大鯢希瓦氏菌的分離鑒定及其病理學觀察

牛樹輝，陳夢飛，呂帥飛，李聲平，楊紅飛，高小蟬

(河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471023)

大鯢(Andriasdavidianus)俗稱娃娃魚，隸屬于隱鰓鯢科大鯢屬，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動物，也是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖物種。大鯢肉質鮮嫩、味道鮮美，富含優(yōu)質蛋白質，具有很高的營養(yǎng)價值，同時還是一種名貴的傳統(tǒng)藥材。近年來，隨著大鯢人工養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴大，在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)了很多問題，其中疾病是影響大鯢規(guī)?；B(yǎng)殖的主要難題。細菌性病原是大鯢疾病的主要病原之一，給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，極大地影響了大鯢養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。但是由于大鯢養(yǎng)殖范圍的局限性，大鯢細菌性病原的生物學基礎研究相對滯后。近年來，一些與大鯢病害相關的細菌性病原陸續(xù)被分離出來，包括嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[1-3]、Ⅰ-型熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)[4]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[5]、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)[6]、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[7]、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)[8]和遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)[9]等。

希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)作為一種革蘭氏陰性菌，隸屬于弧菌科(Vibrionaceae)，目前已從水生環(huán)境、沉淀物、石油環(huán)境及冷藏食品中分離到20多株[10-11]。此外，希瓦氏菌也是多種水生動物的細菌性病原，其宿主不僅包括半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevisgunther)、大菱鲆(Psettamaxima)、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[12]、東風螺(Babylonia)[13-14]、海馬(Hippocampus)[15]、大黃魚(Pseudosciaenacrocer)[16]等海水養(yǎng)殖動物，還包括鯉魚(Cyprinuscarpio)[17]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[18]、烏蘇里擬鲿(Pseudobagrusussuriensis)[19]等淡水養(yǎng)殖動物。近年來，其宿主范圍不斷擴大，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重威脅，但目前尚未有希瓦氏菌作為兩棲類動物病原的相關報道。

本研究利用平板劃線法從患病大鯢中進行細菌分離，對分離菌進行革蘭氏染色、透射電鏡觀察、16S rDNA序列鑒定、人工感染及藥敏試驗分析，并對患病大鯢進行病理學觀察，為大鯢疾病的防治奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試動物 患病大鯢(體長為10～15 cm)由河南省洛陽市欒川縣某大鯢養(yǎng)殖廠提供，健康大鯢由河南華鯢生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 PCR引物合成及序列測定由生工生物工程股份有限公司完成；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、溶菌酶、DNA分子質量標準、TaqDNA聚合酶、dNTP均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Transgene公司；胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、瓊脂、磷鎢酸(Phosphotungstic acid，PTA)均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋購自常州朗越儀器制造有限公司；培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器制造公司；輪轉式切片機購自浙江金華科迪儀器設備有限公司；PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；透射電鏡購自日本JEOL公司。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)、革蘭氏染色及鏡檢

從患病大鯢中選取癥狀典型的瀕死大鯢，用75%乙醇對大鯢體表進行消毒，在超凈工作臺中取出一小塊肝臟和脾臟組織，研磨后分別在普通LB培養(yǎng)基平板上進行劃線，并于37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)基本一致的單菌落，再進行3次劃線培養(yǎng)，獲得純化的病原分離菌株。將分離到的各菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)后，一部分加甘油于-80 ℃保存?zhèn)溆肹20]，另一部分進行革蘭氏染色并置于顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)。

1.3 分離病原菌的基因組DNA提取及16S rDNA序列的PCR擴增

依照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取分離病原菌的基因組DNA。設計的16S rDNA通用引物為16S rDNA-F：5′-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3′；16S rDNA-R：5′-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3′，預計擴增片段長度為1 459 bp。以各分離病原菌株的基因組DNA為模板，以16S rDNA-F/R為引物進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL,ddH2O 17 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物并送測序。

將測序結果用BLAST軟件在NCBI上進行同源性搜索，然后分別用Clustal 1.83軟件和MEGA 5.0軟件進行序列對比并繪制系統(tǒng)進化樹[21]。

1.4 分離病原菌培養(yǎng)基的初步優(yōu)化

首先，分別以牛肉膏、葡萄糖、蔗糖作為菌株培養(yǎng)的唯一碳源，分別以蛋白胨、酵母粉和胰蛋白胨作為菌株培養(yǎng)的唯一氮源，分別以NaCl、MgSO4、K2SO4作為菌株培養(yǎng)的唯一無機鹽；固定添加0.4%碳源、1.0%氮源、0.4%無機鹽的基礎LB液體培養(yǎng)基作為分離病原菌的培養(yǎng)基，并調整其pH值為7；然后接種5%分離病原菌于配制好的培養(yǎng)基中，37 ℃分別振蕩培養(yǎng)24、36、48 h后測定OD600值，結合不同碳源、氮源、無機鹽條件下分離病原菌的生長情況，選擇出最適碳源、氮源、無機鹽。其次，在確定最適碳源、氮源、無機鹽后，通過調整其濃度并測定分離病原菌的生長情況，篩選出最適的碳源、氮源、無機鹽的濃度。

1.5 分離病原菌的電鏡觀察

將覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)(孔徑113 μm)粘在載玻片的雙面膠上，正面朝上，分別取5 μL分離病原菌懸液樣品滴至銅網(wǎng)上，于室溫放置10 min后用濾紙吸去多余懸液。將銅網(wǎng)正面朝上置于蠟板上，滴加一滴2%的PTA后，避光染色3～4 min，再用濾紙吸去多余染液，晾干后進行電鏡觀察并拍照。

1.6 分離病原菌人工感染大鯢

取保存的分離病原菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，進行離心后重懸，參照MCFARLAND比濁法利用PBS將菌液濃度調整為1×108cfu/mL。

將健康大鯢先于室內暫養(yǎng)7 d，水溫控制在(15±2)℃。然后將其隨機分為2組，每組6尾，水溫控制在(28±2)℃，分別對試驗組每尾大鯢肌肉注射0.5 mL分離病原菌懸液，分別對對照組每尾大鯢肌肉注射等體積的PBS。分離病原菌的人工感染試驗期間不進行投喂，每天換水一次，密切觀察發(fā)病情況，并從瀕臨死亡的大鯢中分離病原菌。

1.7 分離病原菌的藥敏試驗

采用紙片擴散法(K-B法)進行藥敏試驗。取100 mL新鮮菌懸液(濃度約1×107cfu/mL)均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將直徑6 mm的藥敏紙片(甲砜霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、復方新諾明、多西環(huán)素、乳酸諾氟沙星、四黃抗毒、磺胺二甲氧嘧啶鈉、硫氰酸紅霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、保肝解毒寧、鹽酸黃連素)均勻平貼在平板上，設3個重復。37 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。參照文獻[22]進行結果判定，將抑菌圈直徑在20 mm以上判定為極度敏感(E)、在15～20 mm判定為高度敏感(S)、在10～15 mm判定為中度敏感(I)、小于10 mm的判定為不敏感(R)。

1.8 患病大鯢組織病理學觀察

取健康及患病瀕死大鯢的肝臟、脾臟、腎臟和肺臟組織，經(jīng)苦味酸固定液固定后，再經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化、烤片、HE染色、封片等步驟最終制成組織切片，然后置于顯微鏡下觀察各組織病理變化[23]。

2 結果與分析

2.1 患病大鯢的臨床癥狀觀察及剖檢病理變化

患病大鯢體表黏液脫落，頭部出現(xiàn)綠豆大小的白點或成片的白斑區(qū)域，腹部潰爛，四肢嚴重腫大、出血，皮膚有潰瘍，部分趾甚至脫落，尾部潰爛。

剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，患病大鯢腸內無食，腸胃之間有粘連，內有血絲和黃色黏液；肝臟明顯腫大、充血或呈灰白色，甚至嚴重變形；膽呈黃色，腎臟腫大，脾臟出血甚至嚴重潰爛，部分肝臟和脾臟粘連，肺臟萎縮。

2.2 大鯢病原菌的分離與革蘭氏染色

通過平板劃線法共分離到5株大鯢的病原菌，包括肝臟中2株、脾臟中1株和腸中2株，分別編號為LY1—LY5。分離到的5株大鯢病原菌在LB平板上的菌體形態(tài)相似，均為表面光滑、邊緣整齊、稍微隆起的圓形不透明的淡黃色菌落。對大鯢的病原菌進行革蘭氏染色后通過鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，菌株LY1—LY5的菌落形態(tài)一致，均呈紅色、桿菌，因此均為革蘭氏陰性桿菌。

2.3 大鯢病原菌的16S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

如圖1所示，PCR擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在1 500 bp左右有1條目的條帶，與預期大小(1 459 bp)一致。從GenBank中選取最相似菌株的16S rDNA序列，與分離病原菌的測序結果進行序列比對，結果表明，大鯢分離病原菌株LY1—LY5的16S rDNA序列與希瓦氏菌的序列相似度高達99%，則分離病原菌株LY1—LY5為希瓦氏菌。同時，選擇其中序列最長的分離病原菌株LY3作為代表株進行后續(xù)研究。由圖2可知，在構建的大鯢分離病原菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹中，菌株LY3與希瓦氏菌(Shewanellasp. NF20111223D，登錄號：KC916743.1)同源性最高，親緣關系最近。

M：DNA分子質量標準；C：陰性對照；

2.4 不同碳源、氮源以及無機鹽的種類和添加量對大鯢分離病原菌生長的影響

由圖3A可知，在培養(yǎng)24、36、48 h，選擇蔗糖作為大鯢分離病原菌株生長的唯一碳源時，菌體生長最好，當固定牛肉膏和葡萄糖作為唯一碳源時，大鯢分離病原菌的生長相對較弱，因此選擇蔗糖作為其生長培養(yǎng)基中的唯一碳源。由圖3B可知，當蔗糖的添加量為0.3%時，菌體生長最佳。由圖3C可知，在培養(yǎng)24、36、48 h，選擇酵母粉作為大鯢分離病原菌株生長的唯一氮源時，菌體生長最好，而選擇蛋白胨和胰蛋白胨作為唯一氮源時，菌體生長相對較弱，因此,選擇酵母粉作為大鯢分離病原菌株生長培養(yǎng)基中的唯一氮源。如圖3D所示，當酵母粉的添加量為1.2%時，菌體生長最佳。如圖3E所示，在培養(yǎng)24、36、48 h，選擇MgSO4作為大鯢分離病原菌株生長的唯一無機鹽時，菌體生長最好，而當NaCl和K2SO4作為唯一無機鹽時，菌體生長相對較弱，因此選擇MgSO4作為菌體生長培養(yǎng)基中的無機鹽。如圖3F所示，當MgSO4的添加量為0.6%時，菌體生長最佳。

圖2 大鯢分離病原菌株LY3的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 16S rDNA phylogenetic tree of isolated bacterial strain

A：大鯢分離病原菌LY3在添加不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、36、48 h后的生長情況；B：不同蔗糖添加量下大鯢分離病原菌的生長情況；

2.5 大鯢分離病原菌株LY3的透射電鏡觀察

如圖4所示，經(jīng)PTA負染后，在透射電鏡下觀察，大鯢分離病原菌株LY3均呈桿狀，兩端鈍圓。

圖4 分離菌株LY3的透射電鏡圖片F(xiàn)ig.4 Transmission electron micrograph of strain LY3

2.6 大鯢分離病原菌株LY3的人工感染試驗結果

利用分離病原菌株LY3進行人工感染12 h后，大鯢表現(xiàn)為食欲減退且體表黏液開始脫落；人工感染60 h后，大鯢的四肢腫大并伴有出血，同時頭部出現(xiàn)白點和潰瘍，隨后白點和潰瘍在全身進一步擴大；人工感染72 h時，有4只大鯢死亡，至140 h時被感染大鯢全部死亡。對死亡大鯢進行剖檢發(fā)現(xiàn)，其肝臟、脾臟均發(fā)生出血、腫大，同時還出現(xiàn)腎臟腫大，肺萎縮，腸內有黃色黏液等癥狀，與自然發(fā)病癥狀基本相同。而從人工感染發(fā)病死亡大鯢的肝臟和脾臟處分離到的病原菌經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢結果與自然分離的大鯢病原菌株LY3的形態(tài)一致，表明LY3是大鯢的致病菌。

2.7 大鯢分離病原菌株LY3的藥敏試驗結果

如表1所示，通過藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，大鯢分離病原菌株LY3對恩諾沙星極度敏感，對氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶鈉、乳酸諾氟沙星、硫氰酸紅霉素高度敏感，對復方磺胺甲噁唑粉(復方新諾明)、甲砜霉素、磺胺二甲氧嘧啶鈉、四黃抗毒、多西環(huán)素、保肝解毒寧中度敏感，對鹽酸黃連素耐藥。

2.8 患病大鯢組織病理學觀察

由圖5所示，對照組健康大鯢的肝臟切片中肝臟細胞呈多角形，細胞緊密排列，細胞邊界明顯，組織被肝竇分成很多肝小葉；而感染組患病大鯢的肝臟組織空泡化嚴重，細胞渾濁，肝小葉間界限不分明，肝板排列紊亂。對照組健康大鯢的脾組織中紅髓和白髓分界清楚，脾細胞均勻排列；感染組患病大鯢的脾臟組織中紅髓和白髓分界不清楚，大量的嗜酸性細胞堆集，有大量褐色顆粒出現(xiàn)，多數(shù)細胞核溶解，出現(xiàn)大量空泡樣變的細胞。對照組健康大鯢的腎臟組織中髓質、腎小管結構清晰，近曲小管和腎小管邊界清晰，細胞均勻排列，細胞核居中，有些囊腔中出現(xiàn)蛋白質分泌物，腎小球細胞核居中排列；感染組患病大鯢的腎組織壞死，腎小管和腎小球結構破壞，腎小囊溶解壞死，腎小管裂解，細胞邊界不清晰，有些細胞核消失，在管腔中有大量炎性細胞浸潤。對照組健康大鯢的肺組織中肺泡管、肺泡囊和肺泡結構清晰，細胞排列均勻；感染組患病大鯢的肺組織中細胞核堆集，細胞排列紊亂，肺泡囊不明顯，組織纖維化。

表1 大鯢分離病原菌株LY3對水產(chǎn)常用藥物的敏感性試驗分析Tab.1 Analysis of drug-sensitivity test of isolated bacterial strain LY3 from Andrias davidianus

注：E(極度敏感)：抑菌圈直徑>20 mm；S(高敏)：15 mm≤抑菌圈直徑≤20 mm；I(中敏)：10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm；R(耐藥)：抑菌圈直徑<10 mm。

Note: E(Extremely sensitive): Inhibition zone diameter>20 mm; S(Highly sensitive): 15 mm≤Inhibition zone diameter≤20 mm; I(Moderately sensitive): 10 mm≤Inhibition zone diameter<15 mm; R(Resistant): Inhibition zone diameter<10 mm.

圖5 大鯢感染前后不同組織切片的比較病理學分析Fig.5 Comparative analysis of histopathological features of different issues from healthy giant salamander and Shewanella xiamenensis-infected giant salamander

3 結論與討論

目前報道的希瓦氏菌主要是從水生環(huán)境或沉淀物中分離得到，另有少數(shù)腐敗希瓦氏菌是從冷藏的魚類中分離得到[10,24]，但關于其作為細菌性病原的研究較少。有研究表明，希瓦氏菌作為條件致病菌能夠感染多種水生動物，可致大黃魚體側、腹部、鰭基、下頜、鰓蓋等發(fā)紅，使異育銀鯽的腹部出血、膨大，引起烏蘇里擬鲿體表潰瘍癥，還能夠引起泥鰍的腹部和肛門處出現(xiàn)明顯紅點和紅斑。本研究從大鯢中首次分離到希瓦氏菌，被該病原菌感染后的大鯢可產(chǎn)生皮膚潰瘍、出血等癥狀，且利用分離出的病原菌進行人工感染后的大鯢癥狀與自然發(fā)病大鯢癥狀基本相同，并且從人工感染大鯢中分離出的菌株與自然發(fā)病大鯢體內分離出的菌株形態(tài)相同。

近年來，藥敏試驗廣泛應用于水產(chǎn)動物病害的檢測，但主要是采用獸用藥敏紙片進行，少有以水產(chǎn)動物專用藥敏紙片進行的藥敏試驗，使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖實際應用中存在很大的局限性[25]。賈春紅等[13]測定了3株方斑東風螺的病原希瓦氏菌對35種常用抗菌藥物的敏感性，其中腐敗希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌對復方新諾明敏感[16]。秦蕾等[12]從異育銀鯽中分離到的腐敗希瓦氏菌對氟苯尼考、恩諾沙星等敏感。林鋒等[18]分離的泥鰍源希瓦氏菌對復方新諾明、四環(huán)素等高度敏感。本研究結果顯示，分離出的大鯢希瓦氏菌LY3對恩諾沙星的敏感性最強，對氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶鈉、乳酸諾氟沙星和硫氰酸紅霉素次之，與秦蕾等[12]的報道有相似性，與賈春紅等[13]和林鋒等[18]的報道不同，推測可能是由于不同種類水生動物的希瓦氏菌對抗生素的敏感性不同。

針對水生動物細菌性疾病治療，水產(chǎn)養(yǎng)殖一直依賴消毒劑和抗生素，但近年來抗生素在水產(chǎn)品領域產(chǎn)生諸多負面影響。中草藥、中草藥提取物甚至中藥復合制劑憑借其毒副作用小、不易引發(fā)耐藥性等特點，得到日益廣泛的重視與研究，如五倍子、黃芩、五味子、苦地膽、黃連、大黃等對黃顙魚溫和氣單胞菌的抗菌效果較好[26]，五倍子、穿心蓮、楊樹花組成的復方對黃鱔源嗜水氣單胞菌的抑菌效果較好[27]。本研究中用到3種水產(chǎn)類常用的中藥制劑(鹽酸黃連素、四黃抗毒和保肝解毒寧)，其中四黃抗毒和保肝解毒寧對大鯢希瓦氏菌有一定的抑制作用，但效果均不理想，可能是由于中藥制劑與抗生素的作用機制不同，相比之下中藥制劑更適于調節(jié)動物機體的免疫功能。

綜上所述，本研究中引起大鯢患病的病原為希瓦氏菌，該菌株引起的大鯢疾病可用恩諾沙星進行治療。本研究為大鯢的養(yǎng)殖管理提供了參考，并為同批次大鯢的治療提供了可靠的依據(jù)。