痛風(fēng)泰顆粒水提工藝的優(yōu)化

王佛長， 黃詩瑩， 陳劍平， 張尚斌， 謝靜靜， 張劍勇*

（1. 深圳市中醫(yī)院， 深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 深圳518033； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 深圳518033）

痛風(fēng)泰是著名嶺南溫病學(xué)家劉仕倡先生獻(xiàn)方,深圳市中醫(yī)院張劍勇醫(yī)生整理并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)調(diào)整而成, 為治療痛風(fēng)的有效方劑, 由山慈菇、 土茯苓、 粉萆薢、 秦艽、 赤芍、 川牛膝、 山茱萸7 味藥材組成, 具有清熱利濕、 解毒化濁、 祛瘀止痛等功效, 臨床應(yīng)用5 年以上, 療效確切安全[1-6], 但其劑型為湯劑, 攜帶不便, 服用量大, 不能很好滿足現(xiàn)代都市人需求, 故本實(shí)驗(yàn)擬將其進(jìn)一步研制成顆粒劑以方便患者服用。 前期研究表明, 痛風(fēng)泰中臣藥土茯苓有效成分落新婦苷具有鎮(zhèn)痛、 活血化瘀、抑制高尿酸血癥等作用[7]； 佐藥赤芍的指標(biāo)性成分為芍藥苷, 與其他中藥配伍可治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎, 有著抗炎、 抗凝、 抗血栓作用[8], 故本實(shí)驗(yàn)以這2 種成分含有量結(jié)合干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo), 正交試驗(yàn)優(yōu)化痛風(fēng)泰顆粒水提工藝, 為該制劑放大生產(chǎn)提供可靠依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-2030 高效液相色譜儀、 AUMA220D分析天平（日本島津公司）； 超聲波清洗儀（250 W、 40 kHz, 深圳市和科達(dá)超聲設(shè)備有限公司）；500-2 恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）； HHS 電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥 落新婦苷（批號(hào)111798-201504, 含有量93.9%）、 芍藥苷（批號(hào)wkq17102709, 含有量≥98%） 對(duì)照品分別購自中國食品藥品檢定研究院、四川省維克奇生物科技有限公司。 山慈菇（批號(hào)17100101）、 秦艽（批號(hào)17101901）、 赤芍（批號(hào)17061001） 均購自深圳市華輝藥業(yè)有限公司, 土茯 苓 （ 批 號(hào) 20170801 ）、 粉 萆 薢 （ 批 號(hào)170709001）、 川牛膝（批號(hào)171101）、 山茱萸（批號(hào)180101） 分別購自深圳市合丹醫(yī)藥有限公司、康美藥業(yè)股份有限公司、 廣州至信中藥飲片有限公司、 廣東源森泰藥業(yè)有限公司, 經(jīng)深圳市中醫(yī)院藥檢室專家鑒定為正品, 均符合2015 年版《中國藥典》 一部要求。 甲醇、 乙腈為色譜純（美國默克公司）； 其余試劑均為分析純； 水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 優(yōu)化參數(shù)確定 按處方比例稱取方中山慈菇、土茯苓、 粉萆薢等7 味藥材, 加水煎煮, 濾過, 放冷, 濾液濃縮并定容至500 mL。 采用正交試驗(yàn),以濃縮液中落新婦苷、 芍藥苷含有量及干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo), 加水量（A）、 煎煮時(shí)間（B）、 煎煮次數(shù)（C） 為影響因素, 正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化, 因素水平表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.2 干膏得率測(cè)定 精密量取“2.1” 項(xiàng)下濃縮液25 mL, 置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中, 水浴蒸干, 按照干燥失重測(cè)定法（2015 年版《中國藥典》 四部通則0831） 測(cè)定, 計(jì)算干膏得率, 公式

2.3 落新婦苷、 芍藥苷含有量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Hypersil ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A） -0.1%磷酸（B）, 梯度洗脫（1～18 min, 17% ～23%A； 18～25 min, 90%A； 25～30 min, 17%A）； 檢測(cè)波長230 nm； 柱溫30 ℃； 體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取落新婦苷、 芍藥苷對(duì)照品適量, 甲醇分別制成含兩者0.20、0.50 mg/mL的溶液, 即得。

2.3.2.2 供試品溶液 取“2.1” 項(xiàng)下濃縮液適量, 過0.45 μm 微孔濾膜, 取續(xù)濾液, 即得。

2.3.2.3 陰性樣品溶液 按處方量分別稱取不含土茯苓、 赤芍的陰性樣品, 按“2.3.2.2” 項(xiàng)下方法制備, 即得。

2.3.3 專屬性考察 取對(duì)照品、 供試品、 陰性樣品溶液, 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 結(jié)果見圖1, 可知供試品溶液在與對(duì)照品溶液同一保留時(shí)間處有相同色譜峰, 陰性無干擾。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液適量,甲醇逐級(jí)稀釋成分別含落新婦苷0.050 6、 0.101、0.202、 0.405、 0.810、 1.62 mg/mL, 芍藥苷0.054 4、0.109、 0.218、 0.435、 0.870、 1.74 mg/mL。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸, 得方程分別為落新婦苷Y=1.550 45×107X+425 997 （r=0.999 8）、 芍藥苷Y=7.722 81×106X+232 333 （r= 0.999 9）, 分別在0.050 6 ～1.62、 0.054 4～1.74 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 檢測(cè)限與定量限 按信噪比S/N=3, 落新婦苷、 芍藥苷檢測(cè)限分別為0.36、 0.45 μg/mL；按信噪比 S/N = 10, 兩者定量限分別為1.16、 1.53 μg/mL。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量,在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次, 測(cè)得落新婦苷、 芍藥苷峰面積RSD 分別為1.64%、0.43%, 表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量, 于0、2、 4、 6、 12、 24 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得落新婦苷、 芍藥苷峰面積RSD 分別為0.30%、 0.55%, 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液6 份, 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得落新婦苷、芍藥苷峰面積RSD 分別為1.01%、 0.87%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取落新婦苷（0.922 mg/mL）、 芍藥苷（0.685 mg/mL） 含有量已知的濃縮液適量, 共9 份, 分別精密加入相當(dāng)于各成分含有量50%、 100%、 150% 的對(duì)照品, 按“2.3.2.2” 項(xiàng) 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液, 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算回收率。結(jié)果, 落新婦苷、 芍藥苷平均加樣回收率分別為96.15%、 95.32%, RSD 分別為0.68%、 1.43%。

2.4 綜合權(quán)重系數(shù)計(jì)算 層次分析（AHP） 法是主觀權(quán)重賦值, 而客觀權(quán)重賦權(quán)（CRITIC） 法是客觀權(quán)重賦值, 本實(shí)驗(yàn)采用AHP-CRITIC 混合加權(quán)法[9]。 根據(jù)中藥復(fù)方君臣佐使規(guī)律及各成分藥理作用強(qiáng)弱, 將落新婦苷、 芍藥苷含有量及干膏得率作為權(quán)重指標(biāo)予以量化, 即每個(gè)指標(biāo)分成3 個(gè)層次, 并確定優(yōu)先順序?yàn)槁湫聥D苷含有量＞芍藥苷含有量＞干膏得率, 構(gòu)建指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣[10], 結(jié)果見表2。然后, 通過AHP 分析軟件進(jìn)行具體計(jì)算, 測(cè)得落新婦苷含有量、 芍藥苷含有量、 干膏得率權(quán)重系數(shù)分別為0.558 4、 0.319 6、 0.122 0。 一致性比例因子（CR） = CI/RI, 當(dāng)CR＜0.1 時(shí), 指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣具有理想的一致性, 權(quán)重系數(shù)有效,本實(shí)驗(yàn)中CR 為0.017 6, 表明權(quán)重計(jì)算正確。 再將表2 數(shù)據(jù)經(jīng)線性插值處理[指標(biāo)成分值= （實(shí)測(cè)值-最小值） / （最大值-最小值） ×100], 消除單位量綱后計(jì)算各指標(biāo)對(duì)比強(qiáng)度 （si）、 沖突性（δi）、 綜合權(quán)重 （ci）、 權(quán)重 （ωi）[11-12], 結(jié)果見表3。

表2 指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣Tab.2 Judgement priority matrices for the pair comparison of indices

綜合AHP 法和CRITIC 法, 根據(jù)公式ω （綜）ij=ω （ AHP ）ij× ω （ CRITIC）ij/∑ω （ AHP ）ij×ω （CRITIC）ij, 得到落新婦苷含有量、 芍藥苷含有量、 干膏得率綜合權(quán)重分別為0.503 5、 0.400 9、0.095 6。

表3 相關(guān)計(jì)算數(shù)據(jù)Tab.3 Relevant calculation data

2.5 正交試驗(yàn) 按L9（34） 正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn), 加權(quán)評(píng)分法設(shè)定落新婦苷、 芍藥苷含有量和干膏得率的加權(quán)系數(shù)分別為0.5、 0.4、 0.1, 綜合評(píng)分=（落新婦苷含有量/最大值×0.5+芍藥苷含有量/最大值×0.4+干膏得率/最大值×0.1） ×100。 結(jié)果見表4, 方差分析見表5。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

由表4 可知, 各因素影響程度依次為B＞C＞A；由表5 可知, 因素B 有顯著影響（P＜0.05）, 而因素A、 C 無顯著影響（P＞0.05）。 從生產(chǎn)實(shí)際、 節(jié)約成本角度考慮, 確定最優(yōu)工藝為A1B3C1, 即加8倍量水提取3 次, 每次1 h。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方比例稱取藥材, 以優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn), 結(jié)果見表6, 可知工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 提取工藝選擇 痛風(fēng)泰顆粒由7 味藥材組成,以水溶性成分為主, 如秦艽主要含有環(huán)烯醚萜苷類[13], 山茱萸主要含有熊果酸、 馬錢苷、 總多糖、有機(jī)酸等[14]。 考慮到各成分溶解性能和生產(chǎn)成本,本實(shí)驗(yàn)選擇水煎煮提取。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.6 Results of verification tests （n=3）

3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)與權(quán)重選擇 痛風(fēng)泰顆粒中君藥山慈菇有清熱解毒、 消腫散結(jié)之功效, 其主要藥效成分秋水仙堿對(duì)痛風(fēng)有特效, 但不良反應(yīng)及副作用大[15], 結(jié)合該藥材在全方中所占比例及該成分在該藥材中含有量, 未將其作為評(píng)價(jià)指標(biāo), 為本實(shí)驗(yàn)不足之處, 會(huì)在后續(xù)制劑標(biāo)準(zhǔn)研究中加以改進(jìn)。 本實(shí)驗(yàn)以土茯苓中落新婦苷含有量, 赤芍中芍藥苷含有量、 干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo), 與2015 年版《中國藥典》 藥材標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)指標(biāo)成分一致, 有利于從原料到制劑的全面控制, 保證臨床用藥安全性和有效性。

權(quán)重系數(shù)確定的方法有專家打分法、 主成分分析法、 模糊綜合評(píng)價(jià)法、 層次分析法、 CRITIC 法等[16-17], 其中前4 種方法主觀性較強(qiáng), 而CRITIC法能體現(xiàn)客觀數(shù)據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)首先采用AHP 法量化評(píng)價(jià)指標(biāo)間比較判斷的優(yōu)先信息, 得到主觀權(quán)重系數(shù), 再采用CRITIC 法, 以評(píng)價(jià)指標(biāo)間的對(duì)比強(qiáng)度及沖突性為基礎(chǔ), 得到客觀權(quán)重系數(shù), 該方法既注重客觀性, 又不失主觀性。

3.3 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)首先選擇甲醇-0.1%冰醋酸（39 ∶61） 流動(dòng)相, 結(jié)果只能分離出落新婦苷； 再選擇乙腈-0.1% 磷酸 （14 ∶ 86） 流動(dòng)相[18-19], 發(fā)現(xiàn)能同時(shí)分離出芍藥苷和落新婦苷。然后, 通過增加乙腈比例、 調(diào)整柱溫和體積流量、更換色譜柱, 解決了落新婦苷峰形差、 出峰時(shí)間長等問題, 并提高了芍藥苷分離度。 2015 年版《中國藥典》 分別采用291、 230 nm 波長對(duì)落新婦苷、芍藥苷進(jìn)行檢測(cè), 本實(shí)驗(yàn)為了避免波長切換, 簡(jiǎn)化方法, 在結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上考察230 nm 波長處落新婦苷出峰情況[20], 發(fā)現(xiàn)其色譜峰有良好的響應(yīng)值, 方法確切可行, 故選擇該波長同時(shí)檢測(cè)落新婦苷和芍藥苷。