抗阻與有氧干預(yù)下SAMP8小鼠腓腸肌氧化應(yīng)激響應(yīng)

田鵬,周艷紅,南曉潔,鄭軍,李海鵬

(1.山西大學(xué)商務(wù)學(xué)院,山西 太原 030031;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山西 太原 030031;3.浙江工業(yè)大學(xué),浙江 杭州 310000)

0 引言

關(guān)于跑臺、游泳等運(yùn)動對衰老腓腸肌抗氧化能力的影響已有較多研究,但不同運(yùn)動方式下不同月齡小鼠腓腸肌氧化應(yīng)激的影響和抗氧化調(diào)控效應(yīng)卻鮮有報(bào)道。本文將爬梯運(yùn)動和有氧跑臺運(yùn)動兩種運(yùn)動方式作為干預(yù)手段,對3月齡和6月齡Senescence-accelerated mice prone/8(SAMP8)快速老化小鼠腓腸肌氧化應(yīng)激及抗氧化水平進(jìn)行相關(guān)研究,探討不同年齡小鼠腓腸肌的氧化應(yīng)激機(jī)制和影響因素,以制定合理有效的運(yùn)動干預(yù)措施,為延緩細(xì)胞衰老和肌肉質(zhì)量下降、減少運(yùn)動障礙綜合征等提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

SAMP8小鼠系列是一類正常發(fā)育但在成熟后顯示衰老加速效應(yīng)的小鼠,在生長期與普通純種小鼠無異,度過生長期后,即4～6月齡后則迅速出現(xiàn)行動遲緩、肌肉質(zhì)量下降、脫毛且無光澤等老化特征,大量研究已證實(shí)SAMP8是衰老研究的理想模型。本研究以SAMP8雄性小鼠為研究對象,均購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)許可證編號:SYXK(晉)2015-0001)。購入后于山西大學(xué)生物技術(shù)研究所動物飼養(yǎng)室分籠獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng),以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料(山西振東制藥股份有限公司,許可證號:SYXK(晉)2014-0006)喂養(yǎng)。動物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度25±2℃,濕度50±5%,自由進(jìn)食飲水,采光為自然光。

實(shí)驗(yàn)動物分組如下:36只3月齡SAMP8小鼠隨機(jī)分為:青年對照組(YC,n=12)、青年抗阻運(yùn)動組(YR,n=12)和青年有氧運(yùn)動組(YE,n=12);6月齡SAMP8小鼠36只隨機(jī)分為:老年對照組(OC,n=12)、老年抗阻運(yùn)動組(OR,n=12)和老年有氧運(yùn)動組(OE,n=12)。

1.2 運(yùn)動模型與訓(xùn)練方案

運(yùn)動人體科學(xué)界研究認(rèn)為運(yùn)動主要包含兩種運(yùn)動形式:抗阻運(yùn)動和有氧運(yùn)動?？棺柽\(yùn)動指身體克服外加阻力,以時間短、強(qiáng)度高、無氧供能為主的運(yùn)動形式,以達(dá)到肌肉增長和力量增加為目的。有氧運(yùn)動指身體需氧量與攝氧量處于平衡狀態(tài)，運(yùn)動強(qiáng)度中等，有氧供能為主的運(yùn)動形式,以提升肌肉耐力和氧化能力為目的。運(yùn)動形式的差異會誘導(dǎo)骨骼肌的適應(yīng)性發(fā)展。通過抗阻運(yùn)動和有氧運(yùn)動對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行干預(yù),探索兩種運(yùn)動方式間可能存在的差異點(diǎn)。

1.2.1 抗阻運(yùn)動方案

抗阻運(yùn)動以小鼠背部負(fù)重爬梯方式進(jìn)行。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始訓(xùn)練,在動物的明暗周期交界時(17:00-19:00)進(jìn)行訓(xùn)練,采取逐級遞增的方式由起始負(fù)荷量25%體重增加至50%體重,以避免小鼠過量死亡。負(fù)重重量(運(yùn)動負(fù)荷)和爬梯的重復(fù)次數(shù)(運(yùn)動強(qiáng)度)(表1)分別為3次/周,3組/次,4輪/組,間隔2 min/組,20 s/輪，訓(xùn)練隔天進(jìn)行[8]。對照組小鼠在籠內(nèi)正常飼養(yǎng),不進(jìn)行負(fù)重爬梯運(yùn)動干預(yù)。

表1 青年抗阻運(yùn)動組與老年抗阻運(yùn)動組爬梯運(yùn)動訓(xùn)練方案

表2 青年有氧運(yùn)動組與老年有氧運(yùn)動組跑臺運(yùn)動訓(xùn)練方案

1.2.2 有氧運(yùn)動方案

參照Bedford[9]跑臺訓(xùn)練方案，并隨動物跑臺運(yùn)動具體情況適時調(diào)整建立有氧跑臺運(yùn)動模型。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,選擇小鼠明暗周期交界時(17:00-19:00)進(jìn)行,采取恒定運(yùn)動強(qiáng)度和負(fù)荷的方式進(jìn)行,5次/周,25 min/次,每次實(shí)驗(yàn)后檢查小鼠健康狀況,如實(shí)驗(yàn)小鼠受傷需及時調(diào)整實(shí)驗(yàn)。對照組小鼠在籠內(nèi)正常飼養(yǎng),不進(jìn)行跑臺運(yùn)動干預(yù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材

分別于抗阻運(yùn)動和有氧運(yùn)動訓(xùn)練末次結(jié)束后,各組受試SAMP8小鼠12只隨機(jī)抽取10只即刻斷頭處死。在冰盤上迅速取完整的后肢腓腸肌并稱重記錄后,用錫箔紙包裹標(biāo)記后置于液氮中轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 腓腸肌氧化損傷和抗氧化能力檢測

加入9倍于肌肉組織重量的勻漿介質(zhì)(pH7.4,0.01 mol/L Tris-HCL,0.000 1 mol/L EDTA,0.01 mol/L蔗糖,0.8%氯化鈉)后使用Teflon杵棒玻璃勻漿器(Wheaton公司)勻化,勻漿速度2 000 r/min,制備成10%勻漿液后通過低溫離心機(jī)(Thermo公司,4℃,2 000 r/min)離心15 min后取上清進(jìn)行測定。組織中抗氧化防御體系中具有代表性的指標(biāo):總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量檢測分別按照T-AOC檢測試劑盒、T-SOD檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒(均購自南京建成生物技術(shù)所)說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件(SPSS Inc,Chicago,USA)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。分別采用Kolmogorov-Smirnov和Levene法進(jìn)行數(shù)據(jù)分布和方差齊性檢驗(yàn),采用LSD法對各組進(jìn)行兩兩比較,以不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動對不同月齡SAMP8小鼠腓腸肌總抗氧化能力(T-AOC)的影響

對照老年小鼠(OC)腓腸肌總抗氧化能力顯著低于對照青年小鼠(YC,P<0.05)(圖1)。以不同的運(yùn)動方式對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行干預(yù)后,同齡小鼠間的總抗氧化能力差異較大;較對照青年小鼠,抗阻運(yùn)動(YR)和有氧運(yùn)動(YE)的小鼠腓腸肌T-AOC值顯著降低,降幅分別達(dá)83%和95%;而老年小鼠的測試結(jié)果相反,抗阻運(yùn)動(OR)和有氧運(yùn)動(OE)的小鼠腓腸肌T-AOC值均顯著高于對照老年小鼠(OC),增幅分別達(dá)429%和105%。結(jié)果顯示,不同運(yùn)動方式對青年和老年小鼠腓腸肌氧化應(yīng)激的影響差異顯著(P<0.05),同種運(yùn)動方式對青年和老年小鼠腓腸肌氧化應(yīng)激的影響差異也顯著;青年小鼠抗阻運(yùn)動組(YR)和有氧運(yùn)動組(YE)小鼠腓腸肌T-AOC值均分別顯著低于老年小鼠抗阻運(yùn)動組(OR)和有氧運(yùn)動組(OE)(P<0.05)。

Fig.1 Effects of different exercises on total antioxidant capacity (T-AOC) of gastrocnemius muscle in SAMP8 mice圖1 不同運(yùn)動對SAMP8小鼠腓腸肌總抗氧化能力(T-AOC)的影響

2.2 不同運(yùn)動對SAMP8小鼠腓腸肌總超氧化物歧化酶(T-SOD)的影響

對照老年小鼠(OC)腓腸肌T-SOD活性顯著低于對照青年小鼠(YC,P<0.05)(圖2),隨著小鼠年齡的增加其腓腸肌T-SOD活性呈下降趨勢。以不同的運(yùn)動方式對實(shí)驗(yàn)小鼠加以干預(yù)后,其腓腸肌T-SOD活性在同月齡小鼠上也表現(xiàn)出不同差異;抗阻運(yùn)動(YR)和有氧運(yùn)動(YE)的小鼠腓腸肌T-SOD值顯著低于對照青年小鼠(YC)(P<0.05),降幅分別為70%和66%。YR組與YE組間差異不顯著;較對照老年小鼠(OC),抗阻運(yùn)動(OR)和有氧運(yùn)動(OE)小鼠腓腸肌T-SOD活性顯著升高,增幅分別達(dá)458%和342%,且OR組顯著高于OE組(P<0.05)。

Fig.2 Effects of different exercises on the total superoxide dismutase (T-SOD) activity of gastrocnemius muscle in SAMP8 mice圖2 不同運(yùn)動對SAMP8小鼠腓腸肌總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的影響

2.3 不同運(yùn)動對SAMP8小鼠腓腸肌過氧化氫酶(CAT)的影響

運(yùn)動方式與年齡均可對小鼠腓腸肌CAT活性產(chǎn)生顯著性影響。如圖3所示,對照青年小鼠腓腸肌CAT活性顯著高于對照老年小鼠(OC)(P<0.05)。隨小鼠年齡升高,CAT活性顯示出與SOD相同趨勢。經(jīng)不同運(yùn)動方式干預(yù)后,同齡小鼠腓腸肌CAT活性顯示出顯著性差異(P<0.05);抗阻運(yùn)動組(YR和OR)的CAT活性均顯著高于各自對照小鼠(YC和OC),且YR組也顯著高于同齡的YE組(P<0.05),但OR組與老年小鼠有氧運(yùn)動組(OE)組間差異不顯著(P>0.05)。

Fig.3 Effects of different exercises on catalase (CAT) activity of gastrocnemius muscle in SAMP8 mice圖3 不同運(yùn)動對SAMP8小鼠腓腸肌過氧化氫酶(CAT)的影響

2.4 不同運(yùn)動對SAMP8小鼠腓腸肌丙二醛(MDA)的影響

對照老年小鼠(OC)腓腸肌丙二醛(MDA)含量顯著高于對照青年小鼠(YC,)(圖4)(P<0.05),表明小鼠細(xì)胞損傷隨年齡增大呈升高趨勢。經(jīng)過兩種不同方式的運(yùn)動干預(yù)之后,抗阻運(yùn)動青年小鼠組(YR)、抗阻運(yùn)動老年小鼠組(OR)和有氧運(yùn)動老年小鼠組(OE)MDA含量均顯著高于各自對照組(P<0.05),但有氧運(yùn)動青年小鼠組(OE)MDA含量卻低于對照,表明有氧運(yùn)動對青年小鼠腓腸肌細(xì)胞的損傷減輕。

Fig.4 Effects of different exercises on malondialdehyde (MDA) levels of gastrocnemius muscle in SAMP8 mice圖4 不同運(yùn)動對SAMP8小鼠腓腸肌丙二醛(MDA)含量的影響

3 討論與結(jié)論

超氧陰離子自由基作為細(xì)胞代謝過程中的中間產(chǎn)物,對機(jī)體的影響具有雙重性。ROS可直接與脂肪、核酸等反應(yīng)而引起脂質(zhì)過氧化作用,從而對機(jī)體的組織器官產(chǎn)生毒性作用，其中MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其常作為細(xì)胞氧化損傷的重要檢測指標(biāo)。本項(xiàng)研究通過測定小鼠腓腸肌MDA含量,研究了負(fù)重爬梯和動物跑臺兩種運(yùn)動方式對不同月齡SAMP8小鼠組織細(xì)胞氧化損傷的影響程度。結(jié)果表明,小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平與年齡和運(yùn)動方式顯著相關(guān),顯示不同運(yùn)動方式均可導(dǎo)致細(xì)胞損傷。此外,研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動青年小鼠組MDA含量低于對照,這與晁敏等[10]研究結(jié)果基本一致?？棺柽\(yùn)動較有氧運(yùn)動在短時間內(nèi)能量消耗較高,活性氧利用率相應(yīng)增加,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)含量升高。雖然有氧運(yùn)動可同樣導(dǎo)致小鼠腓腸肌有氧代謝增強(qiáng)并產(chǎn)生大量活性氧,但機(jī)體對自由基的利用也相應(yīng)增加,如以通過誘導(dǎo)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶等酶活性升高、促進(jìn)凝血酶原和膠原蛋白的合成等方式增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)并強(qiáng)化細(xì)胞修復(fù)功能等[11]。當(dāng)機(jī)體對活性氧自由基的利用速率大于其生成速率時,將會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物減少。

為防止并緩解活性氧對機(jī)體的氧化損傷,生物體在長期的進(jìn)化過程中形成并完善了一套抗氧化系統(tǒng)和活性分子以清除過多的ROS,如還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSH-Px)和谷胱甘肽過氧化物酶(CAT)等,其中總抗氧化能力(T-AOC)是生物體防御氧化損傷能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。通過對小鼠腓腸肌的總抗氧化能力(T-AOC)進(jìn)行檢測,有利于從整體上把握腓腸肌的氧化應(yīng)激水平。結(jié)果表明,T-AOC表現(xiàn)為年齡依賴性,且與運(yùn)動方式具較高相關(guān)性。經(jīng)長時間運(yùn)動干預(yù)后,青年小鼠腓腸肌血氧供應(yīng)能力增加,細(xì)胞氧化磷酸化水平提升,細(xì)胞耐受能力及代謝水平逐漸處于較為旺盛階段。腓腸肌細(xì)胞代謝水平和質(zhì)量得到顯著提升后引發(fā)了細(xì)胞對運(yùn)動干預(yù)的適應(yīng)性發(fā)展,導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平相應(yīng)改變,參與有氧代謝的酶活性增強(qiáng),導(dǎo)致了T-AOC下降這一結(jié)果[12]。老年小鼠通過8周的運(yùn)動干預(yù),促使其已發(fā)生退行性綜合征的老年小鼠腓腸肌的機(jī)械負(fù)荷得到加強(qiáng),誘發(fā)腓腸肌線粒體保持較高的呼吸率,減少腓腸肌纖維的線粒體損傷,并維持在其氧化能力的臨界閾值之上,導(dǎo)致了老年小鼠腓腸肌抗氧化防御能力上調(diào)的保護(hù)性反應(yīng)[13]。老年小鼠腓腸肌T-AOC上升是運(yùn)動干預(yù)后導(dǎo)致的誘導(dǎo)型上調(diào),是基于腓腸肌組織自身的保護(hù)性反應(yīng)。

SOD在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起著至關(guān)重要的作用,可通過清除ROS保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn),8周的運(yùn)動干預(yù)促使青年小鼠腓腸肌的SOD活性顯著降低。Allan等研究認(rèn)為長期運(yùn)動可誘使機(jī)體自身代謝速率和超氧陰離子自由基利用率的增加,加快氧陰離子自由基的代謝速率,導(dǎo)致超氧陰離子自由基減少[15]。肌肉退行性變化是老年小鼠在運(yùn)動干預(yù)后腓腸肌SOD活性上升的重要內(nèi)部誘因。外部運(yùn)動干預(yù)則通過誘發(fā)SOD等具有抗氧化蛋白的上調(diào)表達(dá)介導(dǎo)了老年小鼠抗氧化防御能力增強(qiáng)的保護(hù)性反應(yīng)[16]。此外,機(jī)體組織中CAT是機(jī)體在抗氧化過程中另一重要因子。CAT可直接分解H2O2降低其在組織中的濃度,以防止H2O2與O2反應(yīng)生成有害的-OH,防止細(xì)胞過氧化作用的發(fā)生[17]。研究發(fā)現(xiàn),OE、OR和YR組小鼠CAT活性均顯著高于對照,而YE組較對照則無顯著差異。其原因可能在于抗阻運(yùn)動在短時間內(nèi)能量消耗增多,氧利用率增加,代謝產(chǎn)物增加,在氧供應(yīng)受限的情況下,誘發(fā)了機(jī)體過氧化氫酶對底物H2O2的分解,釋放出O2供機(jī)體放能,增加了對氧的利用效率；而有氧運(yùn)動能量消耗平緩,自身氧供應(yīng)能保證機(jī)體對氧的利用,所以有氧運(yùn)動沒有使過氧化氫酶應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生明顯變化。

本實(shí)驗(yàn)通過負(fù)重爬梯和動物跑臺模型,研究了不同時期SAMP8小鼠在不同運(yùn)動方式下其腓腸肌氧化損傷程度及抗氧化酶活性變化。研究顯示不同年齡小鼠以不同策略緩解機(jī)體受到的氧化損傷。其中青年小鼠抗氧化能力的增強(qiáng)是以提升自身質(zhì)量為主,且有氧運(yùn)動要比抗阻運(yùn)動效果明顯;而老年小鼠抗氧化能力的提升是以被動誘導(dǎo)上調(diào)為主。兩種運(yùn)動方式均有利于抗氧化能力的增強(qiáng),但抗阻運(yùn)動導(dǎo)致的氧化損傷程度顯著高于有氧運(yùn)動,提示中老年人群的運(yùn)動方式應(yīng)以有氧運(yùn)動為主,堅(jiān)持長期適量的有氧運(yùn)動有利于增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶的活性,降低機(jī)體的氧化損傷和細(xì)胞毒害作用。