富油微藻的選育及規(guī)?；囵B(yǎng)研究進(jìn)展

黎秋玲，李 志，張慶華，劉孟熒，周智友，李漢廣

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室， 江西省菌物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

傳統(tǒng)生物柴油生產(chǎn)原料主要是各種天然動(dòng)植物油脂、餐飲及食品工業(yè)的廢棄油脂等。與這些生物質(zhì)相比，微藻具有許多明顯的優(yōu)勢(shì)[1-4]。微藻無(wú)需高質(zhì)量的農(nóng)業(yè)耕地，可利用污水、灘涂地、荒廢地等非耕地進(jìn)行生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度快，脂肪含量高，部分微藻積累了大量可作為生物柴油主要原料的中性脂肪三酰甘油(TAG)，其單位面積油產(chǎn)量是油料植物的數(shù)十倍。但微藻在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化培養(yǎng)中存在一定的差異，藻種的生命力(培養(yǎng)密度、育種、穩(wěn)定性及特定環(huán)境中對(duì)掠食者的敏感性)隨著環(huán)境的變化而變化，一方面規(guī)?；囵B(yǎng)的微藻藻種僅有螺旋藻(Spirulinasp.)、小球藻(Chlorella)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)和雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)等[5]，且這些藻種中能用于能源開(kāi)發(fā)的微藻藻種更是少之又少；另一方面在已用于大規(guī)模培養(yǎng)的微藻中，油脂占藻體干重的比例仍然處于較低水平。雖然利用微藻生產(chǎn)生物柴油的技術(shù)難題已經(jīng)被成功攻克，但就經(jīng)濟(jì)方面而言，從微藻原料中獲得的生物柴油仍不能與傳統(tǒng)化石燃料相抗衡[6]。在現(xiàn)階段，微藻生物柴油與石化行業(yè)相比，并無(wú)明顯經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。因此，要加快發(fā)展微藻生物能源技術(shù)，提高微藻的油脂含量、選擇合適的規(guī)?；囵B(yǎng)方式是目前微藻生物質(zhì)能源必須解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本文系統(tǒng)介紹了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外微藻生物柴油的發(fā)展?fàn)顩r，對(duì)優(yōu)良藻種的選育及常見(jiàn)的規(guī)模化培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行闡述，并展望了微藻生物柴油未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)和潛在發(fā)展前景。

1 微藻生物柴油國(guó)內(nèi)外發(fā)展?fàn)顩r

目前，全球正面臨能源緊張的問(wèn)題，解決能源危機(jī)能夠直接影響全球經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。1978年起，美國(guó)能源部(DOE)實(shí)施了微藻等水生生物作為能源原料的計(jì)劃[7]。20世紀(jì)90年代至21世紀(jì)初，日本國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)部著手研究的微藻固定CO2能力和封閉式光生物反應(yīng)器技術(shù)，是微藻固碳研究的開(kāi)端[8]。2017年，日本研究集團(tuán)Euglena和千代田公司簽署了日本第一個(gè)以微藻為原料生產(chǎn)可再生噴氣燃料和柴油燃料試驗(yàn)工廠的工程采購(gòu)和建設(shè)合同，生產(chǎn)所得能源將在2019年用于航空和公共道路運(yùn)輸[9]。

微藻生物柴油的研究在我國(guó)發(fā)展較遲，從無(wú)到有，再到現(xiàn)在的小有所成，其中雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)的規(guī)?；a(chǎn)突破了產(chǎn)業(yè)化中一系列限制性屏障。在產(chǎn)油微藻的研究方面，國(guó)內(nèi)已有水生生物所、武漢植物園等單位開(kāi)展了藻種的篩選、規(guī)?；囵B(yǎng)等研究，并與大型石油化工企業(yè)進(jìn)行合作，力求打開(kāi)適合我國(guó)國(guó)情的微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化大門(mén)[10]。

2 優(yōu)勢(shì)藻種的篩選與獲得

微藻的生物量和油脂含量是衡量能源微藻應(yīng)用價(jià)值的兩個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。因此，篩選出優(yōu)勢(shì)藻種是實(shí)現(xiàn)微藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)生物柴油的關(guān)鍵因素之一。同時(shí)，也是從事微藻生物質(zhì)能源基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容。

2.1 物理、化學(xué)誘變方法及基因工程篩選

油脂含量較高的微藻藻種主要分布在綠藻門(mén)(Chlorophyta)、硅藻門(mén)(Bacillariophyta)和金藻門(mén)(Chrysophyta)[11]。在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，微藻需要能夠耐受溫度、光照、鹽度和病原體負(fù)荷等變化，才能使藻種在不同區(qū)域和季節(jié)被廣泛培育。然而，在大規(guī)模農(nóng)業(yè)或工業(yè)生產(chǎn)中使用的植物都不是野生型，野生型藻種不太可能具有農(nóng)業(yè)或工業(yè)生產(chǎn)所需的所有特征[12]。為提高藻種的產(chǎn)油性能，對(duì)藻種進(jìn)行物理、化學(xué)誘變以及基因改造是較為常用的手段。

大多數(shù)研究表明紫外線(UV)誘變[13]和化學(xué)誘變可以改善微藻的生物量或脂質(zhì)含量。Liu等[14]對(duì)小球藻(Chlorella)進(jìn)行UV誘變，與對(duì)照藻株相比，突變?cè)逯甑纳锪刻岣吡?.6%，脂質(zhì)含量顯示出不同程度的增加，最大值達(dá)到28.1%。Tanadul等[15]利用甲基磺酸乙酯(EMS)對(duì)小球藻(Chlorella)進(jìn)行化學(xué)誘變，獲得的誘變?cè)逯曛|(zhì)含量和脂質(zhì)產(chǎn)率與野生型相比分別提高了59%和53%。Rismani-Yazdi等[16]重建特氏杜氏藻(D.tertiolecta)中生物燃料前體中與生產(chǎn)有關(guān)的代謝途徑，在高鹽濃度培養(yǎng)下，升高的鹽濃度導(dǎo)致細(xì)胞總脂質(zhì)含量增加22%。收獲時(shí)微藻脂質(zhì)含量接近于原始藻株的兩倍，超過(guò)細(xì)胞干重的35%。Baek等[17]通過(guò)對(duì)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)基因編輯，將藻種一步轉(zhuǎn)化，改善了藻種的光合生產(chǎn)力。Zhu等[18]利用Hsp70A-RbcS2融合啟動(dòng)子，在葉酸中與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合，使微藻的總脂肪酸含量比野生型增加22%，TAG含量增加32%。Ma等[19]通過(guò)在mRNA 水平上控制微擬球藻(Nannochloropsissalina)PDK基因(NsPDK)的表達(dá)使其體內(nèi)的酶活性減弱，加快TAG的積累。

2.2 新型微藻篩選方法

為配合藻種的選育，提高篩選的效率和速度，選擇新型微藻篩選方法，可快速篩選出目的藻種。Sung等[20]開(kāi)發(fā)了一種微流體方法，通過(guò)簡(jiǎn)單操縱微流體裝置中的磁場(chǎng)(91.90%的空白、87.12%的低密度和90.66%的高密度液滴可以分離成不同的出口)，用基于細(xì)胞密度的磁力微滴分離具有高生長(zhǎng)性能的藻種。Kim等[21]通過(guò)使用微流體系統(tǒng)在單細(xì)胞水平上對(duì)趨光反應(yīng)進(jìn)行定量分析，由此將選擇效率顯著提高了8倍以上，并分別提高1.9倍的光自養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)速率和8.1倍的脂質(zhì)生產(chǎn)力。Hugo等[6]利用熒光激活細(xì)胞分選分離出一株有較大孔徑、富含脂質(zhì)的綠藻(Tetraselmissp. CTP4)。采用兩階段培養(yǎng)方式，其脂質(zhì)含量占細(xì)胞干重的33%，脂質(zhì)生產(chǎn)力達(dá)52.1 mg/(L·d)，并且CTP4的生物質(zhì)能迅速脫水，可降低生物柴油精煉的下游加工成本，是一種非常有前景的優(yōu)勢(shì)藻種。

3 富油微藻的規(guī)?；囵B(yǎng)

產(chǎn)油微藻工業(yè)化培養(yǎng)中，除了藻種本身油脂含量的重要性之外，能否進(jìn)行高密度培養(yǎng)也具有重要意義。微藻根據(jù)自身不同屬性及對(duì)光源和營(yíng)養(yǎng)成分的需求，可分為光自養(yǎng)、異養(yǎng)、混養(yǎng)三種培養(yǎng)方式[22](見(jiàn)表1)。因此，可結(jié)合藻類生活習(xí)性和不同培養(yǎng)方式的特點(diǎn)，對(duì)光生物反應(yīng)器進(jìn)行改良和創(chuàng)新，研發(fā)出適合微藻規(guī)?；囵B(yǎng)的新模式。

表1 不同培養(yǎng)方式的特點(diǎn)[22]

3.1 光自養(yǎng)方式

大多數(shù)微藻為光合自養(yǎng)型微生物[23]，其能夠利用光作為能量來(lái)源把化學(xué)能轉(zhuǎn)化為生物能。實(shí)驗(yàn)室條件下，利用人工光源的小規(guī)模培養(yǎng)難以滿足微藻的產(chǎn)量需求，若想實(shí)現(xiàn)微藻的規(guī)模化培養(yǎng)，室外培養(yǎng)必不可少[24]。室外培養(yǎng)可分為開(kāi)放式、封閉式和混合型光生物反應(yīng)器。

3.1.1 開(kāi)放式光生物反應(yīng)器

開(kāi)放式光生物反應(yīng)器可以分為自然池塘、人工池、帶攪拌裝置的循環(huán)池以及人工制作的開(kāi)放式光生物反應(yīng)器。De Bhowmick等[25]在400 L的跑道池中養(yǎng)殖小球藻(Chlorellavariabilis)，測(cè)得微藻平均生長(zhǎng)率為0.36 d-1，油脂含量(占藻體干重)10%。雖然油脂含量較實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)偏低，但開(kāi)放式跑道池構(gòu)建單一、成本較低、便于操作，使其規(guī)模化培養(yǎng)的成本降低。為減少開(kāi)放式光生物反應(yīng)器易受環(huán)境等因素的干擾，可在開(kāi)放式跑道池上方覆蓋一些透光的物質(zhì)，以解決夜間熱損失、水汽蒸發(fā)、灰塵和昆蟲(chóng)等污染問(wèn)題，使之成為封閉池[26]。

開(kāi)放式跑道池對(duì)土地的利用率不高，為了提高土地的利用率，Hu等[27]利用開(kāi)放式多層光生物反應(yīng)器對(duì)微藻進(jìn)行培養(yǎng)。藻液通過(guò)重力作用在每層反應(yīng)器間流動(dòng)，降低藻液流動(dòng)能耗，同時(shí)利用空間延伸減少反應(yīng)器的占地面積，實(shí)現(xiàn)了延長(zhǎng)藻液流程及加快液體流速，能夠有效獲得微藻生物質(zhì)，且所培養(yǎng)微藻的脂質(zhì)含量達(dá)到(占干重)78%。為了克服層式光合反應(yīng)器上層對(duì)下層的光源阻礙，唐偉偉等[28]設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了新型多層薄層貼壁光生物反應(yīng)器裝置，提高螺旋藻(Spirulinasp.)生物量，使其生物量產(chǎn)率最高達(dá)到45～60 g/(m2·d)，平均生物量產(chǎn)率達(dá)到30.3 g/(m2·d)。

3.1.2 封閉式光生物反應(yīng)器

封閉式光生物反應(yīng)器是針對(duì)開(kāi)放式跑道池生物量產(chǎn)率低、易受外界污染和難控制培養(yǎng)條件等問(wèn)題開(kāi)發(fā)出的反應(yīng)器結(jié)構(gòu)，采取的方法主要是縮短光程(如薄腔室、細(xì)管)以及強(qiáng)化明暗交替[29]。封閉式光生物反應(yīng)器與開(kāi)放式光生物反應(yīng)器比較具有以下優(yōu)點(diǎn)：①不易受到污染，利于純種的保護(hù)；②防止水分蒸發(fā)及培養(yǎng)液鹽漬化；③冷卻速度快，呼吸作用的損傷降低；④實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)；⑤濃度高，降低采收的成本；⑥溫度等外界環(huán)境便于控制。

Pereira等[30]把綠藻(Tetraselmissp. CTP4)的培養(yǎng)擴(kuò)大到100 m3的工業(yè)規(guī)模的管狀光生物反應(yīng)器(PBR)中，CO2平均減緩效率為65%，生物質(zhì)與碳的比率為1.80，使CTP4具有良好的生物量生產(chǎn)力和光合能力。

在商業(yè)規(guī)模上，微藻的培育主要集中在封閉的管狀光生物反應(yīng)器上，但這些光生物反應(yīng)器對(duì)土地有巨大的需求，并且構(gòu)建和操作昂貴。然而，垂直柱式反應(yīng)器如氣升式光生物反應(yīng)器，構(gòu)造便宜、操作簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)緊湊，是微藻培養(yǎng)更加現(xiàn)實(shí)的選擇。Sarat Chandra等[31]在3.4 L氣升式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)淡水綠藻(Scenedesmusobtusus)，生物質(zhì)生產(chǎn)率最大達(dá)到0.07 g/(L·d)，在較高光照強(qiáng)度下或連續(xù)光補(bǔ)充培養(yǎng)的S.obtusus能產(chǎn)生理想的生物柴油來(lái)源。

3.1.3 混合型光生物反應(yīng)器

結(jié)合不同反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)，可設(shè)計(jì)出混合型光生物反應(yīng)器耦合系統(tǒng)，使其滿足規(guī)模化培養(yǎng)微藻的需求。應(yīng)降果[32]設(shè)計(jì)的列管柱式光生物反應(yīng)器與跑道池耦合系統(tǒng)，受光性能良好并能快速釋放封閉式反應(yīng)器中積累的熱量至跑道池，同時(shí)加強(qiáng)了跑道池中的CO2吸收效率。利用該耦合系統(tǒng)培養(yǎng)微藻，可使微藻生物量、面積得率及體積產(chǎn)率比對(duì)照跑道池提高49%。Lee等[33]構(gòu)建了α型管狀混合型光生物反應(yīng)器，可使光合有效輻射度和培養(yǎng)溫度更加均勻，其微藻生物量密度超過(guò)10 g/L，日產(chǎn)量達(dá)72 g/(m2·d)。Huang等[34]在反應(yīng)器內(nèi)部使用特殊混合器促進(jìn)沿著光照梯度的混合，促進(jìn)藻液的混合。使藻液與營(yíng)養(yǎng)因子等外界因素均勻接觸。Ogbonna等[35]設(shè)計(jì)了一種新型內(nèi)照明攪拌式光生物反應(yīng)器，研究蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的規(guī)模培養(yǎng)，在反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)12 d后小球藻能獲得藻質(zhì)量濃度1.37 g/L，生長(zhǎng)速率為0.164 kg/(m3·d)。Sung等[36]設(shè)計(jì)了一種新型的培養(yǎng)系統(tǒng)，把4個(gè)平板光生物反應(yīng)器串聯(lián)連接，通過(guò)一定的稀釋速率向第一反應(yīng)器中加入新鮮培養(yǎng)基，使該系統(tǒng)經(jīng)受連續(xù)的恒化器培養(yǎng)，以提高海洋富油微擬球藻(Nannochloropsisgaditana)的脂質(zhì)生產(chǎn)力，其生物質(zhì)產(chǎn)率可達(dá)20.0%以上，脂肪酸甲酯生產(chǎn)率達(dá)46.1%以上。

3.2 異養(yǎng)方式

微藻異養(yǎng)培養(yǎng)是指利用有機(jī)碳源維持藻類油脂積累及正常生長(zhǎng)。微藻的異養(yǎng)分為3類：化能異養(yǎng)生長(zhǎng)、光異養(yǎng)生長(zhǎng)和光激活異養(yǎng)生長(zhǎng)方式[37-38](見(jiàn)表2)。

表2 不同異養(yǎng)方式的特點(diǎn)[37-38]

3.2.1 化能異養(yǎng)

利用化能異養(yǎng)方式來(lái)實(shí)現(xiàn)規(guī)模化培養(yǎng)微藻主要有3種方式：分批、補(bǔ)料和連續(xù)培養(yǎng)。其中分批培養(yǎng)方式易于實(shí)施，但是隨著培養(yǎng)液中能量的消耗，藻類的生長(zhǎng)受到抑制或者停止，因而難以達(dá)到高的密度。因此，目前較為常見(jiàn)的培養(yǎng)模式為補(bǔ)料培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。

Morales-Sánchez等[39]使用葡萄糖作為補(bǔ)充碳源，對(duì)富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)期間保持C/N比為17∶1，脂質(zhì)含量(占藻體干重)最高可達(dá)52%，脂質(zhì)生產(chǎn)力達(dá)528.5 mg/(L·d)。謝明[40]利用異養(yǎng)—稀釋—光誘導(dǎo)串聯(lián)培養(yǎng)技術(shù)在500 L發(fā)酵罐中對(duì)蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)進(jìn)行中試擴(kuò)大培養(yǎng)，周期內(nèi)藻細(xì)胞平均生長(zhǎng)速率可達(dá)2.5 g/(L·h)，平均葡萄糖得率可達(dá)0.48 g/g，比生長(zhǎng)速率可維持在0.025～0.03 h-1之間，可達(dá)到實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)水平。

3.2.2 光異養(yǎng)

光異養(yǎng)是指在光照條件下，向含碳源的培養(yǎng)液中加入DCMU培養(yǎng)微藻的方法。DCMU是光合作用抑制劑，可抑制非環(huán)式光合磷酸化，使其不再產(chǎn)生NADPH，從而導(dǎo)致微藻PS Ⅱ的活性受到抑制，影響微藻的正常代謝。牛海亞等[41]以DNP為解偶聯(lián)劑，分別添加5×10-7、5×10-5mmol/L DNP，對(duì)小球藻(Chlorellasp. 484)進(jìn)行光異養(yǎng)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，兩種模式下FACHB 484生長(zhǎng)狀況未產(chǎn)生顯著不同。Yang等[42]在2 L光生物反應(yīng)器中光異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻(ChlorellaminutissimaUTEX2341)，雖然研究中的脂質(zhì)產(chǎn)量相對(duì)較低，生物量為13.1%，但生物質(zhì)總產(chǎn)量(干重)較高，總脂質(zhì)含量可達(dá)0.95 g/L。

3.2.3 光激活異養(yǎng)

在沒(méi)有光合作用能量的情況下，專性光合自養(yǎng)生物不能生長(zhǎng)和分裂，這是微藻代謝物的有效異養(yǎng)生成的主要障礙[43]。Anderson等[44]在對(duì)集胞藻(SynechocystisPCC 6803)進(jìn)行5～10 min、40 μmol/(m2·s·d) 的光照培養(yǎng)，在完全黑暗中保持光激活異養(yǎng)生長(zhǎng)，雖未對(duì)富油情況闡明，但此方式賦予富油微藻規(guī)模化培育新的可能。

3.3 混合培養(yǎng)

為結(jié)合自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)雙方的優(yōu)勢(shì)，可采取混合培養(yǎng)，以光能和CO2等無(wú)機(jī)碳源為主，同時(shí)以有機(jī)碳源作為補(bǔ)充碳源。該培養(yǎng)方式中和了自養(yǎng)和異養(yǎng)兩種方式的優(yōu)缺點(diǎn)，是一種比較高效的培養(yǎng)方式。Roostaei等[45]對(duì)小球藻(Chlorellavulgaris)和二形柵藻(Scenedesmusdimorphus)進(jìn)行混合培養(yǎng)，最大限度地利用資源，消除光限制。與自養(yǎng)條件相比，混合培養(yǎng)的微藻生物量高出2～3倍，脂質(zhì)積累高出2～10倍，從而實(shí)現(xiàn)了更大的生物量和脂質(zhì)含量。

4 結(jié)束語(yǔ)

目前，微藻生物質(zhì)能源仍處于探索階段，其中產(chǎn)油藻種的選育及其規(guī)模化培養(yǎng)是微藻生物能源的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。這需要系統(tǒng)地研究不同誘變方式、培養(yǎng)方式以及光生物反應(yīng)器等對(duì)微藻培育的影響。在產(chǎn)油藻種的選育及其規(guī)模化培養(yǎng)中，以下幾個(gè)方面有待進(jìn)一步研究：建立富油藻種的選育規(guī)程，通過(guò)物理、化學(xué)誘變及基因工程等手段，配合不同微藻篩選方法，提高篩選的效率和速度，以獲得理想優(yōu)勢(shì)的藻種；研究微藻的規(guī)模化培養(yǎng)系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)自養(yǎng)、異養(yǎng)及混養(yǎng)方式特點(diǎn)的了解，以及根據(jù)微藻本身性能的差異，采用高密度微藻的光生物反應(yīng)器，從而開(kāi)發(fā)出高效、低成本、易實(shí)施的微藻培養(yǎng)方式。

盡管來(lái)自藻類的生物能源生產(chǎn)仍然過(guò)于昂貴，且無(wú)法與化石能源競(jìng)爭(zhēng)，但其仍是一種具有前瞻性和可持續(xù)性的生物質(zhì)能源來(lái)源。若能把微藻規(guī)?；嘤c環(huán)境保護(hù)、污水防治相結(jié)合，將會(huì)進(jìn)一步降低其培養(yǎng)成本，必將有利于微藻生物能源的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。