葛根芩連湯對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及炎性因子的影響

閆忠紅，劉 勇，劉 碩，胡新穎

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

近年來，糖尿病尤其是2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)病率逐年上升，已成為全球非傳染性疾病中最具流行性的疾病之一[1]，其預(yù)后差，并發(fā)癥多，嚴(yán)重危害人類健康。中醫(yī)方劑在糖尿病的治療中獨(dú)居特色，具有療效顯著、長(zhǎng)期使用副作用小的特點(diǎn)，有著西藥不可替代的優(yōu)勢(shì)，可多途徑、多靶點(diǎn)改善組織器官功能[2]。葛根芩連湯為中醫(yī)經(jīng)典方劑，臨床運(yùn)用該方治療T2DM取得了較好的降糖效果[3]，實(shí)驗(yàn)研究亦證實(shí)其具有改善T2DM大鼠胰島素抵抗作用[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示葛根芩連湯治療2型糖尿病的效應(yīng)機(jī)制多與抗炎、抗氧化應(yīng)激等相關(guān)[5]。對(duì)自發(fā)性2型糖尿病肥胖大鼠模型研究，亦表明葛根芩連湯具有改善胰島素抵抗作用和調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞子的作用[6]。由此可見，細(xì)胞因子與葛根芩連湯治療T2DM相關(guān)。為此，本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飲食飼養(yǎng)加注射小劑量鏈脲佐菌素復(fù)制2型糖尿病模型，探討葛根芩連湯對(duì)T2DM模型大鼠胰島素抵抗及炎性因子的影響，為葛根芩連湯通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子而改善T2DM胰島素抵抗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量（180～200） g，6～8周齡，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（黑）2013-012。常規(guī)條件飼養(yǎng)，按正常晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)光照時(shí)間，保持室溫22～26℃，濕度50%～60%。

1.2 藥物 葛根芩連湯，由葛根、黃芩、黃連、炙甘草組成，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心加工制備呈湯劑，使用前37 ℃水浴加熱。馬來酸羅格列酮（文迪雅），購(gòu)自葛蘭素史克（天津）有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020475。

1.3 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素（STZ），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰島素放射免疫試劑盒，購(gòu)自北京華英生物有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 ELISA試劑盒，購(gòu)自美國(guó)R&D公司。AL204電子天平，購(gòu)自瑞士METTLEY TOLEDO公司；血糖儀，購(gòu)自上海魚躍醫(yī)療設(shè)備公司；Fresco低溫冷凍離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；MultiSkan3酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；微量移液器，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

2 方法

2.1 模型制備及分組 將40只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組（10只）和造模組（30只），分別給予普通飼料和高脂高糖飼料[7]（鼠維持飼料67.5%、豬油10%、蔗糖20%、蛋黃粉2.5%）喂養(yǎng)。連續(xù)喂養(yǎng)4周后，造模組大鼠空腹一次性腹腔注射pH 4.4枸櫞酸鈉緩沖液配制的STZ溶液30 mg/kg。7 d后經(jīng)大鼠尾靜脈取血，取血前大鼠禁食不禁水12 h，然后用血糖儀檢測(cè)大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），將血糖值在16.7 mmol/L至30 mmol/L范圍的大鼠視為模型成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組，羅格列酮組和葛根芩連湯組，每組10只大鼠。

2.2 給藥方法 分組第2天，各組大鼠經(jīng)灌胃給藥，給藥量依照人與大鼠給藥劑量系數(shù)折算公式，空白組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液（10 mL/kg），羅格列酮組和葛根芩連湯組分別給予羅格列酮溶液3 mg/kg和葛根芩連湯18.2 g/kg灌胃，用藥體積按100 g體質(zhì)量1 mL計(jì)算，1次/d，連續(xù)4周。

2.3 標(biāo)本采集 治療結(jié)束后，禁食不禁水12 h，所有大鼠快速剪尾取血，用血糖儀測(cè)量FBG。然后麻醉各組大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，取血完成后將采血管靜置30 min，放入高速離心機(jī)中以3 500 r/min離心15 min，分離血清，使用微量移液槍收集上清液移入不同編號(hào)的EP管，將其放置- 20℃冰箱凍存，待檢測(cè)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 血清胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）測(cè)定 使用放射免疫法檢測(cè)各組大鼠FINS含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，分別將各組大鼠血清及標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL加入聚苯乙烯試管并編號(hào)，各管分別加入抗體與125I-Ins各100 μL，充分混勻，37 ℃溫育2 h；各管中加入500 μL免疫分離劑混勻后于3 500 r/min離心15 min，摒棄上清液，檢測(cè)沉淀的CPM值，計(jì)算各組大鼠FINS水平。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasismodel assessment-estimated insulin resistance，HOMAIR）：HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。

2.4.2 大鼠血清炎性因子水平檢測(cè) 用 ELISA法檢測(cè)大鼠血清炎性因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 -6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素 -1β（interleukin-1β，IL-1β）以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）含量。操作步驟嚴(yán)格按照 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后加樣，蓋封膜板搖勻后，恒溫溫育60 min，洗滌后加入顯色劑，恒溫避光顯色 12 min，加入終止液，10 min后采用酶標(biāo)儀依序測(cè)量各孔的吸光度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用LSD進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比較 見表1。

表1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比較（± s ，n = 10）

表1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比較（± s ，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別FBG/（mmol/L）FINS/（mIU/L）HOMA-IR空白組 5.12±0.53 14.89±3.83 3.40±0.78模型組 24.26±5.02# 21.09±2.36# 23.01±5.34#羅格列酮組 17.36±4.05△ 17.69±2.05△ 13.65±5.14△葛根芩連湯組 20.58±2.83 18.01±2.98△△ 16.47±3.68△

3.2 各組大鼠血清炎性因子的比較 見表2。

表2 各組大鼠血清炎性因子的比較（± s ，n = 10）

表2 各組大鼠血清炎性因子的比較（± s ，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別 TNF-α/（pg/mL） IL-6/（pg/mL） IL-1β/（pg/mL） MCP-1/（ng/mL）空白組 0.45±0.69 3.45±0.54 60.20±8.24 129.64±11.68模型組 2.02±1.02# 8.89±1.75# 129.89±22.69# 179.54±27.86#羅格列酮組 0.98±0.25△ 5.32±1.30△ 89.86±9.74△ 148.47±12.04△葛根芩連湯組 1.24±0.47 6.69±1.47△ 93.66±14.98△ 158.25±10.34

4 討論

T2DM為西醫(yī)學(xué)病名，在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中當(dāng)屬“消渴”范疇，其發(fā)生發(fā)展與先天不足、后天飲食不節(jié)、情志失調(diào)、過度勞逸等因素密切相關(guān)，其基本病機(jī)為胃腸濕熱、燥熱傷津。葛根芩連湯出自《傷寒論》，主要用于治療濕熱所導(dǎo)致的痢疾和腹瀉，根據(jù)中醫(yī)異病同治的思想，將其用于治療T2DM，取得了良好的臨床療效。

胰島素抵抗貫穿T2DM發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程，是T2DM的始動(dòng)因素和主要機(jī)制[8]。胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取作用受損，導(dǎo)致胰島素代償性增多，因此改善胰島素抵抗是治療T2DM的關(guān)鍵。胰島素抵抗被認(rèn)為是低度炎癥狀態(tài)[9]，炎性反應(yīng)是引起胰島素抵抗的重要因素之一[10]。在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，通過內(nèi)分泌和旁分泌途徑分泌多種炎性因子，引起胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻從而誘發(fā)機(jī)體胰島素抵抗[11]。長(zhǎng)期胰島素抵抗會(huì)引起機(jī)體一系列病理改變，大量文獻(xiàn)表明，TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1這些炎癥因子均能直接或通過相互作用導(dǎo)致胰島素抵抗[12-14]。炎癥和胰島素抵抗關(guān)系密切，相互影響，相互調(diào)控，因此降低炎性因子水平能起到提高胰島素敏感性和保護(hù)胰島細(xì)胞存活的作用。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，與空白組比較，模型組大鼠血清FBG、FINS、HOMA-IR明顯升高，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，提示模型組大鼠造模成功。同時(shí)，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平亦明顯提高，提示T2DM處于慢性炎癥狀態(tài)，這種炎癥反應(yīng)可引起相應(yīng)臟器的損傷[16]。經(jīng)過4周的連續(xù)給藥治療，與模型組比較，葛根芩連湯組FINS 含量和HOMA-I R顯著下降（P＜0.05），提示葛根芩連湯可改善T2DM的胰島素抵抗，主要是提高胰島素的敏感性。與模型組比較，葛根芩連湯組FBG下降（20.58比24.26），但無顯著性差異（P＞0.05）,與以往文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致[17]，可能時(shí)由于本實(shí)驗(yàn)中采用的T2DM大鼠模型變異較大，樣本數(shù)不足所致。系統(tǒng)藥理學(xué)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)研究均表明[4-5,18]，葛根芩連湯通過多途徑，多靶點(diǎn)發(fā)揮治療T2DM作用。近些年，葛根芩連湯在治療腸道炎癥發(fā)揮了重要的作用，可明顯抑制多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[19-20]。與模型組比較，葛根芩連湯組大鼠血清IL-6和IL-1β水平明顯降低，提示葛根芩連湯可能通過降低血清炎性因子水平，改善T2DM大鼠胰島素抵抗。綜上所述，T2DM大鼠血清炎性因子水平升高可能導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而升高大鼠血糖；葛根芩連湯可能通過降低T2DM大鼠血清炎性因子水平，發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用，進(jìn)而降低大鼠血糖。葛根芩連湯的降糖作用可能與降低血清炎性因子水平，從而改善T2DM大鼠胰島素抵抗有關(guān)。