載脂蛋白E啟動(dòng)子區(qū)域-427T/C多態(tài)性與冠心病的關(guān)系及其對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響

張蕊，趙輝，趙福梅，任珉，劉婷，劉珊，叢洪良2，△

動(dòng)脈粥樣硬化和脂質(zhì)代謝紊亂是冠心?。–HD）的基本病理基礎(chǔ)，參與脂蛋白合成和代謝的載脂蛋白在冠心病和腦血管病易感性中起著重要的作用［1-2］，其中有關(guān)載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）的研究最為廣泛。作為一種重要的配體蛋白，APOE 通過結(jié)合肝細(xì)胞或其周圍細(xì)胞上的相應(yīng)受體，一方面介導(dǎo)乳糜微粒的內(nèi)吞，另一方面參與三酰甘油（TG）的分解代謝，介導(dǎo)含有APOE 的脂蛋白和脂質(zhì)復(fù)合體與低密度脂蛋白（LDL）受體、LDL 受體相關(guān)蛋白（LRP）、極低密度脂蛋白（VLDL）受體、APOE 受體的相互結(jié)合，進(jìn)而參與血漿和組織脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)控制［3］。同時(shí)APOE 還可通過抑制血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞（SMC）遷移和增殖，限制新生血管內(nèi)膜增生［4］。隨著研究的深入，APOE基因啟動(dòng)子區(qū)域-219G/T、-427T/C、-491A/T位點(diǎn)多態(tài)性逐漸受到關(guān)注［5-6］。該區(qū)域可通過調(diào)控APOE基因的表達(dá)來影響疾病的轉(zhuǎn)歸。目前對(duì)-427T/C位點(diǎn)與冠心病的關(guān)系及其對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的影響尚鮮見大樣本報(bào)道，因此，本研究采用病例對(duì)照研究方法，分析APOE-427T/C 基因多態(tài)性與脂蛋白代謝、冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系及其對(duì)APOE 轉(zhuǎn)錄活性的影響，正確評(píng)價(jià)APOE的臨床意義，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治開辟新途徑。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 選取2016年10月—2017年9月天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科因胸悶、胸痛入院的患者627例，根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影（CAG）結(jié)果分為CHD 組（415 例）和非CHD（212例）。CHD 組男270 例，女145 例，平均年齡（62.00±9.85）歲，包括急性冠脈綜合征103 例和穩(wěn)定性冠心病患者312 例。CHD 患者符合1979 年WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)CAG 檢查［7-8］證實(shí)左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈中至少1 支狹窄直徑≥50%。非CHD 組男88 例，女124 例，平均年齡（59.08±8.96）歲，均經(jīng)心電圖、血液檢查、心臟超聲及CAG 檢查排除冠心病。所有受試者均除外非漢族人群、嚴(yán)重肝腎疾病、甲狀腺亢進(jìn)或減退、外周血管疾病、炎癥性疾病、腫瘤、既往血運(yùn)重建、全身免疫性疾病及其他合并嚴(yán)重合并癥者，且既往未服用調(diào)脂藥物。本研究入選患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血脂及生化指標(biāo)測(cè)定 入院后采集空腹12 h 靜脈血并分離血清。酶法測(cè)定總膽固醇（TC）、TG、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、脂蛋白a［Lp（a）］、載脂蛋白AI（APOAI）、載脂蛋白B（APOB）、同型半胱氨酸（HCY）和尿酸（UA）水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定APOE水平。

1.2.2 巢式PCR 擴(kuò)增APOE-427T/C 基因 采集患者空腹靜脈血5 mL，EDTA 抗凝，分離白細(xì)胞，Triton 低滲緩沖液溶血法提取基因組DNA。采用巢式PCR 擴(kuò)增APOE 啟動(dòng)子-427T/C 目的基因片段。第1 次PCR 引物序列：上游5'-CAAGGTCACACAGCTGGCAAC-3' ，下游 5'-TCCAAT CGACGGCTAGCTACC-3'。PCR 反應(yīng)體系25 μL：反應(yīng)預(yù)制混合液12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA 模板3 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。第2 次PCR 引物序列：上游5'-TGTTGGCCAGGCTGGTTTTAA-3'，下游5'-CCTCCTTTCCTGACCCTGTCC-5'。反應(yīng)體系25 μL：預(yù)制混合液12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，第1 次PCR 產(chǎn)物3 μL，ddH2O 8.5 μL，反應(yīng)條件同第1次擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用AluⅠ酶切，根據(jù)酶切結(jié)果分為純合突變型CC（228 bp）、野生型TT（144 bp，84 bp）；雜合突變型TC（228 bp，144 bp，84 bp）3 型，分型后采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)樣本代表性。

1.2.3 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 熒光報(bào)告基因pGL2-Basic、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、TaqDNA聚合酶均為天津市心血管病研究所饋贈(zèng)。T4DNA連接酶（上海生工生物工程有限公司）、限制性核酸內(nèi)切酶SacI、BglII（Fermentas 公司）、293T細(xì)胞（上海和元生物科技）、質(zhì)粒（高純度）中量提取試劑盒（OriGene）、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司）、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（E1910，Promega）。

1.2.3.2 APOE-427T/C 目的基因片段的獲得、連接、鑒定和293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照PCR后酶切結(jié)果，選擇載脂蛋白啟動(dòng)子區(qū)-427位點(diǎn)的TT和CC純合子基因型，采用巢式PCR對(duì)所需片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增。純化回收PCR 產(chǎn)物，將其與pGL2 載體連接。鑒定連接正確后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BglⅡ?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 將pGL2-APOE-427TT（TT 組）、pGL2-APOE-427CC 重組質(zhì)粒（CC 組）、對(duì)照組質(zhì)粒pGL2-Basic（對(duì)照組）分別和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-CMV共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

1.2.3.3 APOE轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定 采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)報(bào)告基因系統(tǒng)［9-10］檢測(cè)3組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，離心后收集裂解液，取20 μL細(xì)胞裂解液與100 μL LARII混合，熒光發(fā)光檢測(cè)儀讀取10 s的發(fā)光強(qiáng)度值，此為螢火蟲熒光素酶催化產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度，代表啟動(dòng)子的活性。再加入100 μL Stop&Glo 混合，在熒光發(fā)光檢測(cè)儀讀取10 s 的發(fā)光值，即為海腎熒光素酶催化產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度。計(jì)算不同重組質(zhì)粒熒光素酶相對(duì)熒光強(qiáng)度，以反映APOE的轉(zhuǎn)錄活性。計(jì)算公式如下：（螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度-空白孔發(fā)光強(qiáng)度）/（海腎熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度-空白孔發(fā)光強(qiáng)度）［11］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，Graph Pad 5.0 作圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法（方差齊）或Dunntt's T 法（方差不齊），不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，組間比較采用2 樣本Kolmogorov-SmirnovZ檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用非條件Logistic 回歸分析冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素，并計(jì)算比值比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）。雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料比較 與非CHD組相比，CHD組年齡、吸煙比例、男性比例、糖尿病比例、TG、Lp（a）、HCY、UA 均出現(xiàn)升高，HDL-C、APOAI 水平則降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），2組間TC、LDL-C、APOB 及APOE 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 APOE-427T/C 基因多態(tài)性分析 2組APOE-427T/C 基因多態(tài)符合Hardy-Weinberg 平衡（χ2=1.698，P＞0.05），具有群體代表性。與非CHD 組相比，CHD 組C 等位基因頻率升高（P＜0.01），見表2。巢式PCR擴(kuò)增后酶切結(jié)果見圖1。

2.3 APOE-427T/C 基因多態(tài)性對(duì)血脂及載脂蛋白水平影響 非CHD 組中，TC+CC 型與TT 型患者血脂及載脂蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CHD 組中，與TT 型比較，TC+CC 型患者血清APOB水平升高（P＜0.05）、APOA/B 水平降低（P＜0.05），其他指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.4 CHD 發(fā)病危險(xiǎn)因素的多因素Logistic 回歸分析 根據(jù)單因素分析結(jié)果，以有無CHD（有=1，無=0）為因變量，以吸煙（有=1，無=0）、糖尿?。ㄓ?1，無=0）、TG、UA、HCY、APOE-427T/C 基因型（TT=1，TC+CC=2），APOE水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果表明吸煙、糖尿病、UA升高、APOE-427 C等位基因是CHD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，見表4。

Tab.1 Comparison of clinical data between two groups表1 CHD組和非CHD組一般資料的比較

Tab.2 Comparison of APOE-427T/C genotype and allele frequency between two groups表2 APOE-427T/C基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡性的檢驗(yàn)和等位基因頻率比較

Tab.3 Comparison of serum lipids and apolipoprotein levels of different genotypes of APOE-427T/C between the two groups表3 2組內(nèi)APOE-427T/C不同基因型血脂及載脂蛋白水平的比較

Fig.1 Electrophoretogram of AluI fragment of APOE-427T/C site圖1 APOE-427T/C位點(diǎn)AluI酶切片段電泳圖

Tab.4 Multivariate Logistic regression results of risk factors for CHD表4 CHD危險(xiǎn)因素多因素非條件Logistic回歸結(jié)果

2.5 APOE-427T/C 基因多態(tài)性對(duì)APOE 轉(zhuǎn)錄活性的影響 3 組間APOE 蛋白轉(zhuǎn)錄活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=85.30，P＜0.01）；CC組APOE轉(zhuǎn)錄活性明顯低于TT組（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Comparison of APOE transcription activities between three groups圖2 3組細(xì)胞APOE轉(zhuǎn)錄活性比較

3 討論

人APOE基因位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂13區(qū)的2帶（19q132），大小約3.7 kb。該基因包含4個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子［12-13］。APOE 的前體由317 個(gè)氨基酸組成，經(jīng)信號(hào)肽剪切形成299 個(gè)氨基酸的成熟蛋白。而編碼APOE 肽鏈上的第112 位和第158 位氨基酸相對(duì)應(yīng)的核苷酸存在差異，可翻譯成3 種不同的蛋白異構(gòu)體：apo ε2、apo ε3 和apo ε4，其對(duì)應(yīng)的6 種基因型分別：ε2 ε2、ε2 ε3、ε3 ε4、ε3 ε3、ε2 ε4、ε4 ε4［14］。APOE基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的啟動(dòng)子調(diào)控著基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)程度，如果該區(qū)域的DNA序列發(fā)生變化，可能會(huì)影響APOE的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終對(duì)APOE 的蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生影響。目前已經(jīng)在近端啟動(dòng)子區(qū)域中鑒定了幾個(gè)單核苷酸多態(tài)性，其中-219G/T、-427C/T、-491A/T 位點(diǎn)最為重要［15］。既往Ba?ares 等［16］檢測(cè)了APOE-427T/C 位點(diǎn)多態(tài)性與脂質(zhì)譜和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在60歲以下的女性中，攜帶APOE-427 C等位基因的TG 水平較不攜帶者明顯升高。本研究結(jié)果顯示，CHD 組中，與TT 基因型比較，TC+CC 基因型APOB 水平升高；同時(shí)CHD組C等位基因頻率明顯高于非CHD組，推測(cè)該位點(diǎn)基因變異是冠心病的遺傳易感基因；Logistic回歸分析結(jié)果表明APOE-427 C等位基因也是CHD 發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示APOE 基因-427T/C位點(diǎn)基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)病存在明顯相關(guān)性。

Ozturk 等［17］研究了331 例高加索人和215 例非洲裔美國(guó)人，通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)APOE-491 T 等位基因?qū)е翧POE 啟動(dòng)子活性顯著下降，并且位于該核苷酸周圍的序列均參與APOE轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，但是該研究并未指出-427 T/C 位點(diǎn)的啟動(dòng)子多態(tài)性影響APOE轉(zhuǎn)錄活性。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APOE-427 TT 型的APOE 轉(zhuǎn)錄活性較CC 型升高，提示APOE-427T/C 可能是一個(gè)功能性位點(diǎn)，它可通過調(diào)節(jié)APOE 的轉(zhuǎn)錄活性，影響APOE的功能。

APOE-427T/C 位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)冠心病影響主要以下幾方面：（1）APOE 通過和受體結(jié)合，參與血脂代謝，從而使乳糜微粒和極低密度脂蛋水平下降，生成LDL-C 增加，故膽固醇濃度升高。（2）從腸道吸收的膽固醇是血漿脂質(zhì)主要來源，APOE 可通過小腸吸收膽固醇，其吸收的效率應(yīng)由APOE 活性及水平?jīng)Q定，APOE 活性則由啟動(dòng)子多態(tài)性決定，從而影響血漿膽固醇含量。（3）APOE可以促進(jìn)HDL-C的形成，從而介導(dǎo)HDL 在肝臟內(nèi)的分解，從而完成了膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終影響血漿膽固醇的含量。（4）人體攝入脂肪后，脂蛋白之間APOE 蛋白的轉(zhuǎn)移以及脂蛋白轉(zhuǎn)化和生成速率都取決于APOE 活性，活性改變導(dǎo)致高膽固醇血癥和促動(dòng)脈粥樣硬化的循環(huán)中的脂蛋白膽固醇重新分布。本研究顯示APOE基因多態(tài)性通過改變了含有APOE 和APOB 介導(dǎo)的脂蛋白與肝臟的結(jié)合、攝取和分解代謝，以及腸道膽固醇吸收，膽汁酸形成和內(nèi)源性膽固醇合成，最終影響血漿脂蛋白的水平。

APOE-427 C 等位基因攜帶者是冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素，該位點(diǎn)通過影響APOE 的轉(zhuǎn)錄活性及合成水平，進(jìn)而影響血漿脂蛋白濃度及冠心病的發(fā)病。