熒光原位雜交技術(shù)在檢測自然流產(chǎn)組織染色體數(shù)目異常中的價值和意義

鄢 磊 張雪瑞 曹東華

（1 大連市婦幼保健院遺傳代謝實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連 116001； 2 大連市婦幼保健院遺傳代謝中心，遼寧 大連 116001）

流產(chǎn)是指孕婦懷孕不足28周、胎兒體質(zhì)量低于1 kg而導(dǎo)致妊娠過程終止，在產(chǎn)科中極為常見。自然流產(chǎn)，是指在多種共同病因影響下未采用人工方式而導(dǎo)致妊娠終止的流產(chǎn)，占流產(chǎn)的10%～15%[1]，自然流產(chǎn)的病因復(fù)雜，但半數(shù)以上的自然流產(chǎn)均為胚胎染色體異常，其他還有母體免疫因素、宮內(nèi)感染等等。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是采用非射性技術(shù)對流產(chǎn)所分泌出的組織進(jìn)行DNA的定性、定量或相對定位分析，其具有操作簡便、分析快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，能為自然流產(chǎn)的病因的診斷提供較為準(zhǔn)確的理論依據(jù)[2]。本院自2014年開展熒光原位雜交技術(shù)以來，取得不俗的效果，現(xiàn)將其應(yīng)用過程報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2014年1月至2017年12月在我院自然流產(chǎn)檢查的240例絨毛組織。孕婦年齡范圍為18～44歲，平均年齡（28.3±3.5）歲；年齡大于35歲孕婦有98例，年齡小于35歲孕婦有142例；流產(chǎn)次數(shù)在3次（包含3次）以上者80例，流產(chǎn)次數(shù)在3次以下者有160例。本次研究內(nèi)容均告知孕婦及家屬，取得其同意后進(jìn)行。

1.2 方法：①標(biāo)本收集及處理：取待檢對象的絨毛組織，去除蛻膜、血塊等雜質(zhì)后，剪碎后進(jìn)行離心，60%冰乙酸用力吹打1min消化，去掉上清液以后進(jìn)行滴片（去除上清液以后須加一定量的固定液方便滴片），滴片完成于室溫下保存24 h方進(jìn)行下一步操作。②玻片預(yù)處理及變性雜交：室溫下將玻片置于中性SSC溶液中進(jìn)行漂洗，時長為5 min，其后采用胃蛋白酶進(jìn)行消化，并再次將玻片置于中性SSC溶液中進(jìn)行漂洗；其后按照70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇的順序?qū)⒉ＦM(jìn)行脫水（時長均為3 min），其后10 μL探針混合物滴加于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊；雜交儀共變性，共變性條件：75 ℃，5min，雜交條件：42 ℃，16 h。③共變性后處理及檢測：上述處理完成后，將載玻片上的蓋玻片移出，其后放入46 ℃的生理鹽水水浴鍋中將玻片進(jìn)行漂洗，漂洗時長為10 min，漂洗過程中注意對玻片進(jìn)行振蕩；上述步驟完成后將玻片置于46 ℃水浴鍋（水浴鍋為0.1% NP-40/2×SSC溶液）進(jìn)行漂洗，漂洗時長為10 min，漂洗過程中注意對玻片進(jìn)行振蕩；上述步驟完成后將玻片置于70%乙醇中進(jìn)行漂洗，漂洗時長為5 min。其后取出玻片將玻片進(jìn)行風(fēng)干；玻片風(fēng)干后，將15 μL DAPI 復(fù)染劑加至目標(biāo)區(qū)域，立即蓋上蓋玻片，暗處放置10～20 min后觀察組織的染色體情況。④試劑：本次選用的FISH試劑盒為金菩嘉試劑盒，購于北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司（國食藥監(jiān)械字2012第3400283號），主要包括GLP13/GLP21（綠/紅標(biāo)記）、GLP16/GLP22（紅/綠標(biāo)記）、CSP18/CSP X/CSP Y（藍(lán)/綠/紅標(biāo)記）。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)：所選取的樣本中，其細(xì)胞計數(shù)須大于100個，當(dāng)檢測到異常多于60%時即視為陽性，低于10%視為陰性，在10%～60%為嵌合體。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：本次研究所有數(shù)據(jù)的處理均采用SPSS20.0處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。組內(nèi)不同時間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。計數(shù)資料用頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在240例自然流產(chǎn)的絨毛組織中，檢出染色體異常共計110例，異常率為45.83%。異常分布類型見表1。在高齡妊娠和非高齡妊娠孕婦中，異常率比較無差異（P＞0.05）。見表2。在反復(fù)流產(chǎn)與非反復(fù)流產(chǎn)孕婦中，其異常率比較無差異（P＞0.05）。見表3。

3 討 論

隨著生活模式的轉(zhuǎn)變，近年來，流產(chǎn)率尤其是自然流產(chǎn)人數(shù)，越來越高。導(dǎo)致自然流產(chǎn)的原因是多種多樣的，包括免疫因素、感染、內(nèi)分泌異常以及其他未知因素，但最為重要的仍然是染色體異常[3]。染色體異常又以13、18、21、X和Y染色體異常占多。絨毛細(xì)胞為在胎盤和子宮壁之間的接觸面上，密生的指狀或樹枝狀小突起的細(xì)胞團(tuán)，其與胎兒具有相同的染色體類型，因此絨毛組織是對胎兒染色體異常進(jìn)行診斷的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 FISH檢測結(jié)果分布

表2 高齡孕婦與非高齡孕婦異常率比較

表3 反復(fù)流產(chǎn)孕婦與非反復(fù)流產(chǎn)孕婦異常率比較

絨毛組織通常在自然流產(chǎn)胎兒停止發(fā)育后由陰道娩出，因此絨毛組織常常被污染，對于普通方法提取絨毛組織染色體而言具有難度且易被干擾。FISH是一種能夠快速檢測組織染色體的技術(shù)，其主要原理為通過熒光素將特制的染色體探針進(jìn)行標(biāo)記，這些探針特異性識別染色體并與之結(jié)合，結(jié)合后這些熒光素能將染色體顯影出來，對于染色體數(shù)目異常具有良好的診斷效果[4]。本次發(fā)現(xiàn)，對240例絨毛組織顯影發(fā)現(xiàn)，有110例絨毛組織出現(xiàn)了異常，異常率為45.83%，與以往文獻(xiàn)報道相差不大[5]，同時在這些異常中16-三體、X單體異常所占比例最多。

本次研究還比較了高齡孕婦（大于35歲）與多次流產(chǎn)（3次以上）的異常率，發(fā)現(xiàn)高齡孕婦與非高齡孕婦之間的異常率并無差異，而多次流產(chǎn)與非多次流產(chǎn)孕婦之間異常率也無差異。提示孕婦自然流產(chǎn)次數(shù)、孕婦年齡與胚胎染色體異常的發(fā)生率無明顯相關(guān)性。

綜上所述，熒光原位雜交技術(shù)在對由染色體異常導(dǎo)致的自然流產(chǎn)的檢測中，具有準(zhǔn)確度高、操作簡便等特點(diǎn)，能為快速診斷自然流產(chǎn)的病因提供準(zhǔn)確的理論依據(jù)。