miRNA-613靶向VEGFA 調(diào)控乳腺癌細胞吉西他濱耐藥性的機制研究

劉黎，董華瓊，張匠，毛英，田婕麗，夏璐

遂寧市中心醫(yī)院腫瘤中心，四川 遂寧 629000

化療是目前乳腺癌患者最重要的治療方法之一，尤其是吉西他濱（gemcitabine，GCB）聯(lián)合紫杉醇或順鉑在晚期乳腺癌一線治療中占主導地位[1]，但腫瘤耐藥一直是腫瘤患者治療失敗及預后不良最關(guān)鍵且亟待解決的難題之一，因此，尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的分子靶點對臨床個體化治療十分重要。近幾年，微小RNA（microRNA，miRNA）是包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病領域的研究熱點。目前大量的研究已經(jīng)證實多種miRNA不但具有細胞特異性，而且可以通過特定的方式參與調(diào)控乳腺癌細胞的化療耐藥性[2-4]。Rhodes等[5]曾采用生物信息學技術(shù)證實miRNA-613在MCF-7化療耐藥細胞株中低表達，但并未對miRNA-613的調(diào)控機制進行深入研究。因此，尋找miRNA-613關(guān)鍵下游靶基因以探討其對乳腺癌化療耐藥的作用機制是本研究的主要目的。血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）作為誘導血管生成的主要調(diào)節(jié)因子，不僅與腫瘤細胞的侵襲、遷移及血管生成等有關(guān)[6]，而且有研究顯示其在調(diào)控腫瘤細胞化療藥物敏感性方面發(fā)揮重要的作用[7]。本研究通過建立GCB耐藥乳腺癌細胞株模型，探討miRNA-613對乳腺癌細胞株MDA-MB-231多藥耐藥的影響，并闡述其對下游靶基因VEGFA的調(diào)控機制，從而為逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞化療耐藥性的研究提供新的突破口，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。將細胞株接種至含10%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，2～3天傳代1次。

1.2 主要試劑

注射用GCB購自美國禮來制藥公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）細胞消化液購自美國Gibco公司；FBS和鏈霉素-青霉素雙抗購自美國Thermo Fisher公司；四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）、Trizol試劑、細胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司；mirPremier?miRNA分離試劑盒購自日本Takara公司；SYBR Green聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；報告基因載體pGL3空質(zhì)粒購自美國Promega公司；實驗用水為超純水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。miRNA-613模擬物（mimics）、陰性對照和PCR引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成和提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 人乳腺癌GCB耐藥細胞株的建立將MDA-MB-231細胞（1×107/ml）置于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；待融合率為40%～50%時，加入0.1 μmol/L的GCB；培養(yǎng)15～20天后，陸續(xù)采用終濃度為0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 μmol/L 的GCB進行培養(yǎng)，每隔2～3周加藥1次。最終獲得穩(wěn)定生長的耐藥細胞株MDA-MB-231/GCB，并在1.0 μmol/L GCB干預下對細胞進行長期培養(yǎng)，以維持其耐藥性。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將miRNA-613 mimics和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231/GCB細胞中，置于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光染色情況，判斷感染率。提取細胞RNA，驗證miRNA-613的表達情況及轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染成功后用1 μg/ml嘌呤霉素篩選2～3周，對嘌呤霉素耐藥的細胞用于miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染。細胞分組：未進行任何處理的MDAMB-231/GCB細胞組（CTL組）、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（NC組）和miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染組）。

1.3.3 MTT 法檢測不同濃度GCB條件下MDAMB-231/GCB細胞和MDA-MB-231細胞的增殖活性將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞和MDAMB-231/GCB細胞（1×104個/孔）分別單層接種至96孔板中，每組設置6個平行孔，分別加入0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L（終濃度）GCB 溶液。培養(yǎng)48 h后，加入MTT。孵育4 h后，置于450酶標儀上，檢測波長為570 nm處的光密度（optical density，OD）值，計算細胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（1-OD值受試組/OD值對照組）×100%。計算半數(shù)抑 制 濃 度（50%inhibition concentration，IC50）和MDA-MB-231/GCB細胞的耐藥指數(shù)（resistance index，RI）。 RI=IC50（MDA-MB-231/GCB）/IC50（MDA-MB-231）。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 劃痕實驗法分析MDA-MB-231/GCB細胞的遷移情況將對數(shù)生長期的MDA-MB-231/GCB細胞（1×105個/孔）單層接種至6孔板中，待細胞融合率為50%～60%時，棄去培養(yǎng)基，用1 ml藍色槍尖劃痕，記錄時間為W0h，加入含10%FBS和GCB（IC50=3.411 μmol/L）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h（W24h），置于倒置顯微鏡下觀察。采用愈合率對細胞的遷移活性進行量化評估，愈合率=（W0h-W24h）/W0h×100%。相同條件下，實驗重復 3次，取平均值。

1.3.5 膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法分析MDA-MB-231/GCB細胞的凋亡情況取CTL組、NC組和轉(zhuǎn)染組對數(shù)生長期的細胞，加入GCB（IC50=3.411 μmol/L）作用24 h后，收集細胞，洗滌3次后，以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速3000 r/min 離心 5 min，棄除上清液；加入 500 μl結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸，加入AnnexinⅤ5 μl，避光孵育 15 min；加入 PI 5 μl，避光孵育15 min。所有操作嚴格按照試劑盒說明書的步驟進行。采用流式細胞儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm）檢測3組細胞的凋亡情況。實驗重復3次，取平均值。

1.3.6 RNA 提取及實時熒光定量PCR檢測各組細胞miRNA-613的相對表達量采用Trizol法提取細胞總RNA。采用凝膠電泳檢測RNA的相對分子質(zhì)量，采用分光光度計檢測RNA濃度，采用mir-Premier?miRNA分離試劑盒分離miRNA，根據(jù)Super Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。按照PCR試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR檢測。冰浴中配制20 μl PCR反應體系，95℃ 10 min，95℃10 s，60℃30 s，循環(huán)45次。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫的資料設計PCR引物（表1）。根據(jù)實時熒光定量PCR儀使用說明書調(diào)整基線，將閾值設定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。以β-actin為內(nèi)參，ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機陰性對照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值），采用 2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物序列

1.3.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炌ㄟ^Target Scan、microrna和miRanda數(shù)據(jù)庫篩選靶基因，發(fā)現(xiàn)miRNA-613有VEGFA基因的結(jié)合位點，VEGFA基因可能是miRNA-613下游的靶基因。通過構(gòu)建含靶基因野生型或突變型3'端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）的熒光酶報告基因質(zhì)粒，檢測細胞內(nèi)源性miRNA-613對預測靶基因的抑制作用。方法如下：將VEGFA野生型或突變型3'-UTR序列插入熒光素酶報告基因載體pGL3的XbaⅠ和FseⅠ位點，構(gòu)建熒光素酶報告基因質(zhì)粒，制備感受態(tài)細胞。取對數(shù)生長期的人上皮細胞HEK293T細胞約5×105個，接種于6孔板中，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書操作步驟轉(zhuǎn)染miRNA-613 mimics，采用Promega GloMaxTM20/20發(fā)光檢測儀檢測熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231/GCB細胞增殖抑制率的比較

經(jīng)過6個月的誘導期，成功建立人乳腺癌細胞GCB耐藥細胞株MDA-MB-231/GCB，不同濃度（0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L）的 GCB 對MDA-MB-231細胞增殖抑制率均明顯高于MDAMB-231/GCB細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表2）。GCB對MDA-MB-231細胞和MDAMB-231/GCB細胞的IC50分別為1.772 μmol/L 和8.791 μmol/L。MDA-MB-231/GCB的RI為4.96。

表2 不同濃度的GCB條件下MDA-MB-231和MDA-MB-231/GCB細胞增殖抑制率的比較

2.2 3組細胞miRNA-613相對表達量的比較

miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前，MDA-MB-231/GCB細胞miRNA-613相對表達量為（0.37±0.12），低于MDA-MB-231細胞的（0.74±0.15），差異有統(tǒng)計學意義（t=5.448，P＜0.05）。miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細胞miRNA-613相對表達量為（1.47±0.18），高于 CTL組的（0.37±0.12）和NC組的（0.38±0.16），差異均有統(tǒng)計學意義（t=14.382、12.801，P＜0.05）（圖1）。

圖1 miRNA-613mimics 轉(zhuǎn)染后各組細胞miRNA-613的相對表達量

2.3 miRNA-613mimics轉(zhuǎn)染后3組細胞增殖抑制率的比較

miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，不同濃度（0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L）的GCB 條件下轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細胞的增殖抑制率高于CTL組細胞和NC組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。GCB對CTL組、NC組和轉(zhuǎn)染組細胞的IC50分別為8.791、8.817、3.411 μmol/L。

表3 不同濃度的GCB條件下3組細胞miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后增殖抑制率的比較

2.4 3組MDA-MB-231/GCB細胞遷移活性的比較

3.411 μmol/L的GCB分別作用于CTL組、NC組和轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細胞24 h后，其細胞愈合率分別為（60.73±11.35）%、（62.41±14.57）%和（27.28±7.83）%。轉(zhuǎn)染組細胞的遷移活性弱于CTL組和NC組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 劃痕實驗法檢測3組MDA-MB-231/GCB細胞的遷移活性

2.5 3組MDA-MB-231/GCB細胞凋亡情況的比較

3.411 μmol/L的GCB分別作用于CTL組、NC組和轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細胞24 h后，其細胞的凋亡率分別為（5.38±3.55）%、（5.97±3.26）%和（34.14±6.23）%。GCB對轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細胞凋亡的促進作用強于CTL組和NC組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=11.345、11.332，P＜0.05）（圖3）。

2.6 3組MDA-MB-231/GCB 細胞凋亡相關(guān)基因mRNA 相對表達量的比較

圖3 流式細胞儀檢測3組MDA-MB-231/GCB細胞的凋亡情況

3組MDA-MB-231/GCB細胞抗凋亡基因Bcl-2mRNA、Bcl-xLmRNA、BIMmRNA的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3組MDAMB-231/GCB細胞抗凋亡基因survivinmRNA、相關(guān)耐藥基因MDR1mRNA的相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F=15.769、55.627，P＜0.01），且轉(zhuǎn)染組細胞survivinmRNA、MDR1mRNA的相對表達量均低于CTL組細胞和NC組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表4）

表4 3組MDA-MB-231/GCB細胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達量的比較（±s）

表4 3組MDA-MB-231/GCB細胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達量的比較（±s）

注：a與CTL組比較，P<0.05；b與NC組比較，P<0.05

mRNACTL組NC組 轉(zhuǎn)染組Bcl-2 mRNA0.82±0.170.86±0.140.87±0.15 Bcl-xL mRNA0.74±0.130.71±0.150.73±0.11 BIM mRNA0.57±0.100.60±0.120.59±0.07 survivin mRNA1.14±0.281.10±0.230.54±0.20a b MDR1 mRNA2.26±0.452.18±0.370.56±0.24a b

2.7 MDA-MB-231/GCB細胞與MDA-MB-231細胞VEGFA mRNA 相對表達量的比較

miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前，MDA-MB-231/GCB細胞VEGFAmRNA的相對表達量為（1.97±0.28），高于MDA-MB-231細胞的（1.02±0.24），差異有統(tǒng)計學意義（t=7.286，P＜0.05）。miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細胞VEGFAmRNA 相對表達量為（1.28±0.19），低于CTL組細胞的（1.97±0.28）和NC組細胞的（1.90±0.32），差異均有統(tǒng)計學意義（t=5.768、4.712，P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組細胞VEGFAmRNA 的相對表達量

2.8 雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果

miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，野生型VEGFA 3'-UTR序列的報告基因質(zhì)粒熒光酶活性為（0.48±0.07），弱于 miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前的（1.00±0.09），差異有統(tǒng)計學意義（t=12.900，P＜0.05）；miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前后突變型3'-UTR序列的報告基因質(zhì)粒熒光酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

以GCB化療為主的綜合治療方案已經(jīng)成為晚期乳腺癌的一線治療方案[8]，但是隨著化療次數(shù)的增加，部分腫瘤細胞會產(chǎn)生化療耐藥性，導致治療失敗。GCB屬于二氟核苷類抗代謝物，在脫氧胞苷激酶的作用下，GCB被磷酸化，生成酸鹽活性代謝物，競爭性插入DNA雙鏈中的結(jié)合位點，與鳥苷結(jié)合，從而抑制DNA的合成，促使腫瘤細胞凋亡[9]。臨床上，至少50%的患者會對GCB產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。因此，尋找逆轉(zhuǎn)GCB耐藥的作用靶點，是進行個體化治療及改善患者預后的關(guān)鍵。

本研究通過化療藥物梯度濃度遞增誘導法建立了人乳腺癌GCB耐藥細胞株MDA-MB-231/GCB，并采用MTT法證實其對GCB的耐藥性。已有的研究顯示，miRNA-613在乳腺癌組織中陰性表達或低表達。Wu等[10]也證實，miRNA-613可抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲活性。因此，考慮miRNA-613與MDA-MB-231/GCB細胞的耐藥性有關(guān)。miRNA作為非編碼小分子調(diào)控基因，可對靶基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過程進行調(diào)節(jié)，從而影響下游蛋白的表達[11]。若這些靶基因與藥物的敏感性有關(guān)，則可能通過上調(diào)或下調(diào)miRNA的表達影響藥物的抗腫瘤作用[12]。因此，本研究采用細胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)MDA-MB-231細胞miRNA-613的表達量，確定其轉(zhuǎn)染率達到70%以上后，進行后續(xù)試驗。加入GCB干預后，轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細胞增殖和遷移活性受到抑制，凋亡活性增加，表明miRNA-613在乳腺癌中屬于功能性基因，上調(diào)miRNA-613的表達量可增加MDA-MB-231/GCB耐藥細胞株對GCB的敏感性。真核細胞的凋亡途徑一般包括死亡受體途徑和線粒體途徑[13]。本研究結(jié)果顯示，3組MDA-MB-231/GCB細胞抗凋亡基因Bcl-2mRNA、Bcl-xLmRNA、BIMmRNA的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組細胞survivinmRNA、MDR1mRNA的相對表達量均低于CTL組細胞和NC組細胞（P＜0.05），說明miRNA-613誘導耐藥細胞凋亡可能與survivin有關(guān)，而與內(nèi)源性線粒體途徑的關(guān)系并不明確。

腫瘤細胞對GCB耐藥的作用機制復雜，腫瘤血管生成被認為是最重要的耐藥機制之一[14]。VEGFA作為目前活性最強、專屬性最高的腫瘤血管相關(guān)生長因子之一，在化療耐藥過程中發(fā)揮重要的作用[15]。通過Target Scan、microrna和miRanda等靶基因預測數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)，VEGFA基因序列存在與miRNA-613互補的結(jié)合位點，經(jīng)熒光素酶報告基因分析，VEGFA可能是miRNA-613的下游靶基因。本研究顯示，miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前，MDA-MB-231/GCB細胞的VEGFAmRNA相對表達量高于MDA-MB-231細胞（P＜0.05），提示VEGFA可能與MDA-MB-231細胞的GCB耐藥有關(guān)；miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細胞的VEGFAmRNA相對表達量低于CTL組細胞和NC組細胞（P＜0.05），進一步從側(cè)面證實了上調(diào)miRNA-613的表達量對GCB耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用是通過抑制VEGFA的表達實現(xiàn)的。另外，MDR1作為多藥耐藥基因，其編碼的P-糖蛋白在細胞內(nèi)形成藥泵，將化療藥物泵出細胞外，使細胞產(chǎn)生耐藥性[16]；同時P-糖蛋白可以使細胞內(nèi)環(huán)境堿化，降低細胞對化療藥物的敏感性[17]。與MDAMB-231細胞比較，MDA-MB-231/GCB細胞中MDR1mRNA的相對表達量升高，而經(jīng)miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，MDR1mRNA的相對表達量降低，提示上調(diào)miRNA-613的表達量可能逆轉(zhuǎn)乳腺癌GCB耐藥細胞株對其他化療藥物的耐藥性。這一結(jié)論尚需進一步的研究證實。

綜上所述，上調(diào)miRNA-613的表達量可提高MDA-MB-231/GCB細胞株對GCB的敏感性，并促進細胞凋亡，可能與VEGFA相對表達量降低，腫瘤血管生成受到抑制有關(guān)。因此，miRNA-613可能成為預測乳腺癌對GCB治療敏感性的參考指標之一，同時miRNA-613可能成為逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥的新靶點，為臨床個體化治療提供新的思路。