鎘銅復(fù)合污染土壤中南方紅豆杉的重金屬提取效果及根際細(xì)菌群落特征

魏 帥，Wolde Tefera Beri，王潤澤，林 之，謝若瀚，喬亞蓓，盧玲麗，田生科

（浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院污染環(huán)境修復(fù)與生態(tài)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

土壤重金屬污染是我國乃至世界上最嚴(yán)峻的環(huán)境問題之一[1]。2014年原國家環(huán)境保護(hù)部和原國土資源部聯(lián)合開展的全國土壤污染狀況調(diào)查公告顯示，我國土壤重金屬超標(biāo)率占全部超標(biāo)點(diǎn)位的82.8%[2]。結(jié)合我國當(dāng)前人多地少的基本國情，對(duì)大面積重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)工作顯得尤為迫切。近年來，植物修復(fù)技術(shù)因具有安全可靠、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)已逐漸成為修復(fù)重金屬污染土壤的有效途徑[3]，其主要利用植物及根系微生物群落吸附土壤中的污染物，通過植物提取、植物穩(wěn)定、植物降解等途徑達(dá)到修復(fù)土壤的效果[3-4]。

對(duì)于受到重金屬污染的土壤，植物提取是一種最有效的植物修復(fù)方式[5]，可用來提取重金屬的植物主要包括一些重金屬高耐性木本植物和超積累植物[6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的重金屬超積累植物大多存在生物量小、存活率差、生長速度緩慢、生長區(qū)域性等局限，導(dǎo)致其修復(fù)效果難以保證，難以在野外大規(guī)模推廣，極大限制了其廣泛應(yīng)用[6]。與超積累植物相比，重金屬高耐性木本植物具有適應(yīng)性強(qiáng)、生物量大、生長速度快、修復(fù)效果穩(wěn)定等明顯優(yōu)勢(shì)，已有國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明[7]，木本植物對(duì)多種重金屬的提取效果與Zn/Cd超積累作物擬南芥及遏藍(lán)菜相當(dāng)，且可用于能源生產(chǎn)，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益[8]。然而，目前的研究僅限于柳樹、楊樹這兩個(gè)樹種，優(yōu)質(zhì)的修復(fù)木本植物資源相對(duì)匱乏，繼續(xù)篩選高效的修復(fù)植物且能兼顧經(jīng)濟(jì)效益對(duì)于重金屬污染土壤的修復(fù)與利用具有重要意義。

南方紅豆杉是一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的木本植物，其莖、葉、枝、果實(shí)、心木、皮均可入藥，樹皮更是可以提取高效抗癌物質(zhì)——紫杉醇[9]。有研究報(bào)道，南方紅豆杉對(duì)于重金屬有良好的修復(fù)效果[10]。鑒于目前我國土壤重金屬污染土地面積巨大，加之南方紅豆杉相較于柳樹等其他木本植物具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高、根系更發(fā)達(dá)等優(yōu)勢(shì)，若能探明南方紅豆杉對(duì)污染土壤重金屬積累特征，挖掘并拓展其在污染環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，則有望為重金屬污染土壤的經(jīng)濟(jì)利用提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。

定殖于植物根際的微生物在植物修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[11]。此類微生物通常具有金屬耐受性，并可以通過以下幾種機(jī)制促進(jìn)污染土壤中植物的生長：誘導(dǎo)毛狀根的形成，進(jìn)而增加根表面積；對(duì)土壤中金屬離子的活化作用，促進(jìn)植物對(duì)金屬離子的吸收；產(chǎn)生一些植物激素或植物可利用的代謝物，促進(jìn)植物生長[12]。且大部分樹種根系與土壤微生物可以形成其根際特殊環(huán)境，從而起到植物-微生物聯(lián)合作用的效果[13]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，柳樹等木本植物對(duì)于土壤重金屬的耐性和吸收與根際微生物有密切的聯(lián)系。有研究[14]從重金屬Zn/Cd污染土壤上種植的柳樹根際分離了44個(gè)根際菌株，通過培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌對(duì)于Zn/Cd均具有抗性，且主要與1-氨基環(huán)丙基-1-羧酸脫氨酶（ACCD）、吲哚乙酸以及鐵載體的產(chǎn)生過程相關(guān)，此類物質(zhì)被報(bào)道都與重金屬的解毒、活化過程有密切聯(lián)系[15-17]。還有研究[18]將3種柳樹品種種植于受重金屬污染的垃圾填埋場，并于種植后4個(gè)月和16個(gè)月對(duì)根際真菌和細(xì)菌群落、土壤理化性質(zhì)、植物含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明柳樹對(duì)于Zn的積累與根際細(xì)菌、真菌具有顯著的相關(guān)性。可見，木本植物的根際細(xì)菌在植物對(duì)重金屬的耐性和吸收方面發(fā)揮著重要作用。然而，以往的研究多局限于實(shí)驗(yàn)室研究，在試驗(yàn)大田修復(fù)實(shí)踐中的探究很少，且大部分研究集中在柳樹、楊樹等植物上，對(duì)于具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的木本植物根際微生物的研究更是十分匱乏。

綜上，本文以高經(jīng)濟(jì)價(jià)值木本植物南方紅豆杉（Taxus wallichiana var.mairei）為研究材料，通過田間試驗(yàn)，探究了南方紅豆杉在Cd/Cu復(fù)合重金屬污染中高價(jià)值部位的重金屬含量，并采用高通量測(cè)序手段探究了重金屬復(fù)合污染條件下南方紅豆杉根際、非根際土壤的細(xì)菌群落特征。旨在為重金屬污染土壤的充分利用尋找新型高價(jià)值植物，并為其在重金屬污染土壤上的利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)基地位于浙江省臨安市白果縣河橋鎮(zhèn)學(xué)川村土壤修復(fù)試驗(yàn)基地（30°04′55.4″N，119°02′56.4″E），氣候條件屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。

試驗(yàn)材料為南方紅豆杉。供試土壤的理化性質(zhì)如下：土壤 pH 5.90，有機(jī)質(zhì)含量 25.25 g·kg-1，容重1.27 g·cm-3，土壤全量 Cd 含量 3.63 mg·kg-1，有效態(tài)Cd含量 0.59 mg·kg-1，土壤全量 Cu含量 71.13 mg·kg-1，有效態(tài)Cu含量29.45 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)方法

于2016年3月將南方紅豆杉苗均勻隨機(jī)地種植于重金屬修復(fù)示范區(qū)內(nèi)，定時(shí)澆水，2018年3月進(jìn)行土壤、植物取樣。

1.2.1 樣品采集及元素測(cè)定

挖出植物的部分根系，抖落根系上附著的土壤，仍舊黏附在根表的土壤連同根系浸泡于50 mL無菌磷酸鹽緩沖液中（PBS），洗脫下的土壤作為根際土壤，選擇遠(yuǎn)離植物根系的區(qū)域作為非根際土壤。所有樣品儲(chǔ)存于-80℃冰箱中用于DNA提取。同時(shí)將部分根際土和非根際土樣品風(fēng)干，用于測(cè)定重金屬含量。稱取0.1 g土壤樣品，加入5 mL HNO3+1 mL HClO4+1 mL HF于密閉的聚四氟乙烯罐中，180℃消煮12 h，用于土壤重金屬總量的測(cè)定。土壤重金屬有效態(tài)含量采用DTPA-TEA溶液浸提法，水土比為3∶1，具體方法參照土壤農(nóng)化分析[19]；使用pH計(jì)測(cè)定土壤/水溶液混合物（土水比為1∶5）中的土壤pH值。

分別采集南方紅豆杉根、莖、葉和樹皮。用自來水沖洗干凈后用去離子水清洗，65℃烘干至恒質(zhì)量，稱取0.1 g植物樣品，加入5 mL HNO3和1 mL H2O2于180℃消煮8 h，用于測(cè)定南方紅豆杉各部位的重金屬含量。

土壤和植物消煮液根據(jù)儀器測(cè)定要求先進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋，然后采用ICP-MS（Agilent 7500a）測(cè)定，分別使用土壤（GBW 07429）和標(biāo)準(zhǔn)米粉（IRMM-804）參照物進(jìn)行質(zhì)量控制。土壤重金屬有效態(tài)浸提液采用ICP-OES（Agailent 7500a）測(cè)定。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，采用Origin 8.5進(jìn)行繪圖。

1.2.2 土壤DNA提取

每個(gè)處理取土壤0.5 g，使用德國QIAGEN公司的土壤試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）進(jìn)行土壤DNA的提取，步驟依據(jù)廠家試劑盒的使用說明。用分光光度計(jì)（SmartSpec?Plus，Bio-Rad）測(cè)定DNA的濃度和質(zhì)量（A260/A280比值）。

1.2.3 16S測(cè)序數(shù)據(jù)分析和處理

使用FLASH軟件對(duì)16S rRNA序列進(jìn)行拼接后，通過 QIIME（Version 1.9.0）進(jìn)行后續(xù)分析[20]，使用USEARCH工具去除嵌合體序列。將得到的高質(zhì)量有效序列采用UCLUST方法聚類成可操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）。使用97% 的識(shí)別閾值，將OTU代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫（13_8_release）比對(duì)，完成對(duì)物種的注釋[21]。

在QIIME（Version 1.9.0）平臺(tái)中計(jì)算α-多樣性。α-多樣性通過Shannon指數(shù)、Oberved species可觀測(cè)物種數(shù)目指數(shù)、PD_Whloe_tree指數(shù)、Chao 1指數(shù)來評(píng)估，通過Origin 8.5進(jìn)行繪圖。β-多樣性基于樣品間的Bray-Curtis（布雷-柯蒂斯）距離進(jìn)行計(jì)算。通過R軟件（Version 3.5.1）“ape”包中的“pcoa”功能對(duì)紅豆杉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），基于Bray-Curtis距離進(jìn)行樣品間的相似度分析。使用R軟件“l(fā)imma”包中的“edgeR”函數(shù)進(jìn)行根際區(qū)間之間差異細(xì)菌的挑選，使用“ggplot2”完成對(duì)差異細(xì)菌火山圖的繪制。在 http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/網(wǎng)站上進(jìn)行最小判別分析（Least discriminant analysis，LDA）以確定根際和非根際區(qū)間中的顯著差異種屬（屬水平）[22]。

使用 PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）進(jìn)行紅豆杉不同根際區(qū)間細(xì)菌功能的預(yù)測(cè)[23]。首先使用在QIIME中的pick_closed_reference_otus.py腳本，以Greengenes（13_5_release）替換 Greengenes數(shù)據(jù)庫（13_8_release）作為參考數(shù)據(jù)庫，使用97%的識(shí)別閾值，重新生成的OTU table在http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy網(wǎng)站PICRUSt功能模塊進(jìn)行Normalize By Copy Number，將得到的結(jié)果進(jìn)行Predict Metagenome，得到KEGG通路3個(gè)層級(jí)分類，并計(jì)算出預(yù)測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)NSTI值。利用STAMP軟件進(jìn)行紅豆杉根際區(qū)間之間差異功能的篩選并完成繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 南方紅豆杉不同部位Cd、Cu含量特征

南方紅豆杉根中Cd含量顯著高于葉片、樹皮和莖，達(dá)到 18.4 mg·kg-1，葉片、樹皮、莖中的Cd含量均低于5 mg·kg-1（圖1A）。根部是Cu含量最高的部位，達(dá)到36.01 mg·kg-1，顯著高于地上部葉片、樹皮和莖，葉片是Cu含量最低的部位，僅為6.24 mg·kg-1（圖1B）。結(jié)果表明重度復(fù)合污染土壤沒有降低南方紅豆杉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

圖1 南方紅豆杉不同部位Cd和Cu的濃度Figure 1 The Cd and Cu concentrations in different tissues of Taxus wallichiana var.mairei

2.2 南方紅豆杉根際土壤中Cd、Cu生物有效性變化

由圖2A可知，南方紅豆杉根際土壤總Cd含量為2.95 mg·kg-1，與非根際土壤相比下降了18.8%。南方紅豆杉的種植同樣顯著降低了根際土壤Cu含量，與非根際土壤相比，根際土壤Cu含量降低了39.19 mg·kg-1。進(jìn)一步測(cè)定了南方紅豆杉根際與非根際土壤重金屬有效態(tài)含量。由圖2B和圖2C可知，與非根際土壤相比，南方紅豆杉的種植使根際土壤Cd、Cu有效態(tài)含量分別顯著降低0.17、16.67 mg·kg-1。上述結(jié)果表明，南方紅豆杉對(duì)于根際土壤Cd、Cu的萃取效果明顯。

圖2 南方紅豆杉根際與非根際土壤重金屬含量Figure 2 The heavy metal concentrations of Taxus wallichiana var.mairei in rhizosphere and bulk soil

2.3 南方紅豆杉細(xì)菌群落多樣性和群落特征

2.3.1 細(xì)菌多樣性

2.3.1.1 α-多樣性

α-多樣性指群落內(nèi)的物種豐度和均勻度。Chao1指數(shù)用來估計(jì)群落中含OTU數(shù)目，物種數(shù)目（Obereved specices）則表明實(shí)際測(cè)量出的OTU數(shù)目，PD_whole_tree指數(shù)表征觀察的種屬數(shù)，香農(nóng)指數(shù)（Shannon）用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)。將南方紅豆杉根際和非根際區(qū)間細(xì)菌群落的α-多樣性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)根際和非根際的α-多樣性差異顯著，Shannon、Chao 1、Obereved specices、PD_whole_tree 4個(gè)指數(shù)分別平均降低18.4%、17.2%、24.9%、16.7%。以上結(jié)果表明南方紅豆杉的種植顯著降低了根際區(qū)間的豐富度和均勻度（圖3）。

2.3.1.2 β-多樣性

由圖4可知，南方紅豆杉根際與非根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的PCoA分析（圖4A）和基于布雷-柯蒂斯相似度的聚類分析（圖4B）結(jié)果表明：根際和非根際之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。PCoA分析顯示，第一坐標(biāo)軸的差異是由取樣區(qū)間造成，即根系是群落變異的最大來源（32.6%）。

2.3.2 群落特征

2.3.2.1 優(yōu)勢(shì)菌群組成

圖3 南方紅豆杉根際和非根際土壤細(xì)菌群落α-多樣性的箱型圖Figure 3 Box plots of α-diversity indices of the bacteria communities of Taxus wallichiana var.mairei in rhizosphere and bulk soils

圖4 南方紅豆杉根際和非根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Figure 4 The bacteria community composition of Taxus wallichiana var.mairei in rhizosphere and bulk soils

通過對(duì)南方紅豆杉根際和非根際的豐度大于0.5%OTU進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)（圖5A），發(fā)現(xiàn)根際和非根際分別富集了大量特異細(xì)菌物種。根際和非根際區(qū)間的優(yōu)勢(shì)菌豐度在門水平上（變形菌Proteobacteria在綱水平上表示）有著顯著的差異。與非根際區(qū)間相比，根際區(qū)間酸桿菌門Acidobacteria、δ-變形菌綱Deltaproteobacteria明顯下降，α-變形菌綱Alphaproteobacteria、β-變形菌綱Betaproteobacteria、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、綠灣菌門Firmicutes豐度明顯上升（圖5B）。結(jié)果表明南方紅豆杉的種植使得根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群組成發(fā)生明顯改變。

2.3.2.2 根際特異細(xì)菌

LDA分析用來挖掘南方紅豆杉根際主要判別類群（圖6A）。與非根際土壤相比，南方紅豆杉的根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成明顯不同，南方紅豆杉根際Alphaproteobacteria綱（Sphingobium、Kaistobacter）、Betaproteobacteria綱（Oxalobacteraceae、Comamonadaceae）、Gammaproteobacteria綱（Acinetobacter）和Bacteroidetes門（Sphingobacteriaceae）尤為豐富（圖6A），這些菌屬在南方紅豆杉根際土壤中的平均豐度是在非根際區(qū)間中的數(shù)倍（圖6B），其中Betaproteobacteria綱Oxalobacteraceae在南方紅豆杉根際細(xì)菌群落組成中占比最大（3.74%），其豐度是非根際的2.61倍（圖6B）。

圖5 南方紅豆杉根際和非根際土壤細(xì)菌群落的差異菌種Figure 5 Differences in bacterial communities between rhizosphere and bulk soils of Taxus wallichiana var.mairei

2.3.3 功能預(yù)測(cè)

PICRUSt用來預(yù)測(cè)南方紅豆杉根際與非根際細(xì)菌群落的基因功能，并通過NSTI值（The nearest sequenced taxon index）評(píng)價(jià)其預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究所有土壤樣品的NSTI值列于表1，范圍在0.109～0.201之間。多數(shù)樣品的NSTI值低于之前報(bào)道過的土壤樣本的參考值0.17。與非根際土壤相比較，南方紅豆杉根際中與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、谷胱甘肽代謝、賴氨酸降解、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）、磷酸鹽及次磷酸鹽代謝相關(guān)的功能基因相對(duì)豐度較高（圖7）。

3 討論

紫杉醇的提取部位主要為紅豆杉的皮、莖、葉[24]。在本研究中，南方紅豆杉Cd、Cu含量最高的部位均為根部，其葉片、樹皮、莖部Cd含量分別為根部的6%、24.8%、5.5%。Cu含量也呈現(xiàn)出類似的現(xiàn)象，葉片、樹皮、莖Cu含量分別是根部的17.3%、30.7%、25.2%（圖1）。廖啟林等[25]在Cd濃度為4.67 mg·kg-1的土壤上種植的蘇柳795，其樹根、樹皮、莖、葉的Cd含量分別為 7.19、13.4、13.4、14.0 mg·kg-1，與本研究土壤總 Cd濃度相差不大的情況下，南方紅豆杉表現(xiàn)出了明顯的地上部Cd低積累特征。目前將植物對(duì)重金屬的吸收機(jī)制分為3類，即富集型（Accumulation）、根部囤積型（Root comparments）、規(guī)避型（Excluders）[26]。其中根部囤積型可將重金屬囤積于根部，僅有少量向地上部轉(zhuǎn)移，減少對(duì)光合、呼吸、生殖系統(tǒng)的傷害。南方紅豆杉由根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的能力較弱，使得可用部分的重金屬含量遠(yuǎn)低于根部，在保證其具有良好提取效果的前提下沒有降低南方紅豆杉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。當(dāng)前針對(duì)中、重度重金屬污染土壤采取的處置方式主要為：停止農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)，利用工程物理技術(shù)、土壤化學(xué)淋洗或鈍化等治理模式進(jìn)行修復(fù)[27]。因此在本研究中，南方紅豆杉在重度復(fù)合污染土壤上表現(xiàn)出的金屬積累特征，為在重金屬污染土壤上紅豆杉的種植利用提供了重要的理論依據(jù)。

表1 評(píng)估PICRUSt準(zhǔn)確性的NSTI值Table 1 The Nearest Sequenced Taxon Index（NSTI）score of each sample to evaluate the accuracy of PICRUSt

圖6 南方紅豆杉根際特異細(xì)菌種類Figure 6 Special taxa from the rhizosphere compartment of Taxus wallichiana var.mairei

圖7 PICRUSt預(yù)測(cè)南方紅豆杉根際與非根際區(qū)間的關(guān)鍵功能基因差異表達(dá)Figure 7 The difference relative abundance of key functional gene families between rhizosphere and bulk soils predicted by PICRUSt

在本研究中，供試土壤的Cd含量為3.63 mg·kg-1，Cu含量為 82.21 mg·kg-1，根據(jù)我國土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其分別達(dá)到了國家三級(jí)和二級(jí)污染標(biāo)準(zhǔn)[28]，屬于Cd重度、Cu輕度復(fù)合污染土壤。南方紅豆杉對(duì)根際土壤重金屬含量的降低效果顯著（圖2）。南方紅豆杉種植兩年后，根際土壤總Cd、Cu含量及有效態(tài)含量較非根際土壤均顯著降低（圖2）。鑒于我國土壤重金屬污染土地面積巨大，且多以復(fù)合污染為主[2]，南方紅豆杉對(duì)根際土壤重金屬濃度的降低效果使其具有巨大的修復(fù)應(yīng)用潛力。

木本植物種植和根系生長所引起的根際細(xì)菌群落變化已被多次報(bào)道[14-17]。根際特殊環(huán)境所塑造的細(xì)菌群體在土壤-植物根土界面系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用[29]。根際環(huán)境的特異性改變導(dǎo)致特定的根際細(xì)菌群落演替，而特定的根際細(xì)菌群落不僅可以通過化學(xué)轉(zhuǎn)化、螯合和土壤pH值降低引起的質(zhì)子化、螯合物的釋放或氧化還原變化等過程導(dǎo)致金屬的活化[29]，還可通過由細(xì)菌等介導(dǎo)的生物沉淀或生物吸附從而降低根際重金屬的有效性[30-31]。因此本研究使用高通量測(cè)序的方法來探究可能影響南方紅豆杉對(duì)重金屬吸收積累的根際細(xì)菌群落。在本研究中，南方紅豆杉的根系生長顯著降低了根際區(qū)域的細(xì)菌多樣性，這是種屬豐富度和均勻度共同降低的結(jié)果[32]。無論是均勻度還是多樣性，根際細(xì)菌α-多樣性都顯著低于非根際（圖3）。植物根際對(duì)于定殖在其周圍的微生物具有一定的選擇性，會(huì)改變物種的豐富度，減少種屬的均勻度，從而導(dǎo)致α-多樣性參數(shù)值的下降[33]。利用PCoA和Bray-Curtis相似度的聚類分析分別將樣品間差異降維為二維空間距離和分類差異，研究結(jié)果表明：南方紅豆杉的根際和非根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，取樣區(qū)間是造成群落差異的最大變異來源（圖4）。這可能是植物根系分泌物介導(dǎo)植物根系與根際微生物群落之間的相互作用造成的[34]。植物根際會(huì)分泌大量的可溶性糖、氨基酸或次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)會(huì)被根際細(xì)菌所利用[35]，使得能夠利用根際分泌物的細(xì)菌豐度得到一定的提高（圖5A），導(dǎo)致根際和非根際的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大差異。

本研究發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉根際和非根際區(qū)間細(xì)菌群落組成有著較大的差異（圖5B），通過LDA分析發(fā)現(xiàn)，在南方紅豆杉的根際特異富集了一些特異細(xì)菌，包括 Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Bacteroidetes門的一些屬（圖6A），這些細(xì)菌已被鑒定為對(duì)植物具有促生作用，如Gammaproteobacteria綱的Acinetobacter已被報(bào)道為植物促生菌，能夠分泌吲哚乙酸和鐵載體，可參與根際重金屬活化以及改善植物對(duì)營養(yǎng)元素的吸收[36-37]。Gammaproteobacteria綱的Enterobacteriaceae和Alphaproteobacteria綱的Sphingobium被多次報(bào)道具有分泌鐵載體的能力，在活化根際重金屬過程中發(fā)揮重要作用[37]。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉根際募集的多種促生菌中，以抗病菌種類居多，如Betaproteobacteria綱的 Oxalobacteraceae、Comamonadaceae，Alphaproteobacteria綱的Kaistobacter以及Bacteroidetes門的Sphingobacteriaceae均具有抑制真菌生長，保護(hù)植物根系免受真菌感染的作用[38-40]，該類細(xì)菌的高效定殖是由于南方紅豆杉在遭受重金屬脅迫時(shí)根系較脆弱，其易遭受病原菌或真菌感染，因此誘導(dǎo)根際特異富集此類具有抗病作用的細(xì)菌。而非根際只募集了少數(shù)Deltaproteobacteria綱和Acidobacteria門的一些屬。

PICRUSt分析使我們進(jìn)一步預(yù)測(cè)了根際細(xì)菌群落的基因功能。南方紅豆杉根際與非根際相比，氨基酸（賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸）代謝基因豐度顯著提升（圖7），這可能跟植物根系分泌物、脫落物、代謝物等引起的根際有機(jī)物質(zhì)增多有關(guān)[40]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在南方紅豆杉根際中顯著表達(dá)（圖7）。有研究表明，微生物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在抵抗和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬方面發(fā)揮一些作用[41]。結(jié)合在南方紅豆杉根際募集的特異細(xì)菌，我們推測(cè)南方紅豆杉根際組裝的特異細(xì)菌群落可以在活化運(yùn)輸重金屬、分泌促生物質(zhì)及改善植物養(yǎng)分元素吸收、抵抗真菌及病原菌入侵等方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)然這些預(yù)測(cè)的初步結(jié)果還應(yīng)該通過宏基因組等方法進(jìn)一步驗(yàn)證，以更好地理解南方紅豆杉根際細(xì)菌群落的功能。

綜上，南方紅豆杉的種植可以顯著降低其根際的Cd和Cu含量，且南方紅豆杉高價(jià)值部位重金屬Cd和Cu含量偏低，分別是根部的24.8%和30.7%，說明重度復(fù)合污染土壤沒有降低南方紅豆杉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。南方紅豆杉能夠顯著改變重度復(fù)合污染土壤的細(xì)菌多樣性，根際和非根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。南方紅豆杉根際能特異募集一些重金屬活化菌及促生細(xì)菌，其中重金屬活化菌可能通過分泌鐵載體來活化根際重金屬，促進(jìn)根系對(duì)Cd和Cu的吸收，促生細(xì)菌則可能通過抵抗真菌入侵、改善植物根系對(duì)營養(yǎng)元素的吸收等方式實(shí)現(xiàn)其促生效果。

4 結(jié)論

（1）南方紅豆杉根部Cd和Cu的含量最高，樹皮次之；根際土壤中的Cd、Cu含量顯著降低。

（2）種植前后對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤細(xì)菌α-多樣性顯著降低，Shannon、Chao 1、Obereved specices、PD_whole_tree指數(shù)分別平均降低18.4%、17.2%、24.9%、16.7%；根際與非根際之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，根系是細(xì)菌群落變異的最大來源（32.6%）。

（3）與非根際土壤相比，南方紅豆杉的根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成明顯不同，南方紅豆杉根際Alphaproteobacteria綱（Sphingobium、Kaistobacter）、Betaproteobacteria 綱（Oxalobacteraceae、Comamonadaceae）、Gammaproteobacteria綱（Acinetobacter）和Bacteroidetes門（Sphingobacteriaceae）尤為豐富。PICRUSt分析表明南方紅豆杉根際中有著豐度更高的與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸代謝、磷酸鹽代謝相關(guān)的預(yù)測(cè)功能基因。