剩余污泥提取蛋白的改性及其對瓦楞原紙的增強效果

李祥祥，孟祥美，萬月亮，劉廷志，李文志

(天津市制漿造紙重點實驗室，天津科技大學造紙學院，天津 300457)

近10 年來，城鎮(zhèn)生活污水排放量以5%～6%的年增長率不斷增加，2017 年已接近600 億t.作為生活廢水處理的主體工藝——生物處理在處理過程中會產生大量剩余污泥.每年我國約產生1 000 多萬t的絕干污泥.剩余污泥含水量高、易腐敗，對其進行妥善處理面臨著很大挑戰(zhàn).而剩余污泥主要由微生物菌體構成，其細胞質主要成分為蛋白質[1]，因此剩余污泥中蛋白質含量非常高，在40%以上.對剩余污泥中蛋白質進行提取，實現(xiàn)蛋白的資源化利用和污泥減量化處理，是剩余污泥處理切實可行的方法之一.剩余污泥蛋白提取技術目前已經十分成熟[2-3]，如蘇瑞景[4]利用堿性蛋白酶水解剩余污泥提取污泥蛋白，提取率可達到52.5%.天津市裕川有限公司已實現(xiàn)日產30 t 的蛋白提取液的工業(yè)化生產[5].這些提取工藝均有效實現(xiàn)了污泥的減量化目標，但在蛋白資源化、高值化利用方面還需要進一步拓展研究.目前，剩余污泥提取蛋白主要用于泡沫滅火劑、植物營養(yǎng)液、微蛋白有機肥等方面[6-7]，總體規(guī)模受限，且對于剩余蛋白的利用多以低值消耗型利用為主，經濟效益不顯著，蛋白質天然高分子聚合物的優(yōu)勢并沒有得到充分發(fā)揮.開發(fā)污泥蛋白資源在工業(yè)方面的利用才是實現(xiàn)穩(wěn)定高值化利用的根本出路.

目前我國紙和紙板年產量已經超過了1 億t，占全球產量的1/4，但由于受我國用于造紙的林業(yè)資源限制，造紙原料中約70%為再生纖維.再生纖維的多次回用導致紙張強度下降等問題，需要大量增強劑來彌補原料角質化帶來的強度不足問題[8].目前主流的增強劑為改性淀粉和石化合成助劑.淀粉類增強劑用量過大，在回用過程中會大大增加水處理污染負荷，因為在廢紙回用過程中，淀粉類物質會進入水系統(tǒng)，增加有機污染負荷；另外，石化類產品成本高，并存在增加紙張回用過程難度的風險；因此，二者均對造紙工業(yè)循環(huán)經濟發(fā)展存在潛在障礙.蛋白質作為一種天然高分子物質，具有良好的可再生性及可降解性能，是造紙綠色化學品開發(fā)的新型資源，具有廣泛的應用前景.近年來，一些科研人員開展了以植物蛋白等為原料開發(fā)造紙化學品的研究.袁明昆等[9]采用2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨與大豆提取蛋白反應，合成的陽離子大豆分離蛋白具有可生物降解性，可與漿料中的纖維和填料發(fā)生電中和和架橋作用，紙張的抗張指數(shù)、耐破指數(shù)比空白紙樣分別提高17.7%和14.7%.陳夫山等[10]采用環(huán)氧氯丙烷對大豆提取蛋白進行陽離子化改性，改性后蛋白用于包裝紙增強，效果顯著.

本文以剩余污泥提取蛋白為原料，探討剩余污泥提取蛋白羧甲基化改性的工藝條件，并對羧甲基化剩余污泥提取蛋白在瓦楞紙生產中的增強效果進行了研究.剩余污泥提取蛋白可再生，且其生產不占用寶貴的土地資源，將其用于綠色造紙化學品開發(fā)，不僅對剩余污泥資源化、減量化有促進作用，而且對造紙工業(yè)走循環(huán)經濟發(fā)展道路也有很好的推動作用.

1 材料與方法

1.1 實驗原料

污泥蛋白，取自天津濱海某生物技術公司，為城鎮(zhèn)污水處理廠生物處理污泥經堿法提取制備的蛋白液，固含量為40%，蛋白含量32%，經60 ℃低溫真空干燥成提取蛋白粉，備用.

氯乙酸，分析純，天津市大茂化學試劑廠.

國產廢紙箱為電器包裝廢紙箱，手撕成2～3 cm小片，使用前自來水浸泡24 h.疏解、打漿、脫水后冰箱冷藏備用.

1.2 蛋白質羧甲基化反應及原理

本研究采用氯乙酸取代蛋白質分子鏈中酰胺基上的氫原子，改變蛋白分子帶電及電離特性，氯乙酸與蛋白質分子氨基發(fā)生取代反應原理如圖1 所示.

圖1 蛋白質分子與氯乙酸反應原理Fig.1 Reaction mechanism of protein molecule and chloroacetic acid

稱取5.00 g 剩余污泥提取蛋白粉于燒瓶中，加入10.00 mL 一定濃度的氫氧化鈉溶液，于不同溫度下水浴保溫處理一定時間，進行堿預處理；預處理完成后加入一定量的氯乙酸攪拌均勻，在60 ℃下改性2 h，每隔15 min 攪拌1 min(60 r/min).反應結束后，用體積比1∶1 的無水乙醇沉淀羧甲基化改性蛋白，并洗滌3 次，105 ℃干燥備用.

1.3 羧甲基化反應取代度和反應效率測定

取0.50 g 羧甲基化改性污泥蛋白于10.00 mL 蒸餾水中，加入2 滴酚酞指示劑，用1.00 mol/L 的氫氧化鈉溶液滴定至微紅色；加入甲基橙指示劑，用0.10 mol/L 的硫酸標準溶液滴定至由橙色變?yōu)榧t色為止，記錄消耗硫酸溶液的體積.按照式(1)、式(2)計算羧甲基化取代度(DS)[11-12].

式中：B 為每克羧甲基化改性蛋白所消耗的氫氧化鈉的物質的量，mmol/g；0.11 為蛋白中氨基酸單元的毫摩爾質量，g/mmol；0.08 為蛋白中的酰胺基中氫原子被取代后，一個氨基酸元的毫摩爾質量的凈增值，g/mmol；V2為滴定羧甲基化蛋白所需硫酸標準溶液的體積，mL；V1為滴定污泥提取蛋白所需硫酸標準溶液的體積，mL；c 為硫酸標準溶液濃度，mol/L；m為羧甲基化蛋白質量，g.

反應效率(RE)表示與蛋白發(fā)生反應的醚化試劑的量與實際加入量的百分數(shù)[10].

式中：DS 為取代度；n1為加入污泥提取蛋白的物質的量，mol；n2為加入醚化劑的物質的量，mol.

1.4 羧甲基化改性蛋白表征

1.4.1 紅外表征

制備的羧甲基化改性蛋白于105 ℃烘箱干燥，用傅里葉變換紅外光譜測試，表征其取代反應前后的基團變化.

1.4.2 改性蛋白電荷密度測定

稱取一定量的烘干的污泥蛋白和羧甲基化污泥蛋白，配制成質量分數(shù)為0.01%懸濁液，并用1 mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸溶液調節(jié)蛋白溶液pH 為10，用PCD-04 型顆粒電荷分析儀測定蛋白的電荷密度(CD).

式中：CD 為反應產物的電荷密度，mmol/mg；c′為陽離子聚電解質溶液的濃度，0.1 mmol/L；V′為消耗的標準陽離子聚電解質的體積，mL；m′為用于滴定溶液中樣品的質量，mg.

1.4.3 改性蛋白顆粒粒徑分布測定

稱取一定量的烘干的污泥蛋白和羧甲基化污泥蛋白配制成質量分數(shù)為1.00%的溶液，用LS-13320型激光粒徑儀測量改性蛋白顆粒粒徑分布.

1.5 改性蛋白對瓦楞原紙性能的影響

國產廢紙箱碎解后，制成打漿度為37°SR 的再生紙漿，分別添加絕干漿料質量的0.20%、0.40%、0.80%、1.20%的改性蛋白作為增強劑，抄成定量為120 g/m2的瓦楞原紙.瓦楞原紙經壓榨、干燥后分別按照GB/T 454—2002《紙耐破度的測定》、GB/T 455—2002《紙和紙板撕裂度的測定》、GB/T 2679.8—2016《紙和紙板環(huán)壓強度的測定》、GB/T 22364—2008《紙和紙板彎曲挺度的測定》、GB/T 12914—2008《紙和紙板抗張強度的測定》測定手抄片的耐破指數(shù)、撕裂指數(shù)、環(huán)壓指數(shù)、彎曲挺度和抗張指數(shù).

2 結果與討論

2.1 剩余污泥提取蛋白羧甲基化的工藝條件

堿預處理過程是決定羧甲基化反應成敗的關鍵，因此研究以取代度和反應效率為指標，對預處理堿濃度、堿預處理溫度、堿預處理時間及羧甲基化反應氯乙酸用量進行了優(yōu)化.

2.1.1 預處理堿濃度

取10.00 mL 不同濃度的氫氧化鈉溶液，添加5.00 g 剩余污泥提取蛋白，60 ℃下堿處理2 h 后，加入4.00 g 氯乙酸，60 ℃下攪拌反應2 h，研究堿預處理氫氧化鈉濃度對羧甲基化取代度及反應效率的影響，結果如圖2 所示.

圖2 氫氧化鈉濃度對羧甲基化取代度及反應效率的影響Fig.2 Effect of sodium hydroxide concentration on the substituting degree and reaction efficiency of carboxymethyl

由圖2 可知：隨著堿處理氫氧化鈉濃度的增大，羧甲基化取代度及反應效率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且羧甲基化取代度及反應效率變化趨勢基本一致.在氫氧化鈉濃度為2.00 mol/L 時，羧甲基化取代度及反應效率均達到最大值，分別為 0.20 和37.45%.污泥提取蛋白在氫氧化鈉的作用下，蛋白質分子在水溶液中發(fā)生潤脹，同時蛋白分子中帶有正負電荷的側鏈基團因靜電吸引形成的鹽鍵和蛋白分子中疏水基團或疏水側鏈因疏水作用形成的疏水鍵都被破壞，蛋白質多肽鏈自身的團聚狀態(tài)變得松散，在水溶液中得到伸展，無序度增大[13].促使蛋白分子上會暴露更多酰胺基，即會產生更多的活性部位，使氯乙酸中羧甲基化更容易取代酰胺基中氫原子，從而使剩余污泥蛋白更易發(fā)生羧甲基化.隨著氫氧化鈉濃度的增加，蛋白質多肽鏈中大量的肽鍵(酰胺基)斷裂，氯乙酸可取代的位點減少，導致羧甲基化取代度和反應效率有所降低.所以隨著氫氧化鈉濃度增大，剩余污泥蛋白羧甲基化取代度呈現(xiàn)出先增大后減小趨勢；而由羧甲基化反應效率的計算式(式(3))可以看出在剩余污泥蛋白和氯乙酸用量不變下，羧甲基化反應效率與取代度呈正相關，所以羧甲基化反應效率及取代度變化趨勢基本一致.因此，最佳堿處理氫氧化鈉濃度為2.00 mol/L.

2.1.2 堿預處理時間

取10.00 mL 的2.00 mol/L 氫氧化鈉溶液，添加5.00 g 剩余污泥提取蛋白，60 ℃堿處理一定時間，再加入4.00 g 氯乙酸60 ℃下攪拌反應2 h，研究堿預處理時間對污泥提取蛋白羧甲基化取代度及反應效率的影響，結果如圖3 所示.

圖3 堿預處理時間對羧甲基化取代度及反應效率的影響Fig.3 Effect of alkali treatment time on the substituting degree and reaction efficiency of carboxymethyl

由圖3 可知：隨著堿預處理時間的延長，羧甲基化取代度和反應效率均為先增大后減小趨勢.這是因為堿預處理時間過短，氫氧化鈉對蛋白分子中疏水鍵破壞程度不夠，蛋白質潤脹的不充分，蛋白分子自身團聚狀態(tài)沒有充分被打開，酰胺基暴露不完全[14]，反應位點少，不利于羧甲基化反應的發(fā)生，因此反應效率和取代度均較低；隨著堿預處理時間延長，分子鏈充分伸展，反應取代度逐漸增加.但堿預處理時間過長，蛋白質過度潤脹，蛋白分子鏈與水分子間結合力增大，蛋白質持水性快速增加[15]，大量的水分子會影響取代位點反應的進行快慢，故取代反應效率反而降低.已經暴露出來的酰胺基在氫氧化鈉作用下發(fā)生副反應，活性位點也會降低.堿預處理時間在2.0 h時，羧甲基化取代度及反應效率達到了最高，因此選擇2 h 為最佳處理時間.

2.1.3 堿預處理溫度

取10.00 mL 的2.00 mol/L 氫氧化鈉溶液，添加5.00 g 剩余污泥提取蛋白，在不同溫度下堿預處理2 h，再加入4.00 g 氯乙酸60 ℃下攪拌反應2 h，研究堿預處理溫度對污泥提取蛋白羧甲基化取代度及反應效率的影響，結果如圖4 所示.

圖4 堿預處理溫度對羧甲基化取代度及反應效率的影響Fig.4 Effect of alkali treatment temperature on the substituting degree and reaction efficiency of carboxymethyl

由圖4 可知：隨著堿預處理溫度的升高，蛋白羧甲基化反應取代度和反應效率呈先增大后減小的趨勢.合適的堿預處理溫度可促使蛋白質空間構象中的氫鍵以及二硫鍵斷裂[16]，破壞蛋白質多肽鏈纏繞構型，促進蛋白質在水溶液中的潤脹[17].堿預處理溫度過低，蛋白質自身的團聚狀態(tài)中多肽鏈沒有完全伸展開，不利于羧甲基化反應的發(fā)生和進行；若堿預處理溫度過高，會導致蛋白質多肽鏈發(fā)生降解，同時高溫會導致蛋白發(fā)生熱集聚[18]，導致伸展開的多肽鏈進一步團聚，影響羧甲基化反應的進行.在堿預處理溫度為60 ℃，蛋白羧甲基化反應取代度及反應效率達到了最高，因此60 ℃為最適宜堿預處理溫度.

2.1.4 氯乙酸用量

取10.00 mL 的2.00 mol/L 氫氧化鈉溶液，添加5.00 g 剩余污泥提取蛋白，60 ℃下堿預處理2 h 后，加入不同質量的氯乙酸，60 ℃下反應2 h，研究氯乙酸用量對污泥提取蛋白羧甲基化取代度及反應效率的影響，結果如圖5 所示.

圖5 氯乙酸用量對羧甲基化取代度及反應效率的影響Fig.5 Effect of chloroacetic acid dosage on substituting degree and reaction efficiency of carboxymethyl

由圖5 可知：提取蛋白羧甲基化取代度隨著氯乙酸與蛋白質量比的增加先增大隨后緩慢減小，在氯乙酸與蛋白質量比為0.8∶1 時，其取代度到達最大值；而羧甲基化反應氯乙酸的反應效率則呈逐漸遞減趨勢.堿處理后的蛋白暴露的酰胺基數(shù)目為定值，在氯乙酸用量較低時，隨著氯乙酸用量的增加，氯乙酸能與蛋白暴露的酰胺基充分發(fā)生反應，羧甲基化取代度增加；氯乙酸用量增加一定程度后，蛋白暴露的酰胺基位點接近反應飽和，取代位點無法增加，取代度也就無法增加，而同時氯乙酸用量增加，消耗反應體系中的堿，降低了反應環(huán)境pH，不利于活性位點的取代反應，因此繼續(xù)增加氯乙酸用量，取代度反而略有下降.故氯乙酸與蛋白質量比最佳值為0.8∶1.

綜上所述，剩余污泥蛋白在氫氧化鈉濃度為2.00 mol/L，60 ℃下堿化2 h，氯乙酸與蛋白質量比為0.8∶1 的條件下，羧甲基化反應測得的污泥提取蛋白取代度和反應效率最大值分別為0.20 和37.45%，選定此條件為最優(yōu)條件.

2.2 羧甲基化蛋白表征

2.2.1 羧甲基化改性蛋白紅外表征

將羧甲基化改性后的污泥提取蛋白經乙醇沉淀、純化、干燥處理后，進行紅外光譜表征，并與剩余污泥提取蛋白原粉進行比較，結果如圖6 所示.

圖6 污泥蛋白及羧甲基化污泥蛋白的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram of sludge protein and carboxymethyl sludge protein

由圖6 可知：經羧甲基化改性后的剩余污泥提取蛋白，蛋白分子鏈基團結構發(fā)生了明顯的改變，污泥蛋白FTIR 譜圖在1 592 cm-1處有一強峰，為—C=O的伸縮振動峰，改性后在1 572 cm-1處峰值變強，是由于羧甲基化基團中的—C=O 產生的不對稱伸縮振動吸收峰導致，1 326 cm-1處為—C=O 的對稱伸縮振動吸收峰，而1 127 cm-1處出現(xiàn)叔醇伸縮振動吸收峰，并且1 260 cm-1處有C—C(O)—O 伸縮振動吸收峰，說明剩余污泥蛋白發(fā)生了羧甲基化.王帥等[19]用氯乙酸接枝大豆蛋白時紅外光譜也出現(xiàn)類似的結果.可以證明：經過氯乙酸改性后羧甲基化成功取代到了污泥提取蛋白分子鏈中.

2.2.2 羧甲基化反應對蛋白電荷密度的影響

纖維本身因為羥基電離而帶負電，羧甲基化蛋白的電荷密度及所帶電性直接影響著其作為增強劑的使用效果.分別取烘干的污泥蛋白和羧甲基化污泥蛋白配制質量分數(shù)為0.01%的溶液，測定剩余污泥蛋白羧甲基化前后的電荷密度，結果見表1.

表1 羧甲基化前后污泥蛋白的電荷密度Tab.1 Charge density of sludge protein before and after carboxymethylation

由表1 可知：在蛋白溶液pH 為10 時，污泥蛋白電荷密度為-25.92 mmol/mg，而污泥蛋白羧甲基化后電荷密度下降到-12.40 mmol/mg，降低了109.02%.在堿性條件下氨基酸殘基中依然存在帶有正電荷的質子化的亞氨基，即亞氨基以離子——的形式存在[20]，溶液中OH-被吸附到蛋白顆粒附近，導致蛋白質溶液呈現(xiàn)電負性.而蛋白質被羧甲基化后，氨基酸殘基中酰胺基上亞氨基的氫原子被羧基(—COOH)取代，總體電荷密度應該呈增大趨勢，但蛋白質的電離與氨基酸不同，它有一定的空間結構，造成處于中間疏水的部分氨基酸是不電離的，且蛋白分子三級結構體積越大，中間疏水氨基酸不電離的數(shù)量越多[21].羧甲基化后蛋白質顆粒粒徑增大顯著，導致大量氨基酸處于疏水保護狀態(tài)無法電離，因此總體電荷密度下降顯著，這應該是羧甲基化后蛋白質電荷密度下降的主要原因.

2.2.3 羧甲基化改性對蛋白顆粒粒徑分布的影響

污泥蛋白在水中溶解度小[22]，蛋白液是以水為連續(xù)相，蛋白質為分散相分散在水中形成的懸濁液.蛋白的粒徑大小及粒徑的分布都會影響蛋白的溶解性、穩(wěn)定性[23]，從而影響羧甲基化蛋白改善細小纖維留著率.故分別取烘干的污泥蛋白和羧甲基化污泥蛋白配制質量分數(shù)為1.00%的蛋白液，測定蛋白顆粒粒徑分布變化情況，結果如圖7.由圖7 可知：污泥蛋白粒徑分布較為集中，羧甲基化蛋白粒徑分布分散；剩余污泥蛋白經過羧甲基化后，水溶液中蛋白顆粒的平均粒徑由6.274 μm 增大到9.566 μm，增加了52.47%.D97粒徑(體積分數(shù)累積到97%時顆粒粒徑)也由27.39 μm 增大到92.10 μm.出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是：羧甲基化蛋白中氨基酸殘基上的酰胺基氫原子被取代，影響蛋白質分子間氫鍵的形成，使蛋白更加容易發(fā)生溶脹[20]；另外，通過羧甲基取代，蛋白質原有疏水結構遭到破壞，水溶性增加，增加了顆粒間碰撞聚合的機會；還有，羧甲基化后的蛋白顆粒電荷密度的降低，也對蛋白分子濁液的穩(wěn)定性有很大影響，靜電斥力的減小導致蛋白顆粒更容易絮聚成團，從而導致蛋白顆粒平均粒徑的增大.顆粒粒徑的增大對于蛋白在應用過程中的留著有較大幫助.

圖7 羧甲基化前后污泥蛋白顆粒粒徑分布Fig.7 Particle size distribution of sludge protein before and after carboxymethylation

2.3 改性蛋白的應用效果

為驗證羧甲基化改性后污泥提取蛋白在廢紙生產瓦楞原紙中濕部增強的應用效果，考察改性污泥蛋白用量對各項強度指標的影響，結果如圖8 所示.由圖8 可知：隨著羧甲基化剩余污泥蛋白用量的增大，紙張的耐破指數(shù)、撕裂指數(shù)、環(huán)壓指數(shù)、彎曲挺度及抗張指數(shù)均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢.羧甲基化剩余污泥蛋白添加量為絕干漿料質量的0.40%時，紙張的耐破指數(shù)、環(huán)壓指數(shù)、彎曲挺度及抗張指數(shù)均達到 最 大 值，分 別 為 1.62 kPa·m2/g、9.52 N·m/g、798 mN·m、27.2 N·m/g.較 空 白 樣 分 別 提 高 了36.13%、26.93%、11.14%、20.89%；紙張的撕裂指數(shù)為1.56 mN·m2/g，較空白樣品提高了31.10%.羧甲基化污泥蛋白添加量為絕干漿料質量的0.8%，增加幅度小.蛋白上的羧基、羥基等基團能與纖維素分子形成氫鍵.污泥蛋白羧甲基化后，分子中羧基含量增加，蛋白密度下降，與負電性纖維靜電斥力減小，更易與纖維形成氫鍵，從而增加纖維留著和改善紙張性能.當羧甲基化污泥蛋白添加量為絕干漿料質量的0.40%時，手抄片物理性能最好.

尹覃偉[11]使用5.00%的經羥甲基化及環(huán)氧氯丙烷改性的谷朊蛋白用于紙張增強，紙張抗張和耐破指數(shù)分別提高了35.00%和8.89%，與改性谷朊蛋白相比，污泥改性蛋白在用量上優(yōu)勢明顯.王萌[24]將1%的陽離子化葡甘聚糖用于紙張增強，其耐破指數(shù)、抗張指數(shù)和耐折度分別提高了 13.20%、11.00%、72.00%.與陽離子化淀粉相比，改性污泥蛋白在耐破和抗張方面增強顯著，但陽離子淀粉在提高紙張耐折度方面效果顯著，提高72%.

圖8 改性蛋白添加量對瓦楞原紙性能的影響Fig.8 Effect of the amount of modified protein on the properties of fluting medium

3 結 論

(1)剩余污泥提取蛋白的羧甲基化改性的工藝條件為：在氫氧化鈉濃度為2.00 mol/L，60 ℃下堿化預處理2 h，氯乙酸與蛋白質量比為0.8∶1，60 ℃下進行反應.此時，污泥蛋白羧甲基化反應取代度和反應效率最高，分別為0.20 和37.45%.

(2)羧甲基化改性后，污泥提取蛋白顆粒粒徑較改性前有大幅增大，增加52.47%；蛋白顆粒粒徑有利于提高蛋白留著.蛋白顆粒電荷密度顯著降低，降低109.02%；兩性蛋白顆粒負電性降低更有利于與帶有負電纖維的靜電作用，從而提高蛋白留著和改善濕部的化學電荷特性.

(3)羧甲基化污泥蛋白作為濕部增強劑，在用量為絕干漿料質量的0.40%時，紙張的耐破指數(shù)、環(huán)壓指數(shù)、撕裂指數(shù)、彎曲挺度及抗張指數(shù)性能最佳，分別 為 1.62 kPa·m2/g、9.52 N·m/g、1.56 mN·m2/g、798 mN·m、27.2 N·m/g，相較空白樣分別提高了36.13%、26.93%、31.10%、11.14%、20.89%，增強效果明顯.