花椒籽殼蛋白與籽仁蛋白理化性質(zhì)分析

文秋萍，李 超，徐丹萍，蔡沁玥，蒲 彪

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安625014)

花椒籽是花椒果皮生產(chǎn)中最多的副產(chǎn)物，占花椒總產(chǎn)量的60%～70%，且脂肪含量豐富，被認(rèn)為是良好的油料資源之一[1-2]。花椒籽仁中含有豐富的可食性油脂、蛋白質(zhì)等，花椒籽殼中含有豐富的黑色素、生物堿、纖維素等?；ń纷颜Ｖ朴蜁r(shí)，花椒籽殼中含有的生物堿和蠟質(zhì)成分會(huì)影響花椒籽油的品質(zhì)，因此整粒利用會(huì)產(chǎn)生一些不良影響，分開利用可以更加充分地節(jié)約資源。

脫脂后的花椒籽仁粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)68.84%[3]，超過脫脂后的花生[4]、大豆[5]、油菜籽[6]等，且氨基酸種類豐富[3]?？苊麾昜3]對(duì)花椒整粒進(jìn)行了研究，以堿溶酸沉法提取花椒籽蛋白，并以該蛋白為對(duì)象進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明花椒籽中含量最多的成分是纖維素，花椒籽蛋白屬于無毒物質(zhì)。楊令葉等[7]對(duì)花椒籽仁分離蛋白進(jìn)行了分類研究，結(jié)果表明花椒籽仁中蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較小，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。近年來，對(duì)花椒籽蛋白的研究越來越注重理化性質(zhì)和功能性質(zhì)的探索，對(duì)帶殼與不帶殼提取的花椒籽蛋白差異對(duì)比研究較少，對(duì)其理化性質(zhì)及功能性質(zhì)上的類同和差異尚未有更深入的研究，因此本試驗(yàn)通過對(duì)脫脂花椒籽仁與籽殼的基本成分、粗蛋白等電點(diǎn)、氨基酸組成、亞基組成和蛋白組分進(jìn)行了對(duì)比分析，以期為充分利用花椒籽蛋白這一植物蛋白資源打下基礎(chǔ)，從而為進(jìn)一步解決我國花椒籽資源利用率低的問題提供參考，以期擴(kuò)大花椒籽蛋白產(chǎn)品在食品加工及其他領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青花椒籽，四川洪雅縣幺麻子食品有限公司。SDS、NaCl、NaOH、HCl、無水乙醇、石油醚等，均為分析純；考馬斯亮藍(lán)試劑盒；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、蛋白質(zhì)Marker，上海源葉生物科技有限公司；考馬斯R-250，美國Sigma公司。

FW-400A萬能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；KDN-C型凱氏定氮儀，上海新嘉電子有限公司；電子恒溫水浴鍋，上海漢諾儀器有限公司；CP225D型電子天平，德國Sartorius公司；PHSJ-4A型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，邦西儀器科技有限公司；LGJ-18S冷凍干燥機(jī)，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；UV-3分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；MICROMAX型高速離心機(jī)，美國Thermo公司；S433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國Sykam公司；1658000小型垂直電泳儀，Geldoc XR System型凝膠成像系統(tǒng)，美國 Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

花椒籽經(jīng)清洗除雜后，于50℃烘箱烘干，輕微破碎后，分別挑選花椒籽殼和籽仁，粉碎至20目，分別以石油醚為提取劑采用索氏提取進(jìn)行脫脂處理8 h 后，烘干粉碎至80目備用。

1.2.2 Osborne分級(jí)提取花椒籽仁和籽殼蛋白

參考楊令葉等[7]的方法，并做適當(dāng)修改。分別稱取2 g花椒籽仁和籽殼脫脂粉于刻度離心管中，以料液比1∶15加入蒸餾水，攪拌2 h，然后以4 000 r/min在4℃離心30 min，收集上清液，即為清蛋白。球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的提取操作同上，但所用溶劑不同，分別為質(zhì)量濃度2 g/100 mL NaCl溶液、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液、質(zhì)量濃度0.01 g/100 mL NaOH溶液。每步提取重復(fù)2次，收集不同組分的上清液，凍干，置于冰箱4℃冷藏備用。

1.2.3 花椒籽仁與籽殼基本理化性質(zhì)測定

水分測定，參照GB 5009.3—2016；灰分測定，參照GB 5009.4—2016；原料蛋白質(zhì)測定，參照GB 5009.5—2016；脂肪測定，參照GB 5009.6—2016；各組分蛋白質(zhì)的測定，考馬斯亮藍(lán)比色法[8]；碳水化合物測定，參照Zhu等[9]的方法；氨基酸組成測定，參照GB 5009.124—2016，采用氨基酸自動(dòng)分析儀測定。

等電點(diǎn)的測定：分別稱取花椒籽殼與花椒籽仁脫脂粉各0.5 g，置于12個(gè)燒杯中，加入50 mL 0.1 mol/L的乙酸溶液溶解，用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH為1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0，于35℃振蕩浸提1 h，然后于8 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液1 mL，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后于595 nm測定溶液吸光值。

亞基相對(duì)分子質(zhì)量測定：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度1 g/100 mL的樣品與上樣緩沖液1∶1混合后煮沸3 min，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析(濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%，電壓分別為60 V和100 V)，電泳結(jié)束后經(jīng)染色、脫色后，凝膠成像處理。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 軟件進(jìn)行分析，亞基相對(duì)分子質(zhì)量采用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒籽仁與花椒籽殼脫脂粉的基本成分(見表1)

表1 花椒籽殼與花椒籽仁脫脂粉的基本成分 %

從表1可知，花椒籽仁與籽殼脫脂后，籽仁水分含量7.28%，籽殼水分含量9.61%。籽殼中水分含量高于籽仁，可能是因?yàn)樽褮ず写罅康奶妓衔铮菀孜账??；ń纷讶拭撝蟮鞍踪|(zhì)含量達(dá)到61.17%，而花椒籽殼中僅為8.54%，差異很大，與楊令葉等[7]所測脫脂花椒籽仁蛋白質(zhì)含量60.34%和李超等[10]測得的脫脂青花椒籽仁粗蛋白質(zhì)含量60.91%基本持平，低于寇明鈺[3]測得的脫脂花椒籽仁蛋白質(zhì)含量68.84%，可能是花椒籽的種類以及產(chǎn)地的差異造成的?；ń纷褮っ撝蠡曳趾?.67%，高于籽仁，無機(jī)營養(yǎng)素和礦質(zhì)元素豐富?；ń纷褮っ撝筇妓衔锖?1.62%，遠(yuǎn)高于籽仁的23.49%，其含有的纖維素、亞纖維素、木質(zhì)素等不僅增加花椒籽的韌性和抗裂性，還能通過接枝共聚制成絮凝劑應(yīng)用于廢水處理中[11]或者應(yīng)用于造紙行業(yè)[12]，不僅可以更加充分地利用花椒籽資源，還能有利于環(huán)境污染的治理。

2.2 花椒籽仁與花椒籽殼蛋白等電點(diǎn)(見圖1)

由圖1可知，花椒籽仁蛋白在pH為3.5時(shí)吸光值最小，可推斷出花椒籽仁蛋白的等電點(diǎn)為3.5。花椒籽仁蛋白在pH 1.0后吸光值隨pH增大而下降，主要是由于強(qiáng)酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度增大，在pH 3.5時(shí)吸光值降至最低，隨pH繼續(xù)增大，吸光值開始回升，可能是因?yàn)閜H改變，引起蛋白質(zhì)表面所帶電荷改變，影響相互之間靜電斥力，從而使蛋白溶解度變化，籽仁蛋白吸光值在pH中性及弱堿性環(huán)境整體上保持較穩(wěn)定的增長?；ń纷褮さ鞍自趐H 4.5 時(shí)吸光值最小，由此可以推斷花椒籽殼蛋白的等電點(diǎn)為4.5。籽殼蛋白在pH小于 2.0和pH大于8.0都有較高的溶解度，可能是由于花椒籽殼蛋白在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件下發(fā)生解離使溶解度增大?；ń纷讶屎妥褮さ鞍椎牡入婞c(diǎn)不同說明兩者的蛋白質(zhì)性質(zhì)具有一定的差異，有可能是兩者蛋白質(zhì)組成和氨基酸組成的差異造成的。

圖1 花椒籽仁與花椒籽殼蛋白等電點(diǎn)

2.3 花椒籽仁與花椒籽殼脫脂粉氨基酸組成(見表2)

表2 花椒籽仁與花椒籽殼脫脂粉氨基酸組成及含量

續(xù)表2

氨基酸花椒籽仁脫脂粉含量/(g/100 g)比例/%花椒籽殼脫脂粉含量/(g/100 g)比例/%含量/(g/100 g)FAO/WHO成年人推薦量/(g/100 g)亮氨酸(Leu)?3.127.260.256.141.90酪氨酸(Tyr)1.693.930.071.72苯丙氨酸(Phe)?1.573.650.122.951.90賴氨酸(Lys)?1.533.560.276.631.60組氨酸(His)0.992.300.153.69精氨酸(Arg)5.3212.370.4811.79脯氨酸(Pro)1.603.720.133.19必需氨基酸11.7427.311.0926.78總量43.00100.004.07100.00

注：*為必需氨基酸。

由表2可知，花椒籽殼與籽仁皆富含17種氨基酸，含量較多的為谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道一致。籽仁谷氨酸含量高達(dá)24.42%，籽殼中為19.66%。谷氨酸是生物體內(nèi)一種重要的有機(jī)小分子物質(zhì)，能促進(jìn)腦細(xì)胞呼吸，此外，谷氨酸還能提高食品的可塑性和彈性，增強(qiáng)食品的加工品質(zhì)。精氨酸可以增加人體免疫功能[15-16]?；ń纷讶拭撝壑邪被岬目偭繛?3 g/100 g，花椒籽殼僅為4.07 g/100 g，相差較大。此外，花椒籽仁脫脂粉必需氨基酸總量為11.74 g/100 g，占花椒籽仁脫脂粉氨基酸總量的27.31%，與大豆(13.93 g/100 g)和花生(14.16 g/100 g)相近，遠(yuǎn)低于玉米(23.98 g/100 g)[17]，與FAO/WHO的成年人推薦標(biāo)準(zhǔn)相比，除蛋氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸之外，其他均偏高，因此花椒籽仁是與大豆和花生類似的優(yōu)質(zhì)植物蛋白原料。

2.4 花椒籽仁與花椒籽殼蛋白亞基組成

以花椒籽仁和籽殼脫脂粉為原料，采用SDS-PAGE電泳分析花椒籽仁、籽殼粗蛋白的亞基相對(duì)分子質(zhì)量，得到的電泳圖譜如圖2所示。

注：1.Marker；2.花椒籽仁粗蛋白；3.花椒籽殼粗蛋白。

圖2 花椒籽仁、籽殼粗蛋白的SDS- PAGE 電泳圖譜

由圖2可見，花椒籽仁粗蛋白共有7個(gè)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量在0～66.200 kDa之間，分別為10.379、19.311、24.231、26.366、33.634、55.127、65.525 kDa，亞基相對(duì)分子質(zhì)量分布廣泛，且基本上為相對(duì)分子質(zhì)量小的亞基。相比于花椒籽仁，花椒籽殼粗蛋白只有2個(gè)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量在18.400～35.000 kDa之間，分別為20.222、35.000 kDa，這有可能是因?yàn)榛ń纷褮ぶ泻械牡鞍踪|(zhì)亞基種類較少。

2.5 花椒籽仁與花椒籽殼粗蛋白Osborne分級(jí)提取結(jié)果

清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白在花椒籽仁、籽殼蛋白中具體分布情況以及與幾種常見谷物蛋白分布比較見表3。

表3 花椒籽仁、籽殼與幾種常見谷物蛋白分布比較 %

注：花椒籽殼、籽仁各蛋白組分含量=各蛋白組分提取液中蛋白質(zhì)總量/原料中蛋白質(zhì)總量×100%；幾種谷物蛋白組成數(shù)據(jù)見參考文獻(xiàn)[18]。

由表3可見，花椒籽仁中清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白的含量分別為7.76%、72.06%、15.80%、1.22%，花椒籽殼中清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白的含量分別為13.12%、56.54%、21.45%、3.25%?；ń纷讶逝c籽殼蛋白各蛋白組分之間的含量比例大致相似。鹽溶性的球蛋白是構(gòu)成花椒籽仁蛋白的主要部分，含量超過了70%，因此鹽提法能較好地提取花椒籽仁蛋白?；ń纷讶逝c籽殼含有較高含量的球蛋白，谷蛋白和清蛋白含量次之，醇溶蛋白含量最低。球蛋白具有一定的乳化能力，而谷蛋白和清蛋白溶解性好，易于消化吸收，有利于提高食品的加工品質(zhì)?；ń纷讶逝c籽殼蛋白的組成與楊令葉等[7]的大紅袍花椒籽種仁蛋白的分類研究中的蛋白組成一致，但其中球蛋白的含量遠(yuǎn)高于大紅袍花椒籽仁的球蛋白含量，但其他3種蛋白質(zhì)含量相比較低，可能是因?yàn)檠芯繉?duì)象原料品種以及成熟度的不同所致。另外，由表3可知，花椒籽仁球蛋白含量遠(yuǎn)高于其他幾種谷物蛋白，花椒籽殼球蛋白含量與燕麥中的相持平，遠(yuǎn)高于大米、玉米、大麥和小麥，花椒籽殼中的清蛋白含量也顯著高于其他幾種谷物蛋白，籽仁中的清蛋白含量也高于大米和小麥，與玉米相接近，而谷蛋白和醇溶蛋白都普遍低于其他幾種谷物蛋白?；ń纷讶逝c籽殼4種蛋白間的比例與幾種谷物蛋白完全不同，有較明顯的差距，具有獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成特性，是一種不同于谷物蛋白的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。

2.6 花椒籽仁和花椒籽殼4種蛋白的亞基相對(duì)分子質(zhì)量分布

采用SDS-PAGE 電泳，分析了花椒籽仁、花椒籽殼 Osborne 分類后的各種蛋白質(zhì)亞基分布情況，結(jié)果如圖3、圖4所示。

注：1.Marker；2.清蛋白；3.球蛋白； 4.醇溶蛋白；5.谷蛋白。

圖3 花椒籽仁4種蛋白的SDS- PAGE 電泳圖譜

注：1.Marker；2.清蛋白；3.球蛋白； 4.醇溶蛋白；5.谷蛋白。

圖4 花椒籽殼4種蛋白的SDS- PAGE 電泳圖譜

由圖3可見，花椒籽仁中4種蛋白都明顯地檢測到電泳條帶，清蛋白亞基相對(duì)分子質(zhì)量分別為11.331、19.676、26.623、34.675 kDa，球蛋白為11.331、20.644、26.623、33.636 kDa，醇溶蛋白為20.644、34.675 kDa，谷蛋白為12.840、19.842、38.585 kDa。清蛋白和球蛋白亞基分布范圍較廣，兩者含有2個(gè)相同的亞基，其余2個(gè)亞基分子大小也相似，但相對(duì)含量不同。

由圖4可見，花椒籽殼中4種蛋白亞基含量都較少，其中清蛋白含有2個(gè)條帶，其亞基相對(duì)分子質(zhì)量分別為19.711、35.000 kDa，這與花椒籽仁脫脂粉粗蛋白的亞基分布大致相同，球蛋白的亞基相對(duì)分子質(zhì)量分別為17.331、19.711 kDa，其中球蛋白與清蛋白有1個(gè)相同亞基，而醇溶蛋白與谷蛋白都沒有檢測到電泳條帶，這有可能是醇溶蛋白含量較低且不溶于水，導(dǎo)致其在電泳進(jìn)樣時(shí)容易上浮，谷蛋白電泳圖有嚴(yán)重的拖尾且也未檢測到條帶，有可能是花椒籽殼中的谷蛋白亞基相對(duì)分子質(zhì)量較大所致。

花椒籽仁相比于花椒籽殼，醇溶蛋白多了2個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量在18.400～35.000 kDa之間的亞基，谷蛋白多了3個(gè)0～45.000 kDa之間的亞基，說明花椒籽仁中的醇溶蛋白和谷蛋白更容易被人體吸收?；ń纷讶?種蛋白組分與花椒籽仁粗蛋白的電泳圖譜(圖2)相比較，缺少2條相對(duì)分子質(zhì)量在45.000～66.200 kDa之間的亞基，有可能是在Osborne 分類提取過程中被除去。

3 結(jié) 論

通過對(duì)比花椒籽仁與花椒籽殼蛋白，發(fā)現(xiàn)脫脂后的花椒籽仁、籽殼中蛋白質(zhì)含量分別為61.17%、8.54%?；ń纷讶?、籽殼粗蛋白的等電點(diǎn)分別為3.5和4.5。花椒籽仁與籽殼脫脂粉的氨基酸組成中必需氨基酸種類豐富，各種氨基酸組成比例相近，兩者都以天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量最為豐富。從SDS-PAGE 電泳圖譜中可以看出，花椒籽仁粗蛋白亞基相對(duì)分子質(zhì)量分布廣泛，含有7個(gè)條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量介于0～66.200 kDa之間，花椒籽殼粗蛋白僅檢測出2個(gè)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍較小，介于18.400～35.000 kDa之間。花椒籽仁、籽殼蛋白通過Osborne分類法研究發(fā)現(xiàn)，4種蛋白組分的含量大小都依次為球蛋白>谷蛋白>清蛋白>醇溶蛋白，籽仁球蛋白的含量高達(dá)72.06%，醇溶蛋白含量極少，只有1.22%。通過對(duì)4種蛋白的SDS-PAGE 電泳結(jié)果分析表明，花椒籽仁各蛋白組分的相對(duì)分子質(zhì)量較小，分布較為廣泛，花椒籽殼中4種蛋白相對(duì)分子質(zhì)量小的亞基數(shù)量較少，分布范圍較小，其中醇溶蛋白和谷蛋白未檢出譜帶?；ń纷训鞍踪|(zhì)含量豐富，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，花椒籽仁含有大量的相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白，容易吸收，且球蛋白含量豐富，可以較好地添加到食品、保健品等領(lǐng)域；花椒籽殼中蛋白質(zhì)含量相對(duì)較少，其蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大，可以應(yīng)用到菌類養(yǎng)殖、飼料以及菌體培養(yǎng)等方面。