成分可通過抑制IκB 磷酸化和降解, 從而減少NF-κB 核轉(zhuǎn)位。

綜上所述, 槲皮素對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥有一定保護(hù)作用, 其作用機(jī)制可能與該成分參與調(diào)控TLR4/NF-κB 通路, 進(jìn)而抑制細(xì)胞炎性介質(zhì)（iNOS、 COX-2）、 炎性細(xì)胞因子（TNF-α、 IL-1β、 IL-6）、 趨化因子（MCP-1） 表達(dá)有關(guān)。 今后,將進(jìn)一步探討槲皮素炎癥保護(hù)作用的具體分子機(jī)制, 尋找其他更有效的上游分子靶點(diǎn)及信號(hào)調(diào)控通路, 為相關(guān)藥理研究和藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。