發(fā)酵乳桿菌多銅氧化酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

徐潔，方芳,2

發(fā)酵乳桿菌多銅氧化酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

徐潔1，方芳1,2

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

生物胺是一種存在于發(fā)酵食品中的含氮小分子有機(jī)化合物，過(guò)量攝入可能引起過(guò)敏或其他不良反應(yīng)。利用酶法降解是減少發(fā)酵食品中生物胺含量從而保障食品安全的有效方法之一。文中成功克隆了來(lái)源于發(fā)酵乳桿菌的多銅氧化酶基因，在大腸桿菌中表達(dá)的酶活水平為484 U/L。通過(guò)鎳柱親和層析方法獲得了此多銅氧化酶的純酶。該多銅氧化酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH為3.5，其m為1.3 mmol/L，max為7.67×10–2mmol/(L?min)。對(duì)酶的應(yīng)用特性研究表明，來(lái)源于發(fā)酵乳桿菌的多銅氧化酶對(duì)18% (/) NaCl有一定的耐受性，并可降解包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺在內(nèi)的7種生物胺。其中它對(duì)組胺和酪胺的降解能力最高，分別為51.6%和40.9%。此外，該酶對(duì)醬油中的生物胺也有普遍降解作用，使用較低酶量(500 U/L) 時(shí)，對(duì)醬油中總胺的降解率達(dá)到10.6%。多銅氧化酶具備降解發(fā)酵食品中生物胺的潛力，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)這類食品酶的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

多銅氧化酶，生物胺，克隆表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)酵乳桿菌

生物胺(Biogenic amines, BAs)是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類低分子量含氮有機(jī)化合物的總稱，是合成核酸、蛋白質(zhì)、生物堿等的前體物質(zhì)[1]。人體自身合成的生物胺可促進(jìn)正常生理活動(dòng)，而通過(guò)食物攝入過(guò)量生物胺會(huì)引起頭疼、心悸、腹瀉嘔吐等不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可能危及生命[2-4]。生物胺的潛在毒性作用對(duì)人體健康構(gòu)成的危害不容小覷，而發(fā)酵食品與發(fā)酵酒精飲料中普遍存在生物胺，因此應(yīng)采取有效措施進(jìn)行控制和減少[5-7]。

目前用于控制和減少發(fā)酵產(chǎn)品中的生物胺的方法，主要有對(duì)生產(chǎn)原料進(jìn)行優(yōu)化、減少發(fā)酵體系中產(chǎn)生物胺的微生物以及酶法降解這三種。前兩種方法對(duì)加工設(shè)備的要求較高，很大可能會(huì)影響產(chǎn)品的風(fēng)味，因此在實(shí)際生產(chǎn)中使用時(shí)存在一定的局限性[8]。利用酶法降解生物胺，基本不影響發(fā)酵食品生產(chǎn)工藝，對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味的影響也較小[9-11]。已報(bào)道的可以降解生物胺的酶有胺氧化酶(Amine oxidases, AOs)、組胺脫氫酶(Histamine dehydrogenase, HADH) 和多銅氧化酶(Multicopper oxidase, MCO)[12-14]。胺氧化酶和組胺脫氫酶只特異性作用于某個(gè)或某幾個(gè)生物胺，它們的活性也分別受乙醇和羰基化合物的抑制，且最適pH多為中性，因此這兩類酶的實(shí)際應(yīng)用還存在較多問(wèn)題[15]。多銅氧化酶催化生物胺氧化生成對(duì)應(yīng)的醛、氨和水，從而達(dá)到分解生物胺的效果[16-19]。雖然現(xiàn)在已報(bào)道的多銅氧化酶能降解一種或多種生物胺[9,20-21]，但是尚缺少對(duì)這些多銅氧化酶酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用特性的深入研究。

因此，尋找可用于降解發(fā)酵食品中生物胺的多銅氧化酶并對(duì)其酶學(xué)和應(yīng)用特性進(jìn)行研究，對(duì)于建立發(fā)酵食品中生物胺的酶法減控方法具有重要的意義。本研究旨在篩選獲得具有降解生物胺能力的多銅氧化酶，并對(duì)其最適反應(yīng)pH、溫度等酶學(xué)性質(zhì)及酶降解生物胺的能力進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用細(xì)菌菌株以及質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保藏(表1)。

1.2 試劑及儀器

試劑：1,7-二氨基庚烷、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、DNA連接酶均為TaKaRa產(chǎn)品，其他試劑為分析純?cè)噭?/p>

儀器：Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)以及AKTA蛋白純化儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；安捷倫1260高效液相色譜(HPLC) 購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司。

1.3 產(chǎn)生物胺降解酶菌株的篩選

將分離自各類發(fā)酵食品中的6株細(xì)菌在MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)20 h后，8 000 r/min離心10 min收集菌體并用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體2次。將菌體以108CFU/mL的濃度與醬油混勻37 ℃靜置反應(yīng)24 h。然后10 000 r/min離心5 min后取上清液，用HPLC測(cè)定生物胺的含量，比較各菌株的降解生物胺能力[22]。

表1 本研究所用質(zhì)粒和菌株

1.4 多銅氧化酶的克隆表達(dá)與純化

1.4.1 表達(dá)多銅氧化酶重組菌的構(gòu)建

以發(fā)酵乳桿菌基因組為模板，用引物MCOF/MCOR (MCOF: 5?-CCGGAATTCATGAAA ACCTATACGGACTATTTC-3?; MCOR: 5?-CCCAA GCTTTTAGTGGTGGTGGTGATGATGCATTTTC>ATCCCCATTT-3?) 擴(kuò)增其多銅氧化酶基因，PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a均用RⅠ和d Ⅲ進(jìn)行雙酶切和連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。提取含有正確序列轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，構(gòu)建的表達(dá)多銅氧化酶的重組菌命名為BL21- pET28a-MCO。

1.4.2 重組多銅氧化酶的表達(dá)與純化

重組菌用LB培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素) 37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。然后按1% () 轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基 (含50 mg/L卡那霉素)，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至600為 0.6?0.8，加入1 mmol/L的Cu2+和0.1 mmol/L IPTG，在20 ℃培養(yǎng)20 h。

菌液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min后收集菌體，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 PBS (pH 7.4)洗滌菌體2次后重懸菌體，再進(jìn)行超聲破碎。離心(4 ℃，12 000 r/min，20 min) 收集上清制得多銅氧化酶粗酶液。重組多銅氧化酶的純化采用鎳柱純化，用0.5 mol/L咪唑溶液(pH 7.4) 進(jìn)行梯度洗脫，收集有活性的組分進(jìn)行脫鹽處理后用于后續(xù)分析和研究。

1.5 多銅氧化酶活力測(cè)定

采用可見(jiàn)光吸收法測(cè)定多銅氧化酶活力[20]：即以2,2?-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 為底物，通過(guò)檢測(cè)酶氧化ABTS的量計(jì)算多銅氧化酶酶活。反應(yīng)時(shí)間為2 min，反應(yīng)體系為100 μL酶液、2.9 mL含0.5 mmol/L ABTS和1 mmol/L CuCl2的檸檬酸鈉緩沖液。將每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。酶活計(jì)算公式如下所示：

式中：ε為ABTS在420 nm下的摩爾吸光系數(shù)，ε=3.6×104L/(mol?cm)；Δ為反應(yīng)時(shí)間(min)；Δ為420 nm處吸光度的變化值；1為反應(yīng)總體積(mL)；2為酶量(100 μL)。

1.6 重組多銅氧化酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 重組酶的最適反應(yīng)溫度及pH

測(cè)定酶的最適反應(yīng)溫度和pH時(shí)，除了反應(yīng)溫度和pH外，其他條件與測(cè)定多銅氧化酶酶活的反應(yīng)條件相同?？疾鞙囟葹?5?70 ℃，pH為2.5?5.0 (50 mmol/L乙酸鈉緩沖液)，5.5?7.0 (50 mmol/L PBS緩沖液)，7.5?8.5 (50 mmol/L Tris-HCl緩沖液)。

1.6.2 金屬離子和鹽對(duì)重組多銅氧化酶酶活的影響

金屬離子對(duì)酶活的影響：將酶液與1 mmol/L的金屬離子緩沖液混合，保溫10 min后測(cè)定酶活力，以未加金屬離子的為對(duì)照。

NaCl對(duì)重組多銅氧化酶穩(wěn)定性的影響：將酶液在含有10%、15%、18%和20% (/) 的NaCl緩沖液中放置1 h后測(cè)定酶活力，以未加NaCl的為對(duì)照。

1.6.3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

在最適反應(yīng)條件下，分別測(cè)定體系中含有0.1?1.0 mmol/L ABTS時(shí)的酶活，根據(jù)Lineweaver- Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算得到重組多銅氧化酶的m、max值。

1.6.4 重組多銅氧化酶對(duì)單個(gè)生物胺的降解能力分析

將100 U/L多銅氧化酶分別與濃度為50 mg/L的組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺溶液混合，于37 ℃靜置48 h后測(cè)定生物胺的含量，對(duì)照組為不加酶的生物胺溶液，分析重組多銅氧化酶對(duì)不同底物的降解能力。

1.7 重組多銅氧化酶對(duì)混合生物胺的降解

將500 U/L多銅氧化酶分別加入生物胺溶液和市售醬油中，于37 ℃靜置24 h后測(cè)定生物胺的含量，對(duì)照組為不加酶的生物胺溶液或市售醬油。生物胺溶液中各生物胺的濃度依據(jù)市售醬油中生物胺含量配置，其組成為：色胺20 mg/L，腐胺、尸胺和亞精胺50 mg/L，苯乙胺150 mg/L，組胺和酪胺200 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 降生物胺菌株的選擇

為了篩選一種可以用于降解發(fā)酵食品中生物胺的酶，本研究考察了6株來(lái)源于發(fā)酵食品的細(xì)菌降解醬油中生物胺的能力。由圖1可以看出，發(fā)酵乳桿菌對(duì)總胺的降解率最高，為16.1%；此外，它對(duì)酪胺、組胺的降解作用最強(qiáng)，降解率分別為23.0%和10.0%。發(fā)酵食品中酪胺和組胺含量相對(duì)比較高，而且組胺由于其危害性較大是食品中限量規(guī)定的代表性生物胺[23]。在考察的6株細(xì)菌中，發(fā)酵乳桿菌是最具降解發(fā)酵食品中生物胺潛力的菌株。因此，選擇它用于生物胺降解酶的相關(guān)研究。

2.2 多銅氧化酶的異源表達(dá)與純化

通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找發(fā)酵乳桿菌基因組中編碼多銅氧化酶基因的同源序列，設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增的引物(MCOR和MCOF)。以發(fā)酵乳桿菌Y29基因組DNA為模板，成功擴(kuò)增了發(fā)酵乳桿菌Y29基因組中編碼多銅氧化酶的基因(圖2)。將此PCR產(chǎn)物與載體pET28a經(jīng)酶切連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，成功構(gòu)建了表達(dá)重組多銅氧化酶的.BL21 pET28a-MCO。

圖1 菌株降解醬油中生物胺能力的比較

圖2發(fā)酵乳桿菌Y29中編碼多銅氧化酶基因的擴(kuò)增

重組菌.BL21 pET28a-MCO表達(dá)重組多銅氧化酶的情況見(jiàn)圖3A。經(jīng)測(cè)定，重組多銅氧化酶在大腸桿菌中的表達(dá)水平為484 U/L，其分子量約為58 kDa。將此粗酶液通過(guò)鎳柱親和層析，得到了重組多銅氧化酶純酶(圖3B)。

2.3 MCO的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 多銅氧化酶的最適反應(yīng)pH及溫度

通過(guò)考察發(fā)現(xiàn)，重組多銅氧化酶的最適反應(yīng)pH為3.5，當(dāng)反應(yīng)pH為3.0–4.5時(shí)，酶的活性大于50% (圖4A)。該重組多銅氧化酶的最適反應(yīng)pH值與植物乳桿菌來(lái)源的多銅氧化酶相同[21]，而來(lái)源于地衣芽孢桿菌和假單胞菌sp. 593的多銅氧化酶最適反應(yīng)pH則略高[24-25]。對(duì)來(lái)源于發(fā)酵乳桿菌的MCO的最適反應(yīng)pH研究表明，該MCO為酸性酶，因此具有應(yīng)用于發(fā)酵食品的潛力。

圖3 重組多銅氧化酶的表達(dá)與純化

由圖4B可知，重組多銅氧化酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，50 ℃時(shí)重組酶的活性是30 ℃時(shí)的1.7倍。

2.3.2 金屬離子和鹽對(duì)多銅氧化酶酶活的影響

由于金屬離子與多銅氧化酶的催化氧化反應(yīng)之間有一定關(guān)系，因此本研究考察了金屬離子對(duì)重組多銅氧化酶酶活的影響。由圖5A可知，Cu2+、Ni2+和Mg2+對(duì)重組多銅氧化酶均有激活作用，其中Cu2+對(duì)重組多銅氧化酶的激活作用最大，使酶活提高了1.89倍。Cu2+對(duì)重組多銅氧化酶的激活作用，可能與多銅氧化酶含有4個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)[26]。Mn2+、Zn2+和Fe2+對(duì)酶有抑制作用，F(xiàn)e2+對(duì)酶活的抑制作用最明顯，在其存在下酶活僅為對(duì)照的57.7%。

圖4 重組多銅氧化酶的最適反應(yīng)pH和溫度

Fig. 4 Detection of the optimal pH (A) and temperature (B) of the recombinant MCO for enzymatic reaction.

醬油是一個(gè)高鹽食品體系，NaCl濃度約為18% ()。考察多銅氧化酶對(duì)鹽的耐受性，有助于為該酶在高鹽發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供參考。由圖5B可以看出，重組多銅氧化酶在NaCl存在的條件下，酶活均受到一定程度的抑制，但在18% () NaCl中其活性仍有39.3%。該重組酶與漆酶同屬于多銅氧化酶家族，漆酶在低pH環(huán)境中酶活受到陰離子的抑制同時(shí)可以被NaCl激活，因此10%與15%的NaCl對(duì)酶活的抑制高于18%的NaCl，可能與pH和NaCl對(duì)酶的協(xié)同作用相關(guān)[27-29]。

2.3.3 多銅氧化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以ABTS為底物，通過(guò)測(cè)定最適反應(yīng)條件下反應(yīng)體系中含有不同濃度底物時(shí)的酶活性，得到用于分析MCO酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖(圖6)。由圖6求得的重組發(fā)酵乳桿菌MCO的m值為1.3 mmol/L，max為7.67×10–2mmol/(L?min)。該重組多銅氧化酶的m低于克雷白氏桿菌sp.來(lái)源的多銅氧化酶(m=5.63 mmol/(L·min))[26]，略高于蒼白桿菌sp.來(lái)源的多銅氧化酶(m=0.072 mmol/(L·min))[30]。

2.4 多銅氧化酶對(duì)單個(gè)生物胺的降解能力

為研究重組多銅氧化酶可降解生物胺的種類和能力，考察了重組多銅氧化酶對(duì)單個(gè)生物胺的降解情況。由圖7可以看出，除精胺外，重組多銅氧化酶對(duì)考察的8種生物胺中的7種生物胺均有降解效果。其中對(duì)組胺、酪胺、腐胺、亞精胺的降解效果最顯著，分別降低了51.6%、40.9%、40.7%和38.2%。與來(lái)源于植物乳桿菌的多銅氧化酶和來(lái)源于金黃節(jié)桿菌的胺氧化酶相比[13]，該重組酶降解組胺、酪胺的能力高，且降解譜廣。

圖6 雙倒數(shù)作圖法測(cè)定MCO酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖7 重組多銅氧化酶對(duì)單個(gè)生物胺的降解

2.5 多銅氧化酶降解生物胺特性研究

為進(jìn)一步揭示來(lái)源于發(fā)酵乳桿菌Y29的多銅氧化酶降解生物胺的能力，考察了其在對(duì)混合生物胺溶液(根據(jù)市售醬油中各類生物胺的含量范圍配置，生物胺總量為 (720±15 mg/L) 和市售醬油中生物胺的降解效果。在混合生物胺體系中，多銅氧化酶可以降解除精胺外的色胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、酪胺、亞精胺和組胺7種生物胺，其中對(duì)組胺的降解率最高，達(dá)到81.5%，對(duì)總胺的降解率為41.7% (圖8A)。與來(lái)源于J16和乳酸片球菌CECT 5930的多銅氧化酶相比，該重組酶降解組胺的能力高，且降解譜廣，來(lái)源于J16的多銅氧化酶對(duì)組胺的降解率為36%且僅能降解3種生物胺，來(lái)源于CECT 5930的多銅氧化酶不能降解組胺且僅能降解酪胺這一種生物胺[21,31]。由圖8B可以看出，本研究所用市售醬油中生物胺總量為881±13 mg/L，多銅氧化酶在此體系中可以降解除精胺外的7種生物胺，它對(duì)組胺和酪胺的降解效果較好，降解率分別為11.3%和6.8%，對(duì)總胺的降解率為10.6% (圖8B)。目前尚未有關(guān)于重組多銅氧化酶應(yīng)用于醬油降解生物胺的報(bào)道，但Rosa Guarcell等的研究表明CB9CT、副干酪乳桿菌CACIO6CT、戊糖片球菌M1能降解奶酪中生物胺都與其含有多銅氧化酶相關(guān)，因此本研究的重組多銅氧化酶具備降解發(fā)酵食品中生物胺的應(yīng)用潛力[32]。

圖8 重組多銅氧化酶對(duì)混合生物胺和醬油中生物胺的降解

3 結(jié)論

利用生物酶法減少發(fā)酵食品中的生物胺是目前控制食品中生物胺最有前景的途徑。但目前用于降解生物胺的酶種類少、降解譜窄、降解率低，尚不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。本研究通過(guò)分析來(lái)源于發(fā)酵乳桿菌的多銅氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)以及降解生物胺能力發(fā)現(xiàn)，該重組多銅氧化酶可降解包括色胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、酪胺、亞精胺和組胺在內(nèi)的7種生物胺，并且可顯著降低醬油中含量最高的兩種生物胺[33]——組胺和酪胺。此重組多銅氧化酶為酸性酶，對(duì)18%的NaCl有一定的耐受性，在高溫50 ℃時(shí)酶的催化活性顯著提高。此外，該多銅氧化酶具有降解醬油中生物胺的能力，對(duì)總胺降解率達(dá)到了10.6%。本研究初步評(píng)估了來(lái)源于發(fā)酵乳桿菌的多銅氧化酶在發(fā)酵食品體系中降解生物胺的能力，今后通過(guò)構(gòu)建酶的食品級(jí)表達(dá)體系以及優(yōu)化提高酶的表達(dá)水平，有望進(jìn)一步挖掘多銅氧化酶在降解發(fā)酵食品中生物胺的應(yīng)用潛力，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)這類食品酶的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Expression and characterization of a multicopper oxidase from Lactobacillus fermentum

Jie Xu1, and Fang Fang1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Biogenic amines (BAs) are low molecular weight organic compounds that present in fermented foods. Large amount of ingested biogenic amines can cause allergy or significant symptoms. Reduction of BAs by enzymatic reaction in fermented foods is one of the most efficient methods for removal of biohazard compounds and assurance food safety. In this study, the multicopper oxidase (MCO) gene in the genome ofwas successfully cloned inBL21 and expressed at 484 U/L. The recombinant MCO was purified by the immobilized metal affinity chromatography method. The optimal reaction temperature and pH for this enzyme was detected to be 50 °C and 3.5. Themandmaxvalues of the recombinant MCO was determined to be 1.30 mmol/L and 7.67×10-2mmol/(L·min). Moreover, this MCO dramatically degrades histamine and tyramine by 51.6% and 40.9%, and can degrade other BAs including tryptamine, phenylethylamine, putrescine, cadaverine and spermidine, and was found to be tolerant to 18% (/) NaCl. The recombinant MCO is also capable of degrading BAs in soy sauce. The degradation rate of total BAs in soy sauce reaches 10.6% though a relatively low level of enzyme (500 U/L) is used. Multicopper oxidase has the potential to degrade biogenic amines in fermented foods, which lays a foundation for the further application of this kind of food enzymes.

multicopper oxidase, biogenic amines, cloning and expression, enzymatic properties,

December 24, 2018;

February 9, 2019

National Key R&D Program of China (No. 2018YFC1604102), National Natural Science Foundation of China (No. 31771955),National First-class Discipline Program of Light Industry Technology and Engineering (No. LITE2018-08).

Fang Fang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: ffang@jiangnan.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 2018YFC1604102)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31771955)，國(guó)家輕工技術(shù)與工程一流學(xué)科自主課題(No. LITE2018-08)資助。

徐潔, 方芳. 發(fā)酵乳桿菌多銅氧化酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì). 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(7): 1286–1294.

Xu J, Fang F. Expression and characterization of a multicopper oxidase from. Chin J Biotech, 2019, 35(7): 1286–1294.

(本文責(zé)編 陳宏宇)