串珠藻目植物psaA基因的適應(yīng)性進化及共進化分析

鞏超彥,南芳茹,馮佳,呂俊平,劉琪,劉旭東,謝樹蓮

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

串珠藻目Batrachospermales是淡水紅藻中最重要的代表類群,零星式分布于流動的冷泉溪中,種群多小而少。一般認為包括3科,14屬[1-3]。

psaA是植物葉綠體進行光調(diào)節(jié)的重要基因，位于葉綠體基因組的大單拷貝區(qū)[4]。它能編碼一種類囊體膜蛋白，即光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心跨膜復(fù)合物的中心蛋白A，又稱P700脫輔基蛋白A，該蛋白與psaB基因編碼的蛋白相互結(jié)合，共同作為光系統(tǒng)Ⅰ跨膜復(fù)合物的中心蛋白，承擔(dān)重要的生物學(xué)功能，構(gòu)成植物光系統(tǒng)Ⅰ的中心架構(gòu)。

適應(yīng)是生物進化的核心,物種的演化歷程即不斷適應(yīng)其生存環(huán)境的過程。在此過程中,物種的遺傳信息發(fā)生了改變,其中的一些特殊的改變經(jīng)過自然選擇被固定了下來,即基因的適應(yīng)性進化[5]。同時,分析基因的適應(yīng)性進化還有助于我們了解基因變異和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的改變及物種的進化史[6]。目前用于進化研究的模型有機理式模型、經(jīng)驗式模型和機理-經(jīng)驗式模型[7-10],而且這些模型也在應(yīng)用中得到了不斷完善[11-17]。

氨基酸位點的共進化是在蛋白質(zhì)內(nèi)部和蛋白質(zhì)間普遍存在的現(xiàn)象[18]。共進化位點的關(guān)聯(lián)特性可能源于蛋白自身結(jié)構(gòu)、功能特性、編碼核苷酸構(gòu)成基因組特性等。如果其中某一位點發(fā)生了適應(yīng)性進化,與此相關(guān)的位點通過共進化的方式進行補償突變,這樣不僅可獲得有利于增加適應(yīng)性的新性狀,同時也維持了其固有的功能[19]。識別共進化氨基酸位點對了解蛋白質(zhì)氨基酸位點間可能的相互作用和蛋白適應(yīng)性進化的復(fù)雜機制具有重要意義。

雖然一般認為序列高度保守是葉綠體基因組的特性之一[10],但對于起源較早、演化歷史更長的低等植物,可能會發(fā)生更多的變化。為了進一步了解串珠藻目植物的演化歷史,了解這一特殊的淡水紅藻類群究竟如何適應(yīng)特殊生存環(huán)境,相關(guān)葉綠體基因是否在其演化歷程中發(fā)生了適應(yīng)性進化,從而對其適應(yīng)生存環(huán)境產(chǎn)生影響[20],本研究對其葉綠體基因psaA進行了適應(yīng)性進化及共進化分析,為了解串珠藻目植物適應(yīng)生存環(huán)境的分子進化機制,了解相關(guān)蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸分子之間的相互關(guān)系及對該類群適應(yīng)性進化的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)

本文所用數(shù)據(jù)包括作者采集樣本測得和從GenBank收集的串珠藻目及近緣類群psaA基因42條 (表1)。其中,作者采集的7株樣本包括Batrachospermumgelatinosum(采于山西寧武縣汾河源頭,水溫11℃,生于溪流中石壁上),B.hondongense(采于山西洪洞廣勝寺泉,水溫14℃,pH 7.5,生于急流中石塊上),B.longipedicellatum(采于江蘇徐州拔劍泉,水溫16℃,pH7.5,生于石灰質(zhì)巖石上),Kumanoacurvata(采于湖北當(dāng)陽珍珠泉),K.intorta(采于山西臨汾龍祠泉,水溫14℃,生于泉眼邊巖石上),Sheathiaarcuata(山西太原晉祠泉,水溫12℃,pH 7,生于小溪流中巖石上)和Thoreahispida(山西平定娘子關(guān)泉,水溫15.5℃,pH 6.5,生于泉水中樹枝上)。

通過軟件Clustal X[21]分析,得到由231個密碼子組成的序列數(shù)據(jù)。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用MEGA5.0分析序列特征,運行Modeltest軟件,篩選核苷酸最優(yōu)進化模型。采用最大似然法(ML)運行PhyML3.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.3 適應(yīng)性進化分析

利用基于psaA基因構(gòu)建的ML樹,運行PAML4.8軟件包中Codeml程序中的分支模型(用于提示各分支的選擇壓力,分別運行單比率模型、自由比率模型和二比率模型并進行LRT檢驗以確定哪個模型更可靠)、位點模型(用于檢驗基因是否存在經(jīng)受正選擇(ω>1)和負選擇(ω<1)的位點,分別運行M1a和M2a,M0和M3,M7和M8三對模型,前者是后者的零假設(shè),對3對模型分別進行LRT檢驗)和分支-位點模型進行分析(用于檢驗各個指定分支中是否存在正選擇位點)。

1.4 三維結(jié)構(gòu)建模

以B.gelatinosum的psaA(KM055293)序列為參考,翻譯為氨基酸序列,提交瑞士生物信息研究所(https:∥www.expasy.org/),基于同源建模原理預(yù)測其蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

1.5 共進化分析

運用基于Pearson相關(guān)系數(shù)法[22]、參數(shù)檢驗法[23]和互信息法[24]等的CAPS(Coevolution Analysis using Protein Sequences)軟件[25]分析蛋白質(zhì)量部的共進化關(guān)系。

表1 種類及psaA基因的GenBank登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于選取的psaA序列,得到核苷酸最優(yōu)進化模型(表2),并基于此構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),外類群為Galdieriamaxima和Cyanidiumcaldarium。

從圖1可以看出,內(nèi)類群聚集為9個分支,包括Nothocladus屬、Nocturama屬、Sirodotia屬、Kumanoa屬、Sheathia屬、Bangia屬、Thorea屬、Batrachospermumgelatinosum和其余幾個種分別位于不同分支。

表2 psaA基因最優(yōu)進化模型參數(shù)

注:節(jié)點處的數(shù)字代表最大似然法歩靴值,A、B、C、D、E、F、G、H、I代表選定的分支。Fig.1 Phylogenetic tree established based on the psaA gene sequence圖1 基于psaA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 正選擇位點的鑒定分析

表3和表4是位點選擇的結(jié)果。可以看出,分支模型中沒有正選擇位點被檢出,說明psaA基因受到強烈的負選擇。分支-位點模型中,分支CSheathia屬的186F、分支EB.gelatinosum的100A、分支HB.atropurpurea的90C*和199A、分支IThorea屬的99A、132A和179M被鑒定為正選擇位點。但是LRT檢驗均顯示上述結(jié)果不可靠。另外,分支A、B、D、F、G的備擇假設(shè)經(jīng)LRT檢驗均被拒絕。

表3 模型參數(shù)估計值和對數(shù)似然值

續(xù)表3 模型參數(shù)估計值和對數(shù)似然值

2.3 psaA基因的參考三維結(jié)構(gòu)

以B.gelatinosum登錄號KM055293為參考序列,對PDB數(shù)據(jù)庫進行Blast搜索模板,得到一株Thermosynechococcuselongatus(strain BP-1)的三維結(jié)構(gòu)(PDB ID:4FE1)[26],相似度81.99%,一株Synechocystissp. (PCC 6803)的三維結(jié)構(gòu)(PDB ID:4KT0)[27],相似度81.8%,均符合同源建模的可靠性要求?；谇罢邩?gòu)建出了psaA蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖2)。但由于前者氨基酸序列同分析序列比對有缺失,因此選取后者用于后續(xù)共進化分析。

2.4 共進化位點鑒定分析

通過實驗序列和已解析的psaA蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(PDB ID:4KT0)的比對確定對應(yīng)氨基酸的具體位置(圖3),基于詳細的解析數(shù)據(jù)和氨基酸對的相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計出的共進化組(對)5組(20對)(表5)。序列中所有共進化氨基酸對的平均距離27.808 6 ?,標(biāo)準(zhǔn)差12.325 2?；诎被崾杷嚓P(guān)性值統(tǒng)計出的共進化組(對)5組(12對)(表6)?；诎被岱肿恿肯嚓P(guān)值統(tǒng)計出的共進化組(對)5組(15對)(表7)。幾對相關(guān)系數(shù)較高的共進化位點在構(gòu)建出的參考三維結(jié)構(gòu)中的位置見圖4。

表4 LRT檢驗統(tǒng)計量

注:正選擇位點在圖中用白色圓圈標(biāo)出Fig.2 Reference three-dimensional structure of D1 protein of Batrachospermum gelatinosum (DQ787636)圖2 Batrachospermum gelatinosum(DQ787636)D1蛋白參考三維結(jié)構(gòu)

共進化組共進化對氨基酸位點1氨基酸位點2相關(guān)系數(shù)分子距離 1132350.633 49 999.000 0232820.785 29 999.000 0335820.841 49 999.000 0 2432350.633 49 999.000 05321130.659 999.000 06321640.839 79 999.000 07321760.7739 999.000 08351130.739 39 999.000 09351640.617 79 999.000 0 10351760.815 79 999.000 0 111131640.659 722.444 5121131760.860 135.901 213164170.798 618.289 5

續(xù)表5 基于氨基酸對相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計出的psaA蛋白的共進化組(對)

表6 基于氨基酸疏水性相關(guān)性值統(tǒng)計出的psaA蛋白的共進化組(對)

表7 基于氨基酸分子量統(tǒng)計出的psaA蛋白的共進化組(對)

Fig.3 Alignment of the amino acid sequence of psaA protein圖3 psaA蛋白質(zhì)氨基酸序列對位排列

注:共進化位點在圖中用白色圓圈標(biāo)出Fig.4 Spatial location of three pairs co-evolution sites圖4 3對共進化位點的空間位置

3 討論

一般認為序列高度保守是葉綠體基因組的特性之一。一個蛋白為了維持其特定的功能,其結(jié)構(gòu)具有一定的保守性,因而會處于負選擇作用之下。本文對串珠藻目psaA基因的研究結(jié)果顯示,各分支均沒有檢測出有統(tǒng)計學(xué)意義的正選擇位點,可以推斷串珠藻目植物葉綠體的psaA基因處于強烈的負選擇之下,這與該基因的保守性有很大的關(guān)系。Smart等[28]發(fā)現(xiàn)psaA或psaB基因的失活都將導(dǎo)致PSⅠ復(fù)合物在類囊體中缺失,這表明psaA或者psaB不能單獨形成二聚體,而psaA-psaB異二聚體的存在為整個PSⅠ復(fù)合物組裝所必需,可見psaA基因編碼的PSⅠ中心蛋白A在光合作用中的重要作用。陳曉霞等[10]研究也指出,有關(guān)葉綠體基因發(fā)生適應(yīng)性進化的報道尚不多見,可能的原因主要是葉綠體基因的替換率低,較少發(fā)生突變,或者葉綠體基因很少發(fā)生重復(fù),缺乏產(chǎn)生新基因的來源。郁飛等[29]研究指出,高等植物、藻類和藍細菌所有已知的編碼PSⅠ結(jié)構(gòu)蛋白的基因都已經(jīng)被克隆,一級結(jié)構(gòu)相當(dāng)保守。此外,關(guān)于psaA基因的同源性研究也提示了該基因的高度保守性。Cantrell等[30]研究指出藍藻psaA基因序列同已測序的高等植物有超過95%的同源性,翻譯產(chǎn)物和高等植物的同基因產(chǎn)物也有76%～81%的一致性。這種高度的同源性提示,不僅是PSⅠ復(fù)合物的結(jié)構(gòu)保守,其功能也相當(dāng)保守。施定基等[31]比較了藍藻葉綠體PSⅠ的蛋白基因同若干高等植物的同源性,結(jié)果在74.60%～80.19%之間,而且物種間psaA基因的同源性與它們的進化程度相關(guān),進化地位越相近,同源性越高。

基于氨基酸對的相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計出的共進化組(對)之間相互關(guān)聯(lián)非常緊密,如果其中某一位點發(fā)生了適應(yīng)性進化,與此相關(guān)的位點通過共進化的方式進行補償突變,以維持蛋白質(zhì)特定的功能?；诎被崾杷韵嚓P(guān)性值統(tǒng)計出的共進化組(對)揭示它們的共同作用對保持蛋白質(zhì)疏水性具有重要作用?；诎被岱肿恿肯嚓P(guān)性值統(tǒng)計出的共進化組(對)則提示它們同蛋白質(zhì)分子量大小顯著相關(guān)。本文分析得到若干對串珠藻目植物psaA基因內(nèi)部不同位置的共進化組(對),從另一個角度分析了蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸之間的相互關(guān)系,有助于研究蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)特征及其進化歷程,為研究有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)功能和進化提供了優(yōu)先考慮的位點。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,psaA基因作為標(biāo)志分子在藻類植物分類系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用也值得關(guān)注。一般來說,葉綠體基因組具有基因組較小、在進化過程中很少發(fā)生重排、進化速率保守、包含大量的DNA成分可提供足夠數(shù)量的系統(tǒng)發(fā)育信息、編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列進化速率相差較大等特征[32-33],因此,非常適用于不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育分析研究。一般認為,功能蛋白編碼基因受其功能限制,進化速率慢,適于屬間及以上分類單元群體的關(guān)系研究,而非編碼區(qū)基因不參與蛋白質(zhì)的合成,進化速率相對較快,多樣性較高,適合于種內(nèi)及種間的群體關(guān)系研究[34-35]。本研究結(jié)果顯示,psaA基因在串珠藻目中是很保守的,是屬及以上分類單元群體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究的重要分子標(biāo)記。

生物體演化的歷程和分子機制是極其復(fù)雜的,因此,要解釋清楚為何淡水紅藻分布區(qū)狹窄、對生境的要求很特殊,需要繼續(xù)對更多的基因展開深入研究,進一步深化對葉綠體基因為適應(yīng)環(huán)境而發(fā)生的分子水平的適應(yīng)性進化機制的認識。