APPL1減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的實驗研究*

李 波， 鄭 植， 陳芃螈

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 四川省人民醫(yī)院兒科， 四川 成都 610072)

急性心力衰竭是一種臨床上常見的心血管系統(tǒng)疾病，感染性內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的心力衰竭預(yù)后較單純心力衰竭更差[1]。半數(shù)以上的感染性內(nèi)毒素血癥誘發(fā)心力衰竭與革蘭氏陰性菌有關(guān)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是其致病的主要原因之一[2]。LPS能夠作用于心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)心肌組織損傷，導(dǎo)致誘發(fā)心力衰竭[3]。APPL1 (adaptor protein, phosphotyrosine interacting with PH domain and leucine zipper 1)在人體內(nèi)的多個組織和器官中均有表達(dá)，參與介導(dǎo)胰島素信號傳遞、胞內(nèi)運輸和細(xì)胞增殖等生理過程[4-5]。研究表明，APPL1與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生具有密切關(guān)系，沉默APPL1可以減弱球狀脂聯(lián)素抗缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡作用，提高APPL1表達(dá)可以顯著增加心肌細(xì)胞活力[6-7]。目前對于APPL1在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中作用尚不明確。本實驗探討過表達(dá)APPL1對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化損傷的影響，以期為闡明APPL1在心肌損傷中的作用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

TRIzol試劑、RT-qPCR試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa；HRP標(biāo)記的IgGⅡ抗購自Proteintech；全蛋白提取液購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；過表達(dá)APPL1重組慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗活化的caspase-3(cleaved caspase-3)抗體和APPL1抗體購自Stanta Cruz；活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。心肌細(xì)胞H9c2購自湖南豐暉生物科技有限公司。

2 方法

2.1LPS對心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)影響 心肌細(xì)胞分別經(jīng)過含有0和1 mg/L LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM)培養(yǎng)，記為對照(control)組和LPS組。用RT-qPCR和Western blot檢測培養(yǎng)24 h后細(xì)胞中APPL1的表達(dá)變化。

2.1.1RT-qPCR 取control和LPS組的心肌細(xì)胞，在細(xì)胞中添加TRIzol裂解液，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。取cDNA，以SYBR進(jìn)行定量PCR，β-actin作為內(nèi)參照，分析APPL1的表達(dá)量。設(shè)置PCR條件為：95 ℃反應(yīng)30 s，95 ℃反應(yīng)3 s；60 ℃反應(yīng)30 s，40個循環(huán)。引物由上海生工合成，APPL1的上游引物序列為5’-CAGGGTGGAAATTTAATGAG-3’，下游引物序列為 5’-AGGTGATCTGAAAACAATATC-3’。β-actin 的上游引物序列為 5’-GCAGGAGTA2CGAT-GAGTC-3’，下游引物序列為 5’-ACGCAGCTCAGTAACAGT-3’。

2.1.2Western blot 取control和LPS組的心肌細(xì)胞，在心肌細(xì)胞中添加全蛋白提取液，每5×106個細(xì)胞中添加500μL的提取液，在4 ℃震蕩30 s后，離心，吸取上清(全蛋白液)。用BCA法對蛋白定量。在蛋白樣品中以1∶4的體積比添加SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。以12%的分離膠、5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，每孔按照40 μg蛋白樣品上樣，上樣后用80 V的恒壓電泳45 min后，再以120 V的電壓電泳1.5 h后結(jié)束電泳。根據(jù)凝膠大小裁剪PVDF膜，在200 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜45 min。把PVDF膜取出后，在5%的牛血清白蛋白中孵育1.5 h后，置于1∶400稀釋的APPL1抗體中，置于4 ℃的冷室中孵育過夜。再將PVDF膜放在1∶2 000稀釋的Ⅱ抗孵育液中，在室溫結(jié)合1.5 h。ECL發(fā)光，用Konda In-Vivo Imagine System F采集圖像，β-acitn作為內(nèi)參照，用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 心肌細(xì)胞培養(yǎng)密度為40%時，把培養(yǎng)液上清吸棄，分別添加APPL1重組慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體，同時加入轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑Polybrene，繼續(xù)培養(yǎng)12 h以后，把病毒液吸棄，添加新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d以后，用1 mg/L的嘌呤霉素篩選4 d。把穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPL1重組慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體的心肌細(xì)胞經(jīng)含有1 mg/L LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后記為Lv-APPL1和Lv-NC。Control和LPS組處理方法同2.1。用RT-qPCR和Western blot檢測LPS、Lv-NC和Lv-APPL1組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后細(xì)胞中APPL1的表達(dá)變化。

2.3MTT檢測細(xì)胞活力 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1組細(xì)胞按照上述各組的分組，分別接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，在每個孔內(nèi)添加5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃孵育4 h，把上清溶液吸棄以后，加入100 μL的DMSO溶液，震蕩反應(yīng)10 min，紫色結(jié)晶溶解以后，測定570 nm的A值(以空白孔調(diào)零)。相對活力(%)=實驗組A÷對照組A×100%

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細(xì)胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化后，配制成單細(xì)胞懸浮液，收集106個細(xì)胞，以300 μL的結(jié)合緩沖液懸浮以后，添加PI和Annexin V-FITC染液，繼續(xù)加入200 μL的結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測凋亡變化。同時用Western blot方法檢測細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平，步驟同上。

2.5LDH和MDA水平檢測 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細(xì)胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液上清及細(xì)胞，用硫代巴比妥酸法檢測細(xì)胞中MDA含量，用2,4-二硝基苯肼顯色法檢測培養(yǎng)液中LDH水平，步驟參照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

2.6SOD和GSH-Px活性檢測 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細(xì)胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，以胰蛋白酶消化后，反復(fù)凍融法將細(xì)胞裂解以后，用黃嘌呤氧化酶法檢測細(xì)胞中SOD活性，5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)比色法測定細(xì)胞中GSH-Px活性，步驟均同試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中ROS水平 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細(xì)胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，用4 ℃預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗滌3次以后，添加0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，添加10 μmol/L的DCFH-DA染液500 μL，置于37 ℃孵育30 min后，離心棄上清，用冰預(yù)冷的PBS洗滌以后，配制成1×108/L的懸浮液，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm，用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均經(jīng)過SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差，組間比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS降低心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)水平

心肌細(xì)胞經(jīng)過LPS處理以后，細(xì)胞中的APPL1 mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，LPS抑制心肌細(xì)胞中APPL1的表達(dá)，見圖1、表1。

Figure 1. Western blot was used to detect the expression level of APPL1 in LPS-induced cardiomyocytes.

圖1 Western blot檢測APPL1在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平

表1 LPS處理后心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)水平

Table 1. Expression of APPL1 in cardiac myocytes after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupAPPL1 mRNAAPPL1 proteinControl1.000.46±0.05LPS0.65±0.08?0.21±0.03?

*P<0.05vscontrol group.

2 APPL1重組慢病毒提高LPS條件下心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)水平

APPL1重組慢病毒轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞經(jīng)過LPS處理后，細(xì)胞中的APPL1 mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2。

Figure 2. Western blot was used to detect the effect of lentiviral overexpression of APPL1 on the expression of APPL1 in cardiac myocytes under LPS condition.

圖2 Western blot檢測過表達(dá)APPL1慢病毒對LPS條件下心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)影響

表2 過表達(dá)APPL1慢病毒感染后經(jīng)LPS處理后的心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)水平

Table 2. APPL1 expression level in cardiomyocytes treated with LPS after APPL1 overexpression lentivirus infection(Mean±SD.n=3)

GroupAPPL1 mRNAAPPL1 proteinLPS1.000.25±0.03Lv-NC1.04±0.090.24±0.06Lv-APPL12.54±0.18?0.39±0.04?

*P<0.05vsLPS group.

3 過表達(dá)APPL1提高LPS條件下心肌細(xì)胞活力并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡

LPS處理后的心肌細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。過表達(dá)APPL1后的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3、表3。

Figure 3. Overexpression of APPL1 reduced LPS-induced cardiomyocyte apoptosis. A: flow cytometry was used to detect the effect of overexpression of APPL1 on LPS-induced cardiomyocyte apoptosis； B: effect of overexpression of APPL1 on the level of apoptotic protein cleaved caspase-3 in LPS-induced cardiomyocytes detected by Western blot.

圖3 過表達(dá)APPL1減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

4 過表達(dá)APPL1減輕LPS條件下心肌細(xì)胞氧化損傷

LPS處理后的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性升高，同時細(xì)胞中MDA含量也升高。過表達(dá)APPL1后的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性降低，細(xì)胞中MDA水平也降低(P<0.05)，見表4。

5 過表達(dá)APPL1提高LPS條件下心肌細(xì)胞中抗氧化酶活性并降低細(xì)胞中ROS水平

LPS處理后的心肌細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性降低，細(xì)胞中ROS水平升高。過表達(dá)APPL1后的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性升高，細(xì)胞中ROS水平降低(P<0.05)，見表5。

表3 過表達(dá)APPL1的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后細(xì)胞活力、凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平

Table 3. Cell viability, apoptosis rate and cleaved caspase-3 protein level of cardiomyocytes with APPL1 overexpression after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupCell viability (%)Apoptosis rate (%)Cleaved caspase-3Control100.005.63±0.570.21±0.03LPS63.32±7.51&32.26±3.89&0.68±0.08&Lv-NC65.21±8.2030.59±4.620.65±0.06Lv-APPL179.69±5.16?21.40±1.34?0.31±0.04?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

表4 過表達(dá)APPL1的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后細(xì)胞中MDA含量及培養(yǎng)液中LDH活性

Table 4. The content of MDA and the activity of LDH in the culture medium of APPL1-overexpressing cardiomyocytes after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupLDH (U/L)MDA (μmol/g)Control4.20±0.369.37±0.85LPS35.27±4.69&28.54±3.14&Lv-NC36.20±4.9526.81±3.59Lv-APPL118.26±1.18?16.55±1.27?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

表5 過表達(dá)APPL1的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后細(xì)胞中ROS含量及SOD和GSH-Px活性

Table 5. ROS content and SOD and GSH-Px activity in cardiomyocytes with APPL1 overexpression after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupSOD (×103 U/g)GSH-Px (U/g)ROS (fluorescence intensity)Control89.47±9.32816.45±58.2617.48±1.64LPS41.56±4.59&412.20±40.76&89.52±7.63&Lv-NC40.20±3.12408.59±45.1790.58±6.20Lv-APPL164.17±3.79?597.12±50.92?45.01±3.57?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

討 論

LPS是感染性內(nèi)毒素血癥心力衰竭發(fā)生的重要原因，LPS存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜上，是革蘭氏陰性菌致病發(fā)生的因素[8]。LPS能夠誘導(dǎo)心肌損傷，促進(jìn)心肌細(xì)胞氧化損傷，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[9]。本實驗結(jié)果顯示，LPS處理后的心肌細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率升高，同時細(xì)胞中凋亡標(biāo)志蛋白活化的caspase-3水平升高，細(xì)胞中ROS水平也升高，說明成功構(gòu)建了LPS心肌細(xì)胞損傷模型。

APPL1蛋白沒有跨膜區(qū)且具有高親水性，含有3個功能結(jié)構(gòu)域，參與轉(zhuǎn)錄抑制、小GTP酶結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白質(zhì)結(jié)合、增加BAR與GTP酶的結(jié)合和BAR結(jié)構(gòu)域脂質(zhì)特異性發(fā)揮過程[10-14]。APPL1在骨骼肌、腎臟等多種組織中均可表達(dá)，參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)元存活和神經(jīng)突起形成等過程[15-16]。近年研究顯示，APPL1具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，在心肌缺氧復(fù)氧損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，沉默APPL1基因可以逆轉(zhuǎn)球狀脂聯(lián)素對心肌纖維化的抑制作用，另外，APPL1還參與心力衰竭和糖尿病心肌病損傷過程[6, 7, 17-18]。本實驗結(jié)果顯示，LPS降低心肌細(xì)胞中APPL1的表達(dá)，過表達(dá)APPL1可以抑制LPS對心肌細(xì)胞凋亡促進(jìn)和活力抑制作用，這說明APPL1能夠減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，這與上述研究報道結(jié)果類似。

心肌細(xì)胞氧化損傷存在于多種原因誘導(dǎo)的心肌損傷中，例如：糖尿病心肌病、心肌肥大、動脈粥樣硬化和膿毒癥心肌損傷等[19-20]。氧自由基能夠被機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶降解，從而使機(jī)體內(nèi)氧自由基處于動態(tài)平衡狀態(tài)[21]。SOD和GSH-Px是存在于人體組織中的抗氧化酶，二者活性降低后是細(xì)胞氧化損傷發(fā)生的標(biāo)志[22]。細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基可以引起存在于細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性受到破壞，使存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放至細(xì)胞外，而MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。另外，細(xì)胞內(nèi)過量的ROS可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)caspase凋亡反應(yīng)激活，促進(jìn)下游凋亡執(zhí)行因子caspase-3的活化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[23-24]。本實驗表明，過表達(dá)APPL1后的心肌細(xì)胞中ROS水平降低，細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性升高，細(xì)胞生成的MDA水平也降低，細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)液中LDH水平降低，細(xì)胞中活化的caspase-3蛋白水平降低，說明過表達(dá)APPL1可以減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，提高心肌細(xì)胞中抗氧化酶活性，減少細(xì)胞凋亡，表明APPL1可能通過減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，APPL1在心肌組織損傷中可能發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，APPL1參與LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)生，過表達(dá)APPL1可以減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷和凋亡，這對于研究APPL1在心血管系統(tǒng)疾病中的作用具有意義，為研究感染誘導(dǎo)的心肌損傷發(fā)生機(jī)制提供了參考。另外，本次實驗研究沒有在原代心肌細(xì)胞和體內(nèi)進(jìn)行驗證，對于其具體的靶向作用機(jī)制仍不清楚，在以后的實驗中會對上述部分內(nèi)容進(jìn)行探討。