胃癌合并幽門螺桿菌感染患者CYP2C19基因型與其預(yù)后的關(guān)系分析

張海梅，張嘉剛，楊世榮，戚利坤

胃癌是我國最常見的外科惡性腫瘤，發(fā)病率較高，居各類腫瘤之首?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生有很大的遺傳相關(guān)性，臨床主要表現(xiàn)為上消化道出血、穿孔等癥狀[1]。目前的研究表明，與惡性腫瘤相關(guān)的CYP2C19基因是由人細(xì)胞色素P450超家族基因編碼的同工酶的亞型[2]。該酶主要存在于肝細(xì)胞微粒體中，與質(zhì)子泵抑制劑代謝密切相關(guān)，因此是胃癌的發(fā)生中重要的環(huán)節(jié)[3]。CYP2C19成為一個(gè)重要的致病因素，首先可激活前致癌物，其次又可提高致癌物基因決定的易感性，但目前具體的機(jī)制尚不明確。進(jìn)一步有臨床數(shù)據(jù)顯示，CYP2C19基因多態(tài)性與多種惡性腫瘤相關(guān)，如前列腺癌、肝癌、乳腺癌和肺癌等[4-5]，推測CYP2C19基因與胃癌發(fā)生關(guān)系密切。文獻(xiàn)中關(guān)于胃癌合并幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染患者CYP2C19基因型與其預(yù)后的關(guān)系的研究尚未見報(bào)道，因此本研究中選取胃癌合并H.pylori感染并行遠(yuǎn)端胃切除術(shù)患者50例為觀察組，選擇50例未感染H.pylori的遠(yuǎn)端胃切除術(shù)胃癌患者作為對照組，討論胃癌合并H.pylori感染患者CYP2C19基因型與其預(yù)后的關(guān)系，為明確胃癌的診斷及預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取2014年1月至2016年10月青海省第五人民醫(yī)院收治的胃癌合并H.pylori感染并且進(jìn)行遠(yuǎn)端胃切除手術(shù)的患者50例為對照組，同時(shí)選取胃癌未合并H.pylori感染并且進(jìn)行遠(yuǎn)端胃切除手術(shù)的患者50例為觀察組。本項(xiàng)臨床研究由青海省第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均了解試驗(yàn)項(xiàng)目并簽署了知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)臨床癥狀、病史、介入檢測、影像學(xué)檢測或病理學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查等證實(shí)符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且觀察組患者證實(shí)有H.pylori感染，并行遠(yuǎn)端胃切除術(shù)治療；②無其他器質(zhì)性疾?。虎蹮o血液系統(tǒng)等其他系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有肺實(shí)質(zhì)病變?nèi)缰夤芟?、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等疾病和間質(zhì)性肺疾病等肺部疾病；②有除胃癌外的其他惡性腫瘤及胃癌轉(zhuǎn)移性腫瘤：③合并有血液、泌尿系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；④術(shù)后1年無法配合研究或中途退出研究的患者。觀察組男性28例，女性22例，年齡(71±2.7)歲；對照組男性30例，女性20例，年齡(70±3.2)歲，納入研究對象的性別和年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由表1可知，兩組研究對象的病程分期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明兩組具有可比性。

表1 兩組研究對象的一般資料

1.2 CYP2C19基因型檢測

1.2.1 清晨空腹抽取患者外周血2 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存。采用TIANamp Blood DNA Kit(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。

1.2.2 PCR引物 PCR引物設(shè)計(jì) CYP2C19基因外顯子4突變型(*3)和CYP2C19基因外顯子5突變型(*2)的上下游引物設(shè)計(jì)見表2。

表2 CYP2C19基因外顯子突變型的上下游引物設(shè)計(jì)

1.2.3 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)檢測CYP2C19基因型步驟如下：①PCR擴(kuò)增：在PCR板中．每孔加入4 μL PCR mix和1 μL DNA，薄膜封閉，混勻，低速離心機(jī)(4 000 r/min)離心2 min后上機(jī)(PCR儀器)進(jìn)行循環(huán)，循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸，4 ℃保存。②使用限制性內(nèi)切酶對產(chǎn)物進(jìn)行酶切，過夜，3%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果分析。

1.2.4 質(zhì)譜檢測將準(zhǔn)備好的樣本加入到樣本板中，再放入MassArray點(diǎn)樣儀。接著將點(diǎn)好樣本的芯片放入MassArray質(zhì)譜儀，進(jìn)行質(zhì)譜檢測，最后在數(shù)據(jù)服務(wù)器上通過Typer 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.3 DAGCS32得分

在術(shù)后一年對患者進(jìn)行電話隨訪，根據(jù)文獻(xiàn)采用胃癌切除術(shù)后評分系統(tǒng)(dysfunction after gastric cancer surgery 32, DAGCS32)[6]對患者反饋的與術(shù)后功能障礙相關(guān)的32項(xiàng)信息進(jìn)行1(無)到5(非常嚴(yán)重)評分，分?jǐn)?shù)越高表示功能障礙越嚴(yán)重。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 基因分型

基因型檢測結(jié)果表明，CYP2C19*2基因和CYP2C19*3基因均分為3型，其中2位點(diǎn)基因均為GG的為純合子快代謝型，GG+GA、GG+AA和GA+GA均為雜合子快代謝型，GA+AA和AA+AA為慢代謝型，結(jié)果見表3和圖1。

表3 CYP2C19基因分型結(jié)果

圖1CYP2C19*2基因分型 圖a是CYP2C19*2 的 AA 基因型典型質(zhì)譜圖;圖b是CYP2C19*2 的 GG 基因型典型質(zhì)譜圖;圖c是CYP2C19*2 的 GA 基因型典型質(zhì)譜圖;圖d是CYP2C19*3 的 GG 基因型典型質(zhì)譜圖;圖e是CYP2C19*3 的 GA 基因型典型質(zhì)譜圖;圖f CYP2C19 基因型 PCR-RFLP 電泳圖, M：50 bp Marker，1：PCR 產(chǎn)物，2：*1/*1型，3：*1/*2型，4：*2/*2型,5：*1/*3型，6：*3/*3型

2.2 基因型分布

兩組CYP2C19基因的純合子快代謝型、雜合子快代謝型和慢代謝型發(fā)生率見表4。純合子代謝型在觀察組的發(fā)生率(32%)和對照組的發(fā)生率(42%)進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雜合子快代謝型在觀察組的發(fā)生率(40%)和對照組的發(fā)生率(46%)進(jìn)行比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而慢代謝型在觀察組的發(fā)生率(28%)和對照組的發(fā)生率(12%)比較，觀察組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 兩組CYP2C19代謝類型構(gòu)成比較[n(%)]

2.3 遠(yuǎn)端切除術(shù)

一年后,兩組中純合子快代謝型、雜合子快代謝與慢代謝型患者DAGCS32得分相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表5。

表5 兩組不同CYP2C19代謝類型患者DAGCS32得分分)

3 討論

在我國，胃癌是最常見的外科惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，治愈性差，預(yù)后差，病因復(fù)雜，迄今尚未完全闡明[7-8]。研究資料表明,胃癌的發(fā)生與多種因素相關(guān)，包括長期吸煙或酗酒，飲食習(xí)慣不良，長期與硫酸塵霧接觸等，是多種因素綜合作用的結(jié)果[9-10]。同時(shí)，研究表明，H.pylori是胃癌發(fā)生重要因素之一[11-14]。H.pylori具有較強(qiáng)的感染力，2014年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究所(international agency for research on cancer, IARC)發(fā)布的《根除幽門螺桿菌感染預(yù)防胃癌策略》報(bào)告指出，H.pylori感染可誘導(dǎo)慢性活動(dòng)性胃炎緩慢進(jìn)展為癌前病變，如萎縮性胃炎，腸上皮化生和發(fā)育異常，最后發(fā)展為胃癌。

CYP2C19是與PPI代謝最密切相關(guān)的細(xì)胞色素氧化酶，屬于P450同工酶的亞型。由位于第10號染色體長臂上的CYP2C19等位基因編碼表達(dá)，呈常染色體隱性單基因遺傳特征[15-16]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn) CYP2C19 基因存在30余種等位基因，其中至少有20種突變等位基因影響其正常表達(dá)，致使CYP2C19酶的功能降低甚至喪失[17]。CYP2C19*1是具有催化活性的野生型正常等位基因，較為常見的突變等位基因主要有2個(gè)，即CYP2C19*2、CYP2C19*3[18-19]?；贑YP2 C19酶活性的差異，可將其分為三種代謝表型，即純合子代謝型(野生型純合子，*1/*1)、雜合子代謝型(野生型/突變型雜合子，*1/*2 或*1/*3)和慢代謝型(突變型純合子，*2/*3 或*2/*2 或*3/*3)。CYP2C19 在人群中呈現(xiàn)出顯著的基因多態(tài)性[20]。

在本研究中，觀察組的CYP2C19基因分為純合子快代謝型，雜合子快代謝和慢代謝型，三者發(fā)生率分別為32%、40%、28%；對照組以上3種類型分別為42%、46%、12%。兩組間純合子和雜合子快速代謝物的發(fā)生率無顯著差異(P>0.05)。在慢代謝發(fā)生率的比較中，觀察組顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示，CYP2C19的慢代謝型可能增加了H.pylori陽性患者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)性。

胃癌切除患者術(shù)后的有效性主要是以術(shù)后的生活質(zhì)量作為主要評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為了標(biāo)準(zhǔn)化胃癌手術(shù)切除后患者生活質(zhì)量的評估，DAGCS32得以開發(fā)應(yīng)用[6]。和腫瘤患者生活質(zhì)量評價(jià)表相比，該評分系統(tǒng)更為統(tǒng)一和完善，可以更好地評判胃癌切除患者術(shù)后的有效性[21]。進(jìn)一步，本研究統(tǒng)計(jì)遠(yuǎn)端切除術(shù)一年后兩組患者DAGCS32得分，結(jié)果顯示兩組中純合子快代謝型、雜合子快代謝與慢代謝型相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明CYP2C19的慢代謝型的得分顯著低于其他兩種基因型，預(yù)后較其他兩種基因型差，提示CYP2C19的慢代謝型可能增加了胃癌手術(shù)術(shù)后功能障礙，影響了患者的預(yù)后。但是，由于許多因素會(huì)影響生活質(zhì)量調(diào)查的結(jié)果，該研究仍有潛在的局限性?；颊呷粼谛g(shù)后一年隨訪前死去，在分析時(shí)則會(huì)排除。這些患者的生活質(zhì)量可能會(huì)很差，但卻并沒有考慮。因此，在未來的研究中需要擴(kuò)大樣本量已解決此問題。多種因素會(huì)影響患者DAGCS32的評分，因此該研究仍有潛在的局限性。如患者若在術(shù)后一年隨訪前死去，在分析時(shí)該患者的數(shù)據(jù)則會(huì)被排除，無法納入分析。因此，在未來的研究中需要擴(kuò)大樣本量以解決此問題。

綜上可知，慢代謝型增加了H.pylori陽性患者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)性，同時(shí)預(yù)后較純合子快代謝型和雜合子快代謝型差，臨床上應(yīng)引起重視。