晉東南3種道地藥材植物根際真菌群落特性

李毳，劉怡

山西財(cái)經(jīng)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030006

微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能和多樣性受多種因素的影響，目前尚無(wú)一致的結(jié)論（柴永福等，2016）。研究表明環(huán)境選擇和擴(kuò)散限制是影響微生物群落構(gòu)建的兩個(gè)重要方面，二者相對(duì)作用的大小因生物屬性、生境和研究尺度不同而存在差異（?？瞬?，2009）。植物根際土壤中生長(zhǎng)著大量各種類型的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等（厲桂香等，2018）。植物和土壤因子對(duì)根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性具有重要的影響。根系分泌物介導(dǎo)了植物根際微生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量驅(qū)動(dòng)微生物趨化過(guò)程，形成了植物所特有的根系核心微生物區(qū)系（Bulgarelli et al.，2012）。根系分泌物影響根際微生物的種類和數(shù)量，并對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖及代謝過(guò)程產(chǎn)生影響（Singh et al.，2004），植物通過(guò)根際“主動(dòng)”選擇土壤微生物，盡管不能確定是否選擇了有益的微生物（Chaudhary et al.，2016），但這些微生物通過(guò)促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、改善土壤的理化性質(zhì)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)（Bais et al.，2004）。中藥材植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge）、地黃（Rehmannia glutinosa）等的酸性根系分泌物可以誘導(dǎo)厚垣孢子、卵孢子和菌核的萌發(fā)，影響土壤微生物的群落組成，細(xì)菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增加（嚴(yán)鑄云等，2012）。有多項(xiàng)研究表明，藥用植物能夠顯著影響其根際微生物種群的組成（Berendsen et al.，2012），長(zhǎng)期種植地黃能夠顯著改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性（吳林坤等，2015）。Glassman et al.（2017）的研究發(fā)現(xiàn)pH和土壤營(yíng)養(yǎng)在局域尺度上驅(qū)動(dòng)真菌的群落的構(gòu)建，真菌群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)顯著正相關(guān)。在研究植物群落構(gòu)建的驅(qū)動(dòng)力時(shí)，植物-微生物-土壤之間的相互作用很容易被忽視（Thompson et al.，2001），土壤理化因子與植物類型是否相互作用，影響土壤微生物多樣性還有待深入研究。

山西地形復(fù)雜，晉東南太行山區(qū)是傳統(tǒng)中藥材產(chǎn)區(qū)，中藥材資源豐富且歷史悠久，大宗中藥材道地品種連翹（Forsythia suspensa）、遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia Willd）、黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、黃芪（Astragalus membranaceus Fisch）、柴胡（Bupleurum chinese）、黨參（Codonopsis piloula）等都在全國(guó)形成規(guī)模。本研究中選取遠(yuǎn)志、柴胡、黨參3種野生道地藥材為研究對(duì)象，小尺度局域空間上探討 3種藥材根際土壤真菌群落多樣性、結(jié)構(gòu)及其驅(qū)動(dòng)因素。

1 研究區(qū)域與研究方法

1.1樣品采集

2018年5月，在山西省長(zhǎng)治市武鄉(xiāng)縣石圪垤村（36°44′N，113°60′E）附近溝坡，選取地表植被基本均勻的樣地，選擇長(zhǎng)勢(shì)、株齡（5年左右）相近的野生遠(yuǎn)志、柴胡和黨參各3株，共收集到9個(gè)樣品的根際土壤。具體方法參照Riley et al.（1969，1970）的抖落法：挖取具有完整根系的土體，輕輕抖落大塊不含根系的土壤，然后用力將根系表面附著的土壤全部抖落下來(lái)，混合后，密封于無(wú)菌塑料袋，置于車載冰箱保存，并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。仔細(xì)去除新鮮土樣中可見(jiàn)的植物殘?bào)w及土壤動(dòng)物等，將土樣分為兩份，一份風(fēng)干處理，用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定，一份提取土壤微生物基因組DNA，用于高通量測(cè)序。

1.2土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤含水量用烘干法測(cè)定；土壤pH值用電位法HANNA HI3221測(cè)定（土水質(zhì)量比1∶2.5）；土壤全碳（TC）、全氮（TN）、全硫（TS）用元素分析儀（vario MACRO cube，Germany）測(cè)定；土壤硝態(tài)氮（NO3--N）、亞硝態(tài)氮（NO2--N）、銨態(tài)氮（NH4+-N）用CleverChem 380間斷元素分析儀測(cè)定；土壤粒度用粒度儀（Mastersizer 3000，Malvern，UK）測(cè)定，上機(jī)前對(duì)土壤進(jìn)行前處理去除碳酸鹽和有機(jī)質(zhì)。

脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以37 ℃下培養(yǎng)24 h 后1 g土壤產(chǎn)生的NH3+-N的mg數(shù)表示；蔗糖酶采用3, 5-二硝基水楊酸比色法，其活性以37 ℃培養(yǎng)24 h 后1 g土壤產(chǎn)生的葡萄糖的mg數(shù)表示；過(guò)氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法，其活性以20 min內(nèi)每克土壤分解的過(guò)氧化氫的mg數(shù)表示。

1.3土壤真菌群落分析

每種藥材的土壤取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品分別稱取5 g，將鮮土樣送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序?；贗llumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2-Rev（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）對(duì)核糖體ITSⅠ高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。

1.4數(shù)據(jù)分析

各樣地土壤理化變量之間的顯著性差異（P＜0.05）均采用單因素方差分析（SPSS 23.0 One-way analysis）和多重比較分析。使用FLASH v1.2.7軟件，通過(guò)overlap對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）；使用Trimmomatic v0.33軟件，對(duì)拼接得到的 Raw Tags進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量的 Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）；使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective Tags），使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUST[2]對(duì) Tags在 97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU。使用Mothur（version v.1.30）軟件，計(jì)算樣品的Alpha多樣性指數(shù)，包括反映微生物多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，群落豐富度指數(shù)Chao1指數(shù)和 ACE指數(shù)以及反映測(cè)序深度的Coverage指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1土壤理化性質(zhì)

土壤pH、TC、TS、土壤粒度、脲酶和蔗糖酶活性在3種不同植物的根際土間差異顯著，而土壤含水率、TN、NO3--N、NH4+-N、NO2--N、過(guò)氧化氫酶活性的差異不顯著（表 1）。所有土壤樣品的pH都大于7，為弱堿性土壤。黨參根際土的pH值最大（7.80）。TN、TC、TS在柴胡根際土中均為最大。土壤脲酶和蔗糖酶在樣品間差異顯著，柴胡根際土中的脲酶活性最高（6.54），蔗糖酶活性最低（8.64），黨參根際土中脲酶活性最低（0.55），蔗糖酶活性最高（11.40）。

2.2 3種藥材根際土壤真菌群落組成及其多樣性

圖1 不同植物根際真菌群落在門（a）和屬（b）水平的相對(duì)豐度及聚類分析（c）Fig. 1 The relative abundance of dominant fungal phylum (a) and genus(b), and cluster analysis(c) from rhizosphere of three plants

3種藥用植物的9個(gè)根際土壤樣品中共鑒定出9個(gè)真菌門和143個(gè)真菌屬，真菌群落分布格局具有一定規(guī)律性（圖1a），子囊菌門Ascomycota和擔(dān)子菌門 Basidiomycota相對(duì)豐度最大，黨參根際土壤中，擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度顯著大于遠(yuǎn)志和柴胡，而子囊菌門的相對(duì)豐度顯著小于遠(yuǎn)志和柴胡。從9個(gè)樣品根際土壤群落中，共鑒定出相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌屬有9個(gè)，其中，絲蓋傘屬Inocybe（39.89%）、白環(huán)蘑屬Leucoagaricus（7.05%）在黨參根際真菌群落中占據(jù)顯著優(yōu)勢(shì)；被孢霉屬M(fèi)ortierella（3.39%、8.34%、3.96%）分別在遠(yuǎn)志、黨參和柴胡根際中均占有顯著優(yōu)勢(shì)；Ramicandelaber屬（1.02%，3.79%）、Paraphoma屬（1.98%、1.60%）分別在遠(yuǎn)志和柴胡根際真菌群落中優(yōu)勢(shì)較大；Naganishia屬（4.77%）在遠(yuǎn)志根際群落中優(yōu)勢(shì)較大；Tetracladium屬（1.05%、2.64%）在黨參和柴胡根際土中優(yōu)勢(shì)較大；Ceratobasidium屬（1.96%）在柴胡根際土中優(yōu)勢(shì)較大（圖1b）。根際真菌屬水平豐度熱圖分析結(jié)果顯示（圖1c），遠(yuǎn)志、柴胡和黨參根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，黨參與遠(yuǎn)志、柴胡差異更大。

3種藥材植物根際土壤真菌群落α多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表2。其中柴胡根際真菌群落Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小，因此，柴胡根際真菌群落多樣性最高，而均勻度較低。黨參的Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)最大，說(shuō)明黨參根際真菌群落的多樣性較低，而均勻度較高。遠(yuǎn)志的 ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)最大，表明其根際真菌群落中種類數(shù)目最多；黨參根際真菌群落的ACE和Chao1指數(shù)最低。

表2 3種藥材根際土壤真菌群落多樣性Table 2 Diversity of fungal communities of three species rhizosphere

2.3環(huán)境因子對(duì)土壤真菌群落α多樣性的影響

土壤環(huán)境因子和α多樣性指數(shù)間的相關(guān)分析結(jié)果表明（圖2），根際真菌群落Simpson指數(shù)與根際土壤pH、蔗糖酶呈顯著負(fù)相關(guān)；Shannon指數(shù)與pH、蔗糖酶呈顯著負(fù)相關(guān)，與TN、TS和脲酶呈顯著正相關(guān)性。說(shuō)明3種植物根際真菌群落的多樣性與土壤環(huán)境因子密切相關(guān)。

2.4環(huán)境因子與植物類型對(duì)土壤真菌群落的關(guān)系

NMDS分析結(jié)果表明3種藥用植物根際土壤真菌群落組成差異顯著（P＜0.05）（圖3a）。為了探究3種植物根際土壤真菌群落差異的驅(qū)動(dòng)因素，對(duì)本研究區(qū)土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌屬豐度和土壤理化因子、植物類型進(jìn)行冗余分析（圖 3b），結(jié)果表明RDA1和RDA2分別解釋3種植物根際土壤真菌群落差異的44.41%和20.54%，其中土壤pH、蔗糖酶、脲酶、全氮對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著，且土壤 pH是解釋度最高的環(huán)境因子。

在植物分類學(xué)上，3種藥用植物分屬于遠(yuǎn)志科（Polygalaceae）、傘形科（Umbelliferae）和桔?？疲–ampanulaceae），植物的生理生態(tài)特征具有一定的差異。方差分解分析植物在科水平上的差異與土壤因子對(duì)植物根際微生物群落影響的相對(duì)大小（圖4），結(jié)果顯示土壤、植物種類分別解釋了3種植物根際真菌群落差異的32%和27%，環(huán)境因子和植物類型的交互作用對(duì)其解釋為6%。表明土壤環(huán)境因子和植物類型對(duì)根際真菌群落均具有顯著的影響。

圖2 α多樣性指數(shù)與土壤環(huán)境因子相關(guān)性矩陣圖Fig. 2 Correlation matrix diagram among α-diversity index and edaphic factors

圖3 優(yōu)勢(shì)真菌屬的NMDS分析及其與土壤環(huán)境因子和植物類型的冗余分析Fig. 3 NMDS analysis of dominant fungi genus (a) and RDA analysis of dominant fungi genus constrained by edaphic factor (b)

圖4 方差分解分析土壤環(huán)境因子和植物類型對(duì)真菌群落影響相對(duì)大小Fig. 4 Variation partitioning analysis showing the percentages of variance in fungal communities explained by soil environment factor and medicine plant type

3 討論

3.1土壤環(huán)境因子對(duì)植物根際真菌群落的影響

微生物作為土壤地球物質(zhì)化學(xué)循環(huán)的主要參與者，其群落結(jié)構(gòu)和功能受到土壤環(huán)境因子的影響。環(huán)境因子和擴(kuò)散限制對(duì)于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響作用的相對(duì)大小，因微生物屬性（細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物）、生境類型、研究尺度的不同而不同。就環(huán)境因子而言，不同的土壤因子（pH、鹽度、溫度、濕度、土壤酶等）與微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的關(guān)系不盡一致。Burns et al.（2015）在美國(guó)博德加灣附近研究了 14種不同植被類型的土壤微生物群落多樣性，發(fā)現(xiàn)在局域尺度下，植物種、土壤化學(xué)特征和空間因素對(duì)土壤真菌和細(xì)菌群落的多樣性均具有顯著的影響。對(duì)華北落葉松林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的研究顯示，土壤理化因子和地上植被多樣性對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有顯著影響，而且在測(cè)定的 10種土壤因子中，不同的真菌門與各種土壤理化因子（銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和鹽度）的相關(guān)性存在差異（趙鵬宇等，2018）。王淼等（2013）在罕山通過(guò)研究不同林型下土壤微生物特性時(shí)，發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)和土壤含水率對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)和代謝多樣性的貢獻(xiàn)率很高。Cox et al.（2010）的研究表明生態(tài)系統(tǒng)中真菌群落的分布與土壤氮的含量密切相關(guān)。本研究在微尺度上分析了3種藥用植物根際真菌群落的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示土壤 TN、pH、脲酶及蔗糖酶對(duì)真菌群落有顯著影響。本研究中植物根際子囊菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度較高，它們不僅是土壤真菌群落中有機(jī)質(zhì)的主要分解者（Yelle et al.，2010），而且二者與植物共生形成菌根，參與根際氮素的循環(huán)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。許多研究結(jié)果都表明，土壤菌根菌（叢枝菌根真菌、外生菌根菌）與土壤pH的顯著相關(guān)（Kluber et al.，2012），與本研究結(jié)果一致。

3.2植物物種類型與根際土壤微生物的相關(guān)性

植物類型對(duì)根際土壤微生物群落的“選擇”主要是通過(guò)植物根系分泌物來(lái)實(shí)現(xiàn)的（Singh et al.，2004），特別是菌根真菌類等與植物共生的微生物，是根際微生物群落的主要組成物種。根系分泌物是植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體物質(zhì)，是植物響應(yīng)外界脅迫的重要途徑，也是構(gòu)成不同植物微生態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素（Bais et al.，2006）。根系分泌物為微生物提供碳源，驅(qū)動(dòng)土壤微生物營(yíng)養(yǎng)循環(huán)（N、S、P）過(guò)程（劉純等，2013）。根系分泌物的種類和數(shù)量決定了根際微生物的多樣性和豐度，并對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖及代謝過(guò)程產(chǎn)生影響（袁秀梅等，2016；Hu et al.，2018）。藥用植物根際分泌物中豐富的糖類、氨基酸及維生素等對(duì)土壤微生物的種類、數(shù)量及植物根際的分布具有顯著的影響（Chaudhary et al.，2016）。不同藥用植物可以通過(guò)根系分泌物作用于根圍環(huán)境，產(chǎn)生根際效應(yīng)，影響根際土壤微生物的群落多樣性和結(jié)構(gòu)。

在本研究中，土壤環(huán)境因子和植物是植物根際真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要驅(qū)動(dòng)因子，土壤-植物-微生物相互作用，土壤為植物和微生物提供載體和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，植物為土壤提供碳源和有機(jī)質(zhì)，微生物驅(qū)動(dòng)碳、氮、硫、磷等物質(zhì)化學(xué)循環(huán)過(guò)程。土壤、植物、微生物相互作用，形成特定的土壤生態(tài)系統(tǒng)，為“道地”藥材的生長(zhǎng)提供了特異的生境。道地藥材的形成有其歷史條件、地理?xiàng)l件和生長(zhǎng)的環(huán)境因子，“道”的形成就是不同的藥材基因型和環(huán)境因子互相作用的產(chǎn)物。山西太行山地區(qū)自古以來(lái)就是黨參、柴胡以及遠(yuǎn)志的重要產(chǎn)區(qū)，野生黨參、柴胡、遠(yuǎn)志的生長(zhǎng)也表明環(huán)境因子起到了重要的作用。

4結(jié)論

柴胡、黨參和遠(yuǎn)志3種野生道地藥材根際真菌群落主要受土壤環(huán)境因子和植物類型的影響，且土壤環(huán)境因子是根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要驅(qū)動(dòng)因素，同時(shí)，植物類型也發(fā)揮重要作用，體現(xiàn)了植物-土壤-微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的協(xié)同關(guān)系，為道地中藥材的生長(zhǎng)提供了特定的生境。