大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因敲除對(duì)酪氨酸生產(chǎn)的影響

王欽，曾偉主，周景文

大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因敲除對(duì)酪氨酸生產(chǎn)的影響

王欽1,2，曾偉主1,2，周景文1,2

1 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

酪氨酸是三大芳香族氨基酸之一，廣泛用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程為代謝工程改造大腸桿菌選育酪氨酸生產(chǎn)菌株提供了一種重要的研究策略。大腸桿菌中酪氨酸胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過(guò)和基因編碼的通透酶進(jìn)行調(diào)控。以酪氨酸生產(chǎn)菌株HGXP為出發(fā)菌株，利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了和基因敲除菌，并通過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)考察了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)酪氨酸生產(chǎn)的影響。發(fā)酵結(jié)果表明，和基因敲除菌酪氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到3.74 g/L和3.45 g/L，較出發(fā)菌株酪氨酸產(chǎn)量分別提高了19%和10%。對(duì)誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明38 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。在3L發(fā)酵罐上進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵，和基因敲除菌酪氨酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高至44.5 g/L和35.1 g/L，較出發(fā)菌株酪氨酸產(chǎn)量分別提高了57%和24%。研究結(jié)果對(duì)代謝工程強(qiáng)化大腸桿菌生產(chǎn)酪氨酸具有重要的參考價(jià)值。

大腸桿菌，L-酪氨酸，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，基因敲除

酪氨酸 (L-tyrosine，Tyr) 是一種人體的條件必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、化工等行業(yè)。酪氨酸常被用作苯丙酮尿癥患者的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[1]，也是多肽類(lèi)激素、抗生素、L-多巴等醫(yī)藥化工產(chǎn)品的制備原料[2]，以及合成如白藜蘆醇、柚皮素、生松素等高附加值酪氨酸衍生物的前體[3-5]。目前，工業(yè)上主要由酶法來(lái)制備酪氨酸[6]，雖然其具有周期短、選擇性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化率高和分離純化步驟簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但天然酶活性低和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)限制了酶法的應(yīng)用[7-8]。與酶法相比，微生物發(fā)酵法可以利用生物質(zhì)原料實(shí)現(xiàn)酪氨酸的從頭合成，可以降低生產(chǎn)成本。代謝工程和先進(jìn)生物技術(shù)的快速發(fā)展為合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化微生物的代謝途徑以生產(chǎn)酪氨酸提供了有力的工具[9-10]，因此微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酪氨酸具有非常廣闊的發(fā)展前景[11-12]。

目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酪氨酸的研究主要集中在提高前體物質(zhì)供應(yīng)、解除反饋抑制、阻斷競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑等方面，但對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究較少[13-15]。酪氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)涉及到細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境的感應(yīng)，對(duì)優(yōu)化代謝途徑也起到了重要的作用[16]。大腸桿菌中酪氨酸的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)主要是由和基因編碼的通透酶進(jìn)行調(diào)控。AroP通透酶為通用芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。TyrP通透酶為酪氨酸特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體，特異性地將酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)。在大腸桿菌中，DAHP合成酶(DS)催化酪氨酸合成的前體物4-磷酸赤蘚糖(Erythrose-4-phosphate，E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)縮合生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，它包含AroG、AroF和AroH這3個(gè)同工酶，它們的活性分別受胞內(nèi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的反饋?zhàn)瓒艉头答佉种芠17]。胞內(nèi)酪氨酸積累過(guò)高會(huì)抑制DAHP合成酶的表達(dá)，進(jìn)而影響酪氨酸的合成。本研究以酪氨酸生產(chǎn)菌株HGXP為出發(fā)菌株，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)編碼基因和，從而減弱酪氨酸向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，一定程度上減輕酪氨酸的積累對(duì)DAHP合成酶的阻遏作用。并通過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)考察了酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因的敲除對(duì)大腸桿菌菌體生長(zhǎng)和酪氨酸生產(chǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

出發(fā)菌株為酪氨酸生產(chǎn)菌株HGXP，其宿主菌HGX由大腸桿菌WSH-Z06 (pAP-B03) 通過(guò)連續(xù)傳代消除pAP-B03質(zhì)粒選育而來(lái)[18]。HGXP帶有pAP-aroG-tyrA質(zhì)粒，pAP-aroG-tyrA質(zhì)粒帶有抗反饋抑制的大腸桿菌酪氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因aroG和，具有PP啟動(dòng)子和Kan抗性篩選標(biāo)記。酪氨酸生產(chǎn)菌株HGXP由實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)基因工程手段構(gòu)建。本研究以

HGXP為出發(fā)菌株，分別構(gòu)建了和單基因敲除菌。基因敲除所需的工具質(zhì)粒pCas和pTarget由中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所提供[19]。本研究中所使用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10。

酪氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖35，蛋白胨4，酵母粉2，(NH4)2SO45，KH2PO43，MgSO4·7H2O 3，NaCl 1，檸檬酸鈉 1.5，CaCl2·2H2O 0.015，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.112 5，維生素B10.075，微量元素營(yíng)養(yǎng)液(TES) 1.5 mL/L，卡那霉素0.04，pH 6.8±0.1。搖瓶發(fā)酵時(shí)，添加12 g/L CaCO3用于調(diào)節(jié)pH。

TES (g/L)：Al2(SO4)3·18H2O 2.0，CoSO4·7H2O 0.75，CuSO4·5H2O 2.5，H3BO30.5，MnSO4·H2O 24，Na2MoO4·2H2O 3.0，NiSO4·6H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 15。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨和酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司。NaCl、葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、檸檬酸鈉、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、維生素B1、CaCO3、Al2(SO4)3·18H2O、CoSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、NiSO4·6H2O、ZnSO4·7H2O均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(上海)?？敲顾?Kan)、壯觀霉素(Spc)、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和高效制備感受態(tài)細(xì)胞試劑盒均購(gòu)于生工生物工程(上海) 股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除大腸桿菌目的基因

Jiang等[19]先前描述了在大腸桿菌K12基因組中敲除目的基因的方法。此方法采用了雙質(zhì)粒系統(tǒng)，其中一個(gè)為含有Cas9編碼基因的pCas質(zhì)粒，另一個(gè)為含有打靶目的基因的sgRNA的pTarget質(zhì)粒。將pTarget質(zhì)粒和目的基因上下游同源臂同時(shí)通過(guò)電轉(zhuǎn)化到含有pCas質(zhì)粒的細(xì)胞中，可以達(dá)到敲除目的基因的目的。pCas質(zhì)粒在終濃度為0.01 mol/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)下，合成重組酶，更有利于同源重組的發(fā)生。pTarget質(zhì)粒會(huì)組成型的產(chǎn)生靶向目的基因的sgRNA，與pCas質(zhì)粒產(chǎn)生的Cas9蛋白結(jié)合，sgRNA 20 bp的N20序列與目的基因堿基配對(duì)成功后Cas9蛋白會(huì)切斷目的基因的雙鏈。如果此20 bp定位在基因組上，那么基因組就會(huì)被切斷，從而無(wú)法繁殖。但是如果同時(shí)導(dǎo)入線性的同源臂，在切口兩側(cè)發(fā)生同源重組，那么同源臂就會(huì)取代原來(lái)的基因序列，而使得繁殖繼續(xù)下去。pCas質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生定位在pTarget質(zhì)粒上的sgRNA，從而消化pTarget質(zhì)粒，pCas質(zhì)粒本身在42 ℃下會(huì)被消除，因此可以把敲除目的基因的菌株中兩個(gè)質(zhì)粒消除掉。本研究所用引物見(jiàn)表2。

表1 本研究所使用的菌株和質(zhì)粒

1.2.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從LB平板上挑取單菌落接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10–14 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液以10%的接種量，接種至裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵溫度33 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至600為1.5–2.0時(shí)，升溫至38 ℃誘導(dǎo)產(chǎn)L-酪氨酸。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量接入裝有1.1 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，通過(guò)流加20%的氨水控制pH在6.7–6.9，發(fā)酵溫度33 ℃，待菌體濃度達(dá)到600=23–27時(shí)，升溫至38 ℃誘導(dǎo)產(chǎn)L-酪氨酸。初始轉(zhuǎn)速400 r/min，當(dāng)溶解氧 (Dissolved oxygen，DO) 降至20%以下時(shí)逐步提高轉(zhuǎn)速使DO維持在20%以上，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖基本耗盡時(shí)，流加700 g/L的葡萄糖使培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度維持在10 g/L以?xún)?nèi)。

1.2.3 菌體濃度的測(cè)定

測(cè)定發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)中的菌體濃度需在定容前加6 mol/L的HCl溶解發(fā)酵液中的酪氨酸，處理后的發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心10 min，棄上清。菌體沉淀用去離子水洗滌2次，離心后得到的濕菌體在105 ℃下烘干至恒重，計(jì)算出細(xì)胞干重(Dry cell weight，DCW)。發(fā)酵液稀釋至適當(dāng)?shù)姆秶?，使?22s型分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm處的吸光度(600)，得到600與DCW的關(guān)系式。在本研究中，DCW(g/L)=0.364×600。

表2 本研究所用引物

The underlined part of the aroP-up-R, aroP-down-F, tyrP-up-R and tyrP-down-F primer sequences indicate homology extensions; the underlined part of aroP-sgRNA-F and tyrP-sgRNA-F primer sequences indicate N20sequences.

1.2.4 葡萄糖濃度的測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心5 min，上清液稀釋一定倍數(shù)，采用葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀(深圳西爾曼科技有限公司) 測(cè)定葡萄糖濃度。

1.2.5 發(fā)酵液樣品的處理方法

由于酪氨酸在室溫和中性pH下在水中的溶解度很低，因此在發(fā)酵過(guò)程中采集的大多數(shù)樣品具有大量以晶體形式存在的酪氨酸固體。將發(fā)酵液樣品以1∶1的比例用6 mol/L HCl稀釋?zhuān)瑴u旋振蕩，以確保酪氨酸完全溶解。用去離子水將發(fā)酵液樣品進(jìn)一步稀釋使最終產(chǎn)物濃度達(dá)到分析方法的測(cè)量范圍。渦旋振蕩，12 000 r/min離心10 min。收集上清液并過(guò)濾得到處理后的發(fā)酵液樣品用于高效液相色譜測(cè)定。

1.2.6 L-酪氨酸的測(cè)定

采用高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中L-酪氨酸的含量。色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流動(dòng)相為0.1 mol/L乙酸鈉(冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0) 和甲醇，體積百分比為90%和10%，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 aroP和tyrP基因敲除菌的構(gòu)建

由于酪氨酸合成關(guān)鍵酶的表達(dá)質(zhì)粒pAP-aroG-tyrA和基因敲除的工具質(zhì)粒pCas都是Kan抗性篩選標(biāo)記，為避免pAP-aroG-tyrA質(zhì)粒影響基因敲除菌的篩選，本研究首先在宿主菌HGX內(nèi)進(jìn)行酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因敲除，然后通過(guò)轉(zhuǎn)化pAP-aroG-tyrA質(zhì)粒獲得出發(fā)菌株HGXP的基因敲除菌。利用引物up-F和up-R擴(kuò)增得到目的基因上游同源臂，利用引物down-F和down-R擴(kuò)增得到目的基因下游同源臂，利用融合PCR技術(shù)擴(kuò)增得到目的基因上下游同源臂。利用引物sgRNA-F和sgRNA-R以pTarget-質(zhì)粒為模板通過(guò)全質(zhì)粒PCR獲得帶有目的基因N20序列的pTarget質(zhì)粒，用引物sgRNA-v-F和sgRNA-v-R對(duì)構(gòu)建的pTarget質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖1A)。若能得到大小為500 bp左右的條帶，則證明pTarget質(zhì)粒構(gòu)建成功。將pTarget質(zhì)粒和同源臂同時(shí)通過(guò)電轉(zhuǎn)化到含有pCas質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞中，使用引物up-F和down-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(圖1B)。若基因敲除成功則應(yīng)得到大小約1 000 bp的同源臂片段。將樣品送至生工生物工程(上海) 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，核酸序列與同源臂序列一致，結(jié)果表明和基因已經(jīng)成功敲除。將含有酪氨酸合成關(guān)鍵酶基因的質(zhì)粒pAP-aroG-tyrA分別轉(zhuǎn)化至和基因敲除菌中，獲得酪氨酸基因工程菌HGPP和HGEP。

圖1 菌落PCR驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 酪氨酸基因工程菌的搖瓶發(fā)酵

為了初步考察大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因敲除對(duì)菌株生產(chǎn)酪氨酸的影響，對(duì)出發(fā)菌株HGXP及構(gòu)建的酪氨酸基因工程菌HGPP和HGEP進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。如圖2A所示，與對(duì)照菌株相比，基因敲除菌HGPP的最高600與對(duì)照菌株相比降低了8%；基因敲除菌HGEP的最高600與對(duì)照菌株相比提高了14%。說(shuō)明基因的敲除對(duì)菌株生長(zhǎng)有一定抑制作用，而基因的敲除對(duì)菌株的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，由于菌株的生長(zhǎng)涉及到一系列復(fù)雜的調(diào)控，其原因有待于進(jìn)一步探究。在酪氨酸生產(chǎn)方面，基因敲除菌HGPP發(fā)酵48 h的酪氨酸產(chǎn)量為3.74 g/L，與對(duì)照菌株HGXP相比提高了19%；基因敲除菌HGEP發(fā)酵48 h的酪氨酸產(chǎn)量為3.45 g/L，與對(duì)照菌株相比提高了10% (圖2B)。結(jié)果表明，在HGXP菌株中敲除轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因和均對(duì)酪氨酸的生產(chǎn)有積極影響，基因的敲除較基因的敲除更有利于酪氨酸的生產(chǎn)。發(fā)酵條件的優(yōu)化有望進(jìn)一步提高酪氨酸基因工程菌生產(chǎn)酪氨酸的能力。

2.3 酪氨酸基因工程菌的誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

由于酪氨酸合成關(guān)鍵酶的表達(dá)質(zhì)粒pAP-aroG-tyrA為熱誘導(dǎo)型質(zhì)粒，誘導(dǎo)溫度與酪氨酸生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)有著密切的聯(lián)系，而且在不同的溫度下酪氨酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶的酶活和穩(wěn)定性也會(huì)受到影響。因此本實(shí)驗(yàn)考察了不同的誘導(dǎo)溫度(36 ℃、38 ℃、40 ℃) 對(duì)酪氨酸生產(chǎn)菌株生產(chǎn)酪氨酸的影響。發(fā)酵48 h的酪氨酸產(chǎn)量如 圖3所示，在38 ℃的誘導(dǎo)條件下，HGXP、HGPP和HGEP菌株的酪氨酸產(chǎn)量比在33 ℃的培養(yǎng)條件下分別提高了96.7%、77.4%和92.6%；比在36 ℃的誘導(dǎo)條件下分別提高了17%、19%和18%；比在40 ℃的誘導(dǎo)條件下分別提高了8%、9%和12%。結(jié)果表明采用38 ℃的誘導(dǎo)溫度可以提高酪氨酸基因工程菌生產(chǎn)酪氨酸的能力，因此在3 L發(fā)酵罐水平上可以采用38 ℃的誘導(dǎo)條件來(lái)進(jìn)一步探究其生產(chǎn)酪氨酸的能力。

圖2 大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因敲除菌的搖瓶發(fā)酵

圖3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

2.4 酪氨酸基因工程菌的補(bǔ)料分批發(fā)酵

由搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)得知，和基因敲除菌的酪氨酸生產(chǎn)能力較出發(fā)菌株HGXP都有提升。在3-L發(fā)酵罐上出發(fā)菌株HGXP的酪氨酸產(chǎn)量最高為28.3 g/L，為了進(jìn)一步考察酪氨酸基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)酪氨酸的潛力，在3-L發(fā)酵罐上分別對(duì)HGPP和HGEP菌株進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵的探究。如圖4所示，雖然在搖瓶水平上HGPP的生長(zhǎng)情況不如HGEP，但是在發(fā)酵罐水平由于溶氧更為充足，2個(gè)菌株的最大DCW相近，分別為26.65 g/L和25.96 g/L。在酪氨酸生產(chǎn)方面，HGPP菌株發(fā)酵46 h的酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到44.5 g/L，與出發(fā)菌株相比酪氨酸產(chǎn)量提高了57%，底物轉(zhuǎn)化率為0.179，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.967 g/(L·h)。HGEP菌株發(fā)酵46 h，可以生產(chǎn)35.1 g/L的酪氨酸，與出發(fā)菌株相比酪氨酸產(chǎn)量提高了24%，底物轉(zhuǎn)化率為0.143，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.763 g/(L·h) (表3)。結(jié)果表明，HGPP的底物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度都大于HGEP，進(jìn)一步證明了在HGXP菌株中基因敲除相較于基因敲除更有利于酪氨酸的生產(chǎn)。因此基因敲除菌可以作為酪氨酸生產(chǎn)的潛在優(yōu)勢(shì)菌株。

圖4 大腸桿菌HGPP和HGEP的補(bǔ)料分批發(fā)酵

3 討論

L-酪氨酸的生物合成途徑已得到廣泛的研究[21]，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造為代謝工程育種提供了重要的研究方向[22]。由于目前仍有許多氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)功能基因尚未得到鑒定，因此只有少數(shù)文獻(xiàn)考察了轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程對(duì)氨基酸生物合成的影響[23-25]。在最近的一項(xiàng)研究中，Kim等[26]構(gòu)建了一株生產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌菌株，通過(guò)在基因敲除菌株中過(guò)表達(dá)aroG、和，可以產(chǎn)生43.1 g/L酪氨酸。這是首次報(bào)道在大腸桿菌中通過(guò)改造酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)酪氨酸。在本研究中分別構(gòu)建了和基因敲除菌，由于同時(shí)敲除和基因后，菌株的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，酪氨酸產(chǎn)量與對(duì)照菌株相比沒(méi)有提高，因此我們著重考察了酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)單基因敲除對(duì)菌株生產(chǎn)酪氨酸的影響。結(jié)果表明，和單基因敲除菌的酪氨酸產(chǎn)量與對(duì)照菌HGXP相比分別提高了19%和10%。

表3 大腸桿菌HGPP和HGEP補(bǔ)料分批發(fā)酵參數(shù)比較

我們又對(duì)酪氨酸生產(chǎn)菌的誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在38 ℃下誘導(dǎo)關(guān)鍵酶的表達(dá)最有利于酪氨酸的生產(chǎn)。在進(jìn)一步的補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)中，酪氨酸最高產(chǎn)量為單基因敲除菌的44.5 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為0.179，由于僅敲除了一個(gè)基因，對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響較小，因此可以進(jìn)行后續(xù)的分子改造以進(jìn)一步提高其生產(chǎn)酪氨酸的能力。

本研究所構(gòu)建的酪氨酸生產(chǎn)菌株為熱誘導(dǎo)型菌株，相較于其他需要添加價(jià)格昂貴的誘導(dǎo)劑的工程菌株具有經(jīng)濟(jì)節(jié)約且不易染菌的優(yōu)點(diǎn)，更適合進(jìn)行工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)。同時(shí)，對(duì)酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究也為代謝工程育種提供了重要的研究策略。

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Effect of gene knockout of L-tyrosine transport system on L-tyrosine production in Escherichia coli

Qin Wang1,2, Weizhu Zeng1,2, and Jingwen Zhou1,2

1 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

L-tyrosine is one of three aromatic amino acids that are widely used in food, pharmaceutical and chemical industries. The transport system engineering provides an important research strategy for the metabolic engineering ofto breed L-tyrosine producing strain. The intracellular transport of L-tyrosine inis mainly regulated by two distinct permeases encoded byandgenes. Theandgene knockout mutants were constructed by CRISPR-Cas technique on the basis of L-tyrosine producing strain HGXP, and the effects of regulating transport system on L-tyrosine production were investigated by fermentation experiments. The fermentation results showed that theandknockout mutants produced 3.74 and 3.45 g/L L-tyrosine, respectively, which were 19% and 10% higher than that of the original strain. The optimum induction temperature was determined to be 38 °C. Fed-batch fermentation was carried out on a 3-L fermentor. The L-tyrosine yields ofandknockout mutants were further increased to 44.5 and 35.1 g/L, respectively, which were 57% and 24% higher than that of the original strain. The research results are of great reference value for metabolic engineering ofto produce L-tyrosine.

, L-tyrosine, transport system, gene knockout

December 25, 2018;

January 31, 2019

National Science Fund for Excellent Young Scholars (No. 21822806), National Natural Science Foundation of China (No. 31770097).

Jingwen Zhou. Tel: +86-510-85918312; E-mail: zhoujw1982@jiangnan.edu.cn

國(guó)家優(yōu)秀青年科學(xué)基金(No. 21822806)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31770097) 資助。

2019-03-12

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190311.1553.005.html

王欽, 曾偉主, 周景文. 大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因敲除對(duì)酪氨酸生產(chǎn)的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(7): 1247–1255.

Wang Q, Zeng WZ, Zhou JW. Effect of gene knockout of L-tyrosine transport system on L-tyrosine production in. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1247–1255.

(本文責(zé)編 陳宏宇)