法舒地爾對(duì)過(guò)氧化氫介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷后TGF-β2及IL-8的影響

肖晨雪，周 霞，金元哲，周東暉

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是一種患病率居高不下的常見(jiàn)病，且至今仍無(wú)法徹底的探明其所有的發(fā)病因素及機(jī)制，而氧化應(yīng)激與炎癥被認(rèn)為在其發(fā)病過(guò)程中扮演著重要角色。過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)引起的活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加引發(fā)的氧化應(yīng)激能夠促進(jìn)脂質(zhì)的氧化，使內(nèi)皮下間隙的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)氧化，進(jìn)而促進(jìn)粥樣硬化斑塊形成[1]。炎性介質(zhì)也是一個(gè)不可或缺的因素。白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)可以增強(qiáng)白細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的粘附力，進(jìn)而引起內(nèi)皮損傷，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化[2]。同時(shí)氧化應(yīng)激損傷能夠增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的生成，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞損傷[3]。有研究發(fā)現(xiàn)在人晶狀體上皮細(xì)胞中，糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)誘導(dǎo)的ROS增加能夠促進(jìn)TGF-β2的生成[4]。

法舒地爾(Fasudil，F(xiàn)H)作為一種新型Rho激酶抑制劑，對(duì)于氧化應(yīng)激與炎性介質(zhì)有有效的抑制作用。FH可以直接與Rho激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)-CD結(jié)合，抑制Rho酶的活性[5]，從而減輕ROS誘導(dǎo)的RhoA-ROCK信號(hào)通路的異常激活。周中興等[6]發(fā)現(xiàn)FH可以降低球囊損傷后大鼠主動(dòng)脈血清IL-8的濃度。還有文獻(xiàn)提示FH可以有效減少心肌梗死大鼠非梗死心肌細(xì)胞中炎性因子TGF-β2的表達(dá)[7]。

但目前在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，ROS對(duì)TGF-β2及IL-8的影響國(guó)內(nèi)少有報(bào)道，本研究通過(guò)體外應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，建立氧化損傷細(xì)胞模型，探究氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子TGF-β2及IL-8的影響以及FH的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 細(xì)胞株EA.Hy926(廣州吉?dú)W姆公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液(HyClone公司，美國(guó))；胎牛血清(Biological Industries公司，以色列)。實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗GAPDH一抗、羊抗兔二抗(Santa Cruze公司，墨西哥)；人IL-8酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人TGF-β2酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Abcam公司，英國(guó))；BCA試劑盒(北京致力生物科技有限公司)；ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所)；FH(Selleck公司，美國(guó))；超靈敏化學(xué)發(fā)光底物(Thermo公司，美國(guó))；RIPA裂解液(Thermo公司，美國(guó))；GADPH(中國(guó)康為世紀(jì)生物公司)；WB曝光儀(型號(hào)：Tanon 5200，上海天能科技有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hy926細(xì)胞用含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%～80%，用胰酶消化，按1∶2傳代，選3～6代作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.2.2 氧化損傷模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5×104/mL接種于無(wú)菌24孔板上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，選取細(xì)胞融合80%～90%的孔板以30% H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞2 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，PBS清洗，換用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞[8]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 選融合至80%～90%的培養(yǎng)瓶細(xì)胞，胰酶消化，按1∶4傳代，待傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右，作為實(shí)驗(yàn)分組用細(xì)胞。H2O2組(過(guò)氧化氫損傷2 h后換用10%FBS培養(yǎng)基37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48 h)；FH干預(yù)組(PBS清洗2次氧化損傷細(xì)胞，更換為75 nmol/L FH+培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48 h)；單純FH組(無(wú)氧化處理，使用75 nmol/L FH+培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48 h)；對(duì)照組：無(wú)處理正常細(xì)胞。用倒置相差顯微鏡觀察各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.4 觀察細(xì)胞的形態(tài)及凋亡情況 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至2×104/mL，100 μL/孔的量接種于96孔板內(nèi)，1 mL/孔的量接種于6孔板于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后按實(shí)驗(yàn)分組處理。處理后的細(xì)胞通過(guò)吖啶橙/溴乙錠(AO/EB)染色30 s，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.5 熒光法測(cè)ROS以及ELISA法測(cè)氧化產(chǎn)物IL-8、TGF-β2及Western Blot法測(cè)RhoA、肌球蛋白磷酸酶靶蛋白-1(myosinephosphatae targeting subunit-1，MYPT-1)的含量

1.5.1 裂解液的制備 收集各組細(xì)胞，用冰浴后的PBS洗滌，隨后加入RIPA裂解液，低溫高速離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，留上清測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.5.2 熒光法測(cè)ROS 測(cè)定孔版加入190 μL各組細(xì)胞裂解上清液樣本與1 mmol/L的DCFH-DA 10 μL,對(duì)照孔則加入等量細(xì)胞裂解上清液樣本與PBS 10 μL，混勻，37 ℃孵育30 min。于485 nm測(cè)定其熒光強(qiáng)度，根據(jù)公式“ROS量=熒光強(qiáng)度×190÷200”計(jì)算ROS的量。

1.5.3 ELISA法測(cè)氧化產(chǎn)物IL-8、TGF-β2 取標(biāo)準(zhǔn)品干粉83 ng溶于83 μL雙蒸水中，混勻后取2 μL用雙蒸水配制成2 000 pg/mL的標(biāo)品備用。在酶標(biāo)包被孔板上設(shè)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔，按濃度梯度為2 000 pg/mL、1 000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、0 pg/mL稀釋。待測(cè)樣品孔中加樣品稀釋液90 μL及培養(yǎng)基上清液樣品10 μL混勻，隨后除空白孔外均加入100 μL酶標(biāo)試劑?；靹蚝髼壢ヒ后w，甩干后洗滌4次。隨后每孔加入100 μL抗體檢測(cè)溶液，室溫孵育2 h。棄上清洗滌4次后每孔加入100 μL稀釋400倍的Streptavidin-hrp溶液，在室溫下孵育30 min。棄上清洗滌4次后加入終止液100 μL，于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度(optical density，OD)值。計(jì)算待測(cè)樣品濃度：用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，將待測(cè)樣品孔的OD值代入回歸方程，算出待測(cè)樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為待測(cè)樣品實(shí)際濃度。分別測(cè)量IL-8、TGF-β2，重復(fù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)6次。

1.5.4 Western Blot檢測(cè) 細(xì)胞裂解液經(jīng)過(guò)BCA試劑盒細(xì)胞總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分離,然后通過(guò)Western Blot轉(zhuǎn)移到孔徑為0.2 μm的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上。經(jīng)過(guò)4 ℃過(guò)夜封閉PVDF膜上非特異結(jié)合位點(diǎn)后，用5%脫脂奶粉配制的特異性抗體(一抗)，稀釋度均為(1∶1 000)，室溫封閉PVDF膜2 h,之后用TBS-T洗去未結(jié)合的抗體，再用帶有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)簽的羊抗兔二抗繼續(xù)室溫封閉PVDF膜1 h。然后用TBS-T洗去未結(jié)合的二抗，最后用Tanon5200機(jī)器曝光。以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。用GTS圖像分析系統(tǒng)分析Western Blot的目的條帶。以校正值K對(duì)所檢測(cè)蛋白進(jìn)行半定量分析。K=樣本條帶吸光度值/GAPDH吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 FH對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響 單純H2O2處理顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并出現(xiàn)細(xì)胞變小，變圓，沒(méi)有正常Hy926細(xì)胞形態(tài)。FH能夠抑制H2O2產(chǎn)生的這種現(xiàn)象，但無(wú)法逆轉(zhuǎn)，圖1。

圖1 顯微鏡下Hy926細(xì)胞形態(tài)(×160)

2.2 FH對(duì)H2O2引發(fā)細(xì)胞凋亡的影響 AO/EB染色，48 h處理，可見(jiàn)H2O2大量的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，而FH干預(yù)組細(xì)胞雖然也出現(xiàn)了縮小變形，但鏡下凋亡的細(xì)胞較H2O2組有所下降，圖2。

圖2 熒光顯微鏡下Hy926細(xì)胞調(diào)亡情況(×40)

2.3 FH對(duì)H2O2引發(fā)Hy926細(xì)胞產(chǎn)生ROS影響 與對(duì)照組比較，H2O2組ROS明顯上升(P<0.01)；與對(duì)照組比較，F(xiàn)H干預(yù)組ROS明顯上升(P<0.01)；與H2O2組比較，F(xiàn)H干預(yù)組ROS下降(P<0.01)，圖3。

與H2O2組比較，*P<0.01；與對(duì)照比較，&P<0.01圖3 各組ROS熒光測(cè)定結(jié)果

2.4 FH對(duì)H2O2引發(fā)Hy926細(xì)胞產(chǎn)生IL-8能力影響 與對(duì)照組比較，H2O2組IL-8明顯上升(P<0.01)；與對(duì)照組比較，F(xiàn)H干預(yù)組IL-8明顯上升(P<0.01)；與H2O2組比較，F(xiàn)H干預(yù)組IL-8下降(P<0.01)，圖4。

與H2O2組比較，*P<0.01；與對(duì)照比較，&P<0.01圖4 各組IL-8濃度測(cè)定結(jié)果

2.5 FH對(duì)H2O2引發(fā)Hy926細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β2的影響 與對(duì)照組比較，H2O2組TGF-β2明顯上升(P<0.01)；與對(duì)照組比較，F(xiàn)H干預(yù)組TGF-β2明顯上升(P<0.01)；與H2O2組比較，F(xiàn)H干預(yù)組TGF-β2下降(P<0.01)，圖5。

與H2O2組比較，*P<0.01；與對(duì)照比較，&P<0.01圖5 各組TGF-β2濃度測(cè)定結(jié)果

2.6 RhoA蛋白表達(dá)水平 RhoA蛋白表達(dá)水平能夠被H2O2激活，而FH具有抑制H2O2激活RhoA蛋白表達(dá)的能力，圖6。

圖6 RhoA蛋白表達(dá)水平

2.7 MYPT-1磷酸化水平 H2O2損傷組MYPT-1磷酸化較對(duì)照組明顯升高，F(xiàn)H干預(yù)組的MYPT-1磷酸化水平較H2O2組明顯下降，說(shuō)明FH能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的MYPT-1磷酸化，即抑制RhoA-ROCK信號(hào)通路的激活。

圖7 MYPT-1磷酸化水平

3 討論

抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)于預(yù)防冠狀動(dòng)脈粥樣硬化至關(guān)重要。異常增加的TGF-β2可以激活Rho激酶信號(hào)通路，進(jìn)而加劇冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，IL-8亦可以調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而加劇內(nèi)皮損傷。本研究通過(guò)H2O2誘導(dǎo)Hy926細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，比較FH對(duì)于氧化應(yīng)激后早期炎性因子IL-8以及TGF-β2的影響。

有研究已證實(shí)FH可以有效拮抗高糖引起的人腹膜間皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激引發(fā)的細(xì)胞損傷[9]，但該研究未詳細(xì)探究相關(guān)機(jī)制。而另一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)H可以通過(guò)抑制NF-κB的活性來(lái)減弱AGEs引起的細(xì)胞凋亡[10]。本研究中FH能拮抗H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，同時(shí)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但無(wú)法逆轉(zhuǎn)。提示FH能夠有效減輕H2O2導(dǎo)致的氧化應(yīng)激帶來(lái)的細(xì)胞損傷，可能與FH對(duì)NF-κB的抑制作用有一定的關(guān)系。但同時(shí)在本研究中氧化應(yīng)激引起的炎性介質(zhì)TGF-β2及IL-8的異常增加也可能導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡加速，其具體機(jī)制是否與NF-kB有關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。本研究中并未發(fā)現(xiàn)FH對(duì)正常細(xì)胞的增殖有明顯的影響，可能與用藥時(shí)間及用藥濃度相關(guān)。FH對(duì)無(wú)異常增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響以及FH對(duì)細(xì)胞氧化損傷的緩解在其他細(xì)胞中是否也有同樣的作用仍有待進(jìn)一步研究。

IL-8是嗜中性粒細(xì)胞的一種主要激活劑，多種炎性疾病被證實(shí)與其密切相關(guān)[11]。在誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向受損細(xì)胞聚集這一過(guò)程中IL-8起著至關(guān)重要的作用[12]。在慢性炎性刺激過(guò)程中，IL-8可以增加中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附能力，并誘導(dǎo)其跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移，引發(fā)血管功能障礙和血管疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、主動(dòng)脈瘤形成和高血壓[2]。有研究指出，ROCK信號(hào)通路的激活可以導(dǎo)致IL-8的表達(dá)增加[13]，從而加重內(nèi)皮損傷。TGF-β2作為T(mén)GF超家族中的一員，其可以抑制巨噬細(xì)胞的凋亡[14]，而巨噬細(xì)胞在早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。血管平滑肌細(xì)胞會(huì)因巨噬細(xì)胞分泌出Fas配體出現(xiàn)加速凋亡，同時(shí)平滑肌細(xì)胞的凋亡又反向加速了巨噬細(xì)胞的凋亡[15]。因此，當(dāng)TGF-β2過(guò)度表達(dá)時(shí)，巨噬細(xì)胞的凋亡下降，進(jìn)而加速了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。有研究表明，當(dāng)RhoA-ROCK通路被激活時(shí)，可觀察到TGF-β2的表達(dá)顯著增加[16]，而TGF家族蛋白的增加還可以反過(guò)來(lái)通過(guò)Rho鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子1(ARHGEF1)增強(qiáng)Rho激酶活性[17]，從而進(jìn)一步加劇內(nèi)皮損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2O2損傷內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，IL-8與TGF-β2的含量顯著增加，而FH則能夠抵抗這種效應(yīng)，也許與FH對(duì)Rho激酶的抑制作用有關(guān)。FH對(duì)于炎性介質(zhì)的影響究竟是影響其合成還是在釋放的途徑有阻斷，仍需進(jìn)一步證實(shí)。

MYPT1是平滑肌細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈磷酸化酶(myosin light-chain phosphase,MLCP)的一個(gè)亞基，而ROCK是一種小G蛋白R(shí)hoA的下游效應(yīng)器。當(dāng)ROCK被激活時(shí)，MYPT1就會(huì)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而引起MLCP失活、胞內(nèi)磷酸化肌球蛋白輕鏈(p-MLC)水平增高[18]，引起血管平滑肌細(xì)胞功能障礙。因此MYPT1是ROCK信號(hào)通路激活的一個(gè)標(biāo)志。還有研究表明ROS亦可以通過(guò)ARHGEF1激活RhoA蛋白活性[19]，進(jìn)而激活RhoA-ROCK信號(hào)通路，引起大鼠肺動(dòng)脈收縮。本研究中我們通過(guò)MYPT-1的磷酸化程度增加，證實(shí)了ROCK信號(hào)通路確實(shí)被激活。且FH作為一種Rho激酶抑制劑，可以有效抑制氧化應(yīng)激損傷后導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡以及炎性介質(zhì)TGF-β2與IL-8的增加，其機(jī)制可能與FH對(duì)ROCK信號(hào)通路的抑制作用有關(guān)，且單純的FH對(duì)于細(xì)胞的損傷并不明顯。但ROCK的激活是否與ARHGEF1有關(guān)聯(lián)，以及其中具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制紛繁復(fù)雜，本研究?jī)H驗(yàn)證了RhoA-ROCK單一信號(hào)通路，F(xiàn)H對(duì)氧化應(yīng)激損傷的抑制作用是否僅有這一種機(jī)制本研究尚未證實(shí)，其他信號(hào)通路是否受影響仍有待進(jìn)一步研究。且當(dāng)損傷加劇，F(xiàn)H的作用是否仍然有效尚需更深入的研究。

綜上，F(xiàn)H能有效的通過(guò)抑制RhoA-ROCK信號(hào)通路來(lái)減輕H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，這對(duì)冠心病等其他心血管疾病的治療與預(yù)防有一定的指導(dǎo)作用。但本研究?jī)H檢測(cè)了TGF-β2與IL-8這兩個(gè)產(chǎn)物，而FH對(duì)于氧化應(yīng)激的抑制的更詳細(xì)的分子機(jī)制以及FH對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究。