蛋白酶體α6亞單位基因1233A/T位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系

何芳梅，任春曉，宋春霞，高惠霞，王晶晶

1.陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院康復(fù)美容教研室，陜西西安市712000；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安市710077

泛素蛋白酶體系(ubiquitin-proteasome system,UPS)參與動(dòng)脈粥樣硬化全過(guò)程的調(diào)節(jié)[1]，所以UPS的基因多態(tài)性可能增加動(dòng)脈粥樣硬化和腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)。蛋白酶體α6亞單位(proteasome subunitαtype 6,PSMA6)是該體系的一個(gè)重要成分，已有許多研究發(fā)現(xiàn)PSMA6基因-8C/G位點(diǎn)(rs1048990)與冠心病、心肌梗死、糖尿病、頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度和腦卒中等相關(guān)[2-5]。而對(duì)于該基因的其他位點(diǎn)，目前研究卻很少。由于啟動(dòng)子可通過(guò)影響基因表達(dá)的起始時(shí)間和程度等因素，而在基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用，故本文對(duì)該基因啟動(dòng)子1233A/T位點(diǎn)的多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012年1月至2015年4月，收集西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者，均符合第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)臨床及CT和/或MRI確診。共納入病例組211例，其中男性120例，女性91例；年齡37～82歲，平均(67.6±7.2)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病程在1周內(nèi)；②漢族。

排除標(biāo)準(zhǔn)：心臟源性腦栓塞(房顫、心瓣膜病、心肌梗死、二尖瓣脫垂、心臟粘液瘤)、腔隙性腦卒中、動(dòng)脈炎、外傷、血液病、腫瘤、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤以及藥物等其他原因引起的腦梗死。

取同期該院健康體檢者作為對(duì)照組，均為漢族，共201例，其中男性112例，女性89例，年齡36～80歲，平均(66.4±9.0)歲；均無(wú)腦卒中史，并經(jīng)過(guò)臨床檢查和/或影像學(xué)檢查排除腦卒中。

兩組性別和年齡均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。所有標(biāo)本的收集均經(jīng)患者本人或其家屬同意，并經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審核同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 血樣本的收集及全血基因組DNA的提取

取早晨空腹靜脈血5 ml，3.8%檸檬酸鈉抗凝，用碘化鉀法提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物及限制性內(nèi)切酶的設(shè)計(jì)

根據(jù)PSMA6基因1233A/T位點(diǎn)(DNA序列號(hào)NC_000014.9)及其兩側(cè)DNA序列，用NEBcutterV2.0(http：//tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶，該位點(diǎn)合適的限制性內(nèi)切酶為MspI(MBI公司)。應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行PCR引物序列設(shè)計(jì)，其評(píng)分不低于80分，包含實(shí)驗(yàn)研究的酶切位點(diǎn)并利于酶切結(jié)果分析的引物，并參考通用教材《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》中引物設(shè)計(jì)原則。引物由上海生工公司合成。

上 游 引 物 ： 5′-TAA ATG GGA GTG TGC CTT GG-3′

下 游 引 物 ： 5′-CAG GAG ATC CAG GTT GCA GT-3′

1.2.3 基因分型

PCR反應(yīng)體系為15.0μl。其中包括10×Buffer 1.5 μl、dNTP(10 mmol/L)0.3 μl、上下游引物(50 pmol/μl)各 0.2 μl、基因組 DNA 0.5 μl、Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.1 μl、MgCl21.2 μl、dH2O 11.0 μl。

PCR反應(yīng)條件：95℃熱變性5 min，95℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃40 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min，終止反應(yīng)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10.0 μL、MspI酶0.1 μl、dH2O 3.4 μl及10×Buffer R 1.5 μl，使總體系為15.0μl。37℃酶切7 h。然后行瓊脂糖凝膠電泳，150 V電泳0.5 h，觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。兩組間性別比例差異采用χ2檢驗(yàn)，年齡以(xˉ±s)表示，差異采用t檢驗(yàn)?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算、Hardy-Weinburg平衡吻合度檢測(cè)，基因型和等位基因間差異的統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PSMA6基因1233A/T位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

含有PSMA6基因1233A/T位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物是191 bp，經(jīng)MspI酶消化后產(chǎn)生兩個(gè)片段分別是132 bp和59 bp。雜合子CT基因型則有三個(gè)片段，分別為191 bp、132 bp和59 bp，純合子TT基因型則只有一個(gè)片斷大小191 bp，純合子CC基因型有2個(gè)片斷大小：132 bp和59 bp。見(jiàn)圖1。

圖1 Msp I酶酶切PSMA6基因1233A/T位點(diǎn)擴(kuò)增片段后產(chǎn)物電泳圖

2.2 Hardy-Weinburg平衡吻合度檢驗(yàn)

兩組人群的PSMA6基因1233A/T位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡(P＞0.05)。表明該多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布在所研究的人群中達(dá)到了遺傳平衡，具有群體代表性。見(jiàn)表2。

表2 PSMA6基因1233A/T位點(diǎn)基因型分布在兩組人群中的Hardy-Weinburg平衡吻合度檢驗(yàn)

2.3 PSMA6基因1233A/T位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率

兩組CC、CT+TT基因型頻率及C、T等位基因頻率均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 PSMA6基因1233A/T位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性[n(%)]

性別分層后，在男性中，兩組CC(χ2=2.685,P=0.199)、CT(χ2=1.273,P=0.064)、TT(χ2=1.425,P=0.676)基因型頻率及C等位基因(χ2=1.876,P=0.396)頻率均無(wú)顯著性差異；在女性中，兩組CC(χ2=1.975,P=0.366)、CT(χ2=2.735,P=0.222)、TT(χ2=2.457,P=0.387)基因型頻率及C等位基因(χ2=0.675,P=0.818)頻率均無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表4。

3 討論

UPS是體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的重要因素。許多研究顯示UPS通過(guò)多種途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控。首先，核因子 κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)可以調(diào)節(jié)參與動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)，降解炎癥基因的阻滯子——IκB蛋白[1-6]。UPS可增加NF-κB活性。其次，增加的氧化應(yīng)激是動(dòng)脈粥樣硬化重要的病理生理事件，UPS通過(guò)Nrf2在內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。再次，泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的重要成分。通過(guò)促凋亡分子，UPS可以明顯促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。而對(duì)于這些細(xì)胞的退化，也需要一個(gè)有功能的UPS。最后UPS還參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中細(xì)胞死亡的分子調(diào)控[7]。

臨床研究也提示泛素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Divald等[1,8-9]對(duì)25例心肌梗死患者進(jìn)行尸檢，通過(guò)免疫組化和半定量分階段測(cè)量等方法，發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，泛素水平更高；在冠狀動(dòng)脈新生內(nèi)膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)泛素與平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白共存。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，還發(fā)現(xiàn)藥物阻滯泛素蛋白酶通路后，通過(guò)激活NF-κB，可以明顯減弱腦梗死和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[2,10]。

表4 1233A/T位點(diǎn)基因型及等位基因頻率與不同性別腦梗死的相關(guān)性

真核細(xì)胞內(nèi)的26S蛋白酶體是UPS的重要成分，其核心是一個(gè)20S的催化顆粒，后者由α環(huán)和β環(huán)組成。人類(lèi)的PSMA6基因編碼蛋白酶體α環(huán)的α6亞單位。因?yàn)閁PS與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，因此PSMA6基因的改變將影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

已有許多研究顯示PSMA6基因與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、2型糖尿病和心肌梗死相關(guān)[2,11-12]，有理由相信它也與缺血性腦卒中相關(guān)[13]。

Freilinger等[14]對(duì)601例德國(guó)缺血性腦卒中患者和736例對(duì)照者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因-8C/G位點(diǎn)與缺血性腦卒中整體和大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中均呈相關(guān)性，GG基因型具有保護(hù)作用。Savchuk等[15]對(duì)102例烏克蘭缺血性腦卒中患者和92例對(duì)照者運(yùn)用實(shí)時(shí)PCR方法進(jìn)行PSMA6基因-8C/G位點(diǎn)的基因型分型，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因-8G/G突變體與復(fù)發(fā)性缺血性腦卒中相關(guān)。Alsmadi等[16]在1071例沙特阿拉伯冠心病患者和929例對(duì)照者組成的研究對(duì)象中，通過(guò)分子信標(biāo)為基礎(chǔ)的基因分型分析的方法，對(duì)包括KIAA0391和PSMA6在內(nèi)的染色體區(qū)域14q13.2的5個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)單倍體型，即1A-2G-3C-4A-5A和1A-2G-3G-4A-5A增加冠心病和心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)。

趙西耀等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，PSMA6基因rs17458312位點(diǎn)可能與腦梗死的發(fā)病無(wú)關(guān)，PSMA6基因rs1048990位點(diǎn)可能與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病不相關(guān)，但P值接近有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，值得進(jìn)一步研究。Zemeckiene等[19]研究發(fā)現(xiàn)在男性受試者中，CG PSMA6 rs1048990基因型在哮喘患者中顯著高于對(duì)照組。羅冬[20]研究發(fā)現(xiàn)PSMA6-8C/G位點(diǎn)的多態(tài)性可能不是湖南漢族人群腦卒中發(fā)病的遺傳易感因素。Heckman等[21]研究發(fā)現(xiàn)在隱性模型下，PSMA6(-C8G)基因多態(tài)性可能對(duì)缺血性腦梗死起保護(hù)作用。需要進(jìn)一步的前瞻性大規(guī)模流行病學(xué)研究來(lái)證實(shí)不同人群中的這些發(fā)現(xiàn)。

Kakumu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PSMA6的沉默可誘導(dǎo)癌細(xì)胞系的凋亡或G2/M細(xì)胞周期阻滯，但不能誘導(dǎo)永生化正常肺細(xì)胞系的凋亡或G2/M細(xì)胞周期阻滯。這些結(jié)果提示，PSMA6是肺癌有吸引力的靶點(diǎn)，具有較高的治療指數(shù)。Buraczynska等[23]證實(shí)PSMA6多態(tài)性可能是終末期腎病的保護(hù)因素。另一方面，在終末期腎病患者中，CG+GG基因型與左心室肥厚獨(dú)立相關(guān)。Tamasauskiene等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在立陶宛受試者中，盡管他們的蛋白酶體多態(tài)性類(lèi)型不同，但預(yù)計(jì)哮喘的發(fā)生頻率相同；然而，其中rs1048990 CG基因型在哮喘男性中更為普遍。常見(jiàn)的基因型多態(tài)性與嗜酸性哮喘表型有關(guān)。綜上所述，針對(duì)PSMA6基因多態(tài)性，已有很多研究者從不同角度進(jìn)行研究。因此，它的基因多態(tài)性與腦梗死之間的關(guān)系有待更深一步、更大規(guī)模的研究。

Sjakste等[25]研究發(fā)現(xiàn) 1233(內(nèi)含子1 1233 A/T)位點(diǎn)的多態(tài)性與心肌梗死相關(guān)。崔少楠等[26]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因第4內(nèi)含子a等位基因可能是冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張癥發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但有關(guān)該位點(diǎn)的研究，目前國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。內(nèi)含子的功能現(xiàn)在還沒(méi)有完全被探究清楚，但有研究顯示可能與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)，比如在切除一些內(nèi)含子之后某些基因無(wú)法表達(dá)或者錯(cuò)誤表達(dá)；內(nèi)含子對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄具有某種調(diào)控作用，比如增強(qiáng)作用或者影響蛋白質(zhì)的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，CC、CT、TT基因型及C等位基因頻率分布在兩組中比較無(wú)顯著性差異。性別分層后，各亞組各基因型及等位基因頻率亦均無(wú)顯著性差異。故該位點(diǎn)可能與中國(guó)漢族人群腦梗死的發(fā)病無(wú)關(guān)。目前的研究樣本量不夠大，同時(shí)存在抽樣誤差，群體代表性不完全，且可能存在遺傳、種族和環(huán)境因素等作用，該基因型是否與腦梗死發(fā)病相關(guān)，還需通過(guò)加大樣本量，進(jìn)行多中心、不同種族的研究。