不同固定液對小麥小孢子發(fā)育和花粉育性檢測的影響

劉海英，甄俊琦，茹振鋼，董 娜，高 遠， 馮必得，張 麗，師學珍

(1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007； 2.河南科技學院小麥研究中心， 河南新鄉(xiāng) 453003； 3.河南師范大學新聯(lián)學院，河南新鄉(xiāng) 453007)

利用雜種優(yōu)勢是提高小麥產量最有效的途徑之一[1]。C49S[2]、BS210[3]和K78S[4]等溫光敏小麥雄性不育系的育成，為“二系法”雜交小麥制種提供了種質保障。研究小麥雄性不育系小孢子發(fā)育過程并檢測花粉育性的變化，是揭示其敗育機理的細胞學依據(jù)[5]。

前人對玉米[6]、小麥[7-8]和水稻[9]等作物小孢子發(fā)育和育性檢測開展了大量研究。目前，常用I2-KI染色法指示小孢子內的淀粉積累情況，用醋酸洋紅和DAPI染色法指示細胞核情況。樣品固定液主要有FAA和卡諾氏固定液兩種，但對這兩種固定液在采用不同染色方法時是否會對觀察結果產生實質性影響，是何種影響，目前尚未見 報道。

小麥溫敏雄性不育系BNS366由河南科技學院茹振鋼教授育成，抽穗前低于8.9 ℃的日平均溫度可誘導其花粉敗育[7,10]，其近等基因系為鄭麥366。在本試驗前期研究中嘗試過用FAA固定液對小麥小孢子進行長期固定，然后采用上述3種方法染色后觀察小麥小孢子發(fā)育進程，發(fā)現(xiàn)I2-KI染色法指示淀粉積累情況效果良好，但醋酸洋紅和DAPI染色的細胞核模糊不清；接著進行了改進，將固定后樣品經(jīng)過70%～70%乙醇(每次30 min)置換并保存在70%乙醇中，然后再染色觀察，I2-KI染色法對淀粉積累情況指示效果變化不大，醋酸洋紅染色的小孢子細胞核達到可觀察狀態(tài)[10]，DAPI染色的細胞核依然模糊不清(內部資料未發(fā)表)，推測小麥小孢子樣品固定和保存與其細胞學觀察效果聯(lián)系密切。為此，本試驗以鄭麥366和BNS366為試驗材料，對比了分別采用2種固定液(固定后立即進行乙醇置換)、3種染色方法染色效果和花粉可育率統(tǒng)計結果的差異，為明確其小孢子發(fā)育和花粉育性檢測適宜的樣品固定液提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗在河南師范大學小麥試驗田進行，地處黃淮麥區(qū)(東經(jīng)113°54′，北緯35°19′，海拔 76.3 m)，屬于暖溫帶大陸性氣候。

1.2 試驗材料

選擇溫敏小麥雄性不育系BNS366及其近等基因系鄭麥366為供試材料，均由河南科技學院小麥中心提供。于2017年10月11日播種，條播，小區(qū)長3 m，寬1.5 m，行距0.25 m，株距 0.10 m，次年選代表型植株主莖穗進行研究。按一般大田管理方式栽培。

1.3 試驗設計

試驗設置FAA(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林=18∶1∶1)和卡諾氏(無水乙醇∶冰醋酸= 3∶1)兩種固定液處理。參照劉海英等[10]的農藝性狀判斷方法，配合鏡檢，在小孢子發(fā)育的單核期、二核期、三核期和開花期，于上午9:00- 10:00，各選10穗代表型植株主莖穗，剪去頂部與基部各6個小穗，留下中部小穗，分別置于兩種固定液中， 0.034×105Pa抽真空30 min后在4 ℃條件下固定24 h，經(jīng)90%—80%—70%—70%梯度置換固定液(每次置換時間均為30 min)，最后轉入70%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞學觀察

分別取FAA和卡諾氏固定液固定的材料，參照劉海英等[10]的方法進行I2-KI法和醋酸洋紅法染色、制片、觀察和花粉育性統(tǒng)計。DAPI與I2-KI染色法相似，不同之處在于染色過程為滴加1 mg·L-1DAPI溶液且避光條件下靜置3 min左右，在Leica DMIL倒置熒光顯微鏡下用紫外光觀察、拍照和統(tǒng)計，小孢子細胞核呈發(fā)白發(fā)亮狀態(tài)，可育花粉判斷標準同醋酸洋紅染色法。

1.5 套袋自交結實率調查統(tǒng)計

于抽穗后開花前各隨機選取10個麥穗分別套袋，成熟期按國內法[9]調查和統(tǒng)計自交結實率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結果與分析

2.1 不同固定液對小孢子發(fā)育進程中不同染色法染色效果的影響

2.1.1 對I2-KI法染色效果的影響

由圖1可知，采用FAA固定液固定， 經(jīng)I2-KI法染色后，在單核期，鄭麥366小孢子(圖1A)和BNS366小孢子(圖1E)均能觀察到一個細胞核，以BNS366的細胞核清晰度相對較高。在二核期之后，鄭麥366絕大部分小孢子始終維持圓形，細胞內開始積累淀粉，并隨發(fā)育進程推進，積累的淀粉逐漸增多，至開花期淀粉充滿整個細胞，細胞核由于淀粉積累區(qū)域的遮擋模糊不清(二核期)，至三核期之后完全觀察不到；BNS366則半數(shù)以上細胞開始出現(xiàn)皺縮變形，且隨發(fā)育進程推進，細胞變形程度加劇，變形細胞數(shù)量增多，在二核期僅見少數(shù)細胞內有較少量淀粉積累，之后細胞內未見淀粉存在，大部分細胞難以正常進入二核期，且細胞核逐漸減小(二核期)直至消失(三核期之后)。由圖2可知，與FAA固定液相比，采用卡諾氏固定液固定、I2-KI法染色后，在二核期，細胞核清晰程度略有提高，但同樣由于染色區(qū)域的遮擋難以滿足細胞學觀察的要求；在二核期之后小孢子中I2-KI法染色區(qū)域顏色較淺，但不影響開花期對花粉育性的判斷。

A～D:鄭麥366; E～F:BNS366; A、E:單核期; B、F:二核期; C、G:三核期; D、H:開花期. 下同。

A-D:Zhengmai 366; E-F:BNS366; A and E:Uninucleate period; B and F:Binucleate period; C and G:Trinucleate period; D and H:Flowering period. The same in figures 2-6.

圖1 FAA固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的I2-KI染色結果

Fig.1 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with I2-KI when fixed with FAA

圖2 諾氏固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的I2-KI染色結果Fig.2 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with I2-KI when fixed with carnoys

以上結果表明，BNS366小孢子敗育在單核期向二核期轉變時開始。采用兩種固定液固定、I2-KI染色法染色，均可以清晰地反映小孢子內淀粉積累的情況，輔助判斷花粉育性，其中采用FAA固定液固定，對小孢子內淀粉積累情況的指示效果較好；但均無法清晰觀察二核期之后細胞核的情況。

2.1.2 對醋酸洋紅法染色效果的影響

由圖3和圖4可知，采用兩種固定液固定，經(jīng)醋酸洋紅法染色后觀察到的鄭麥366和BNS366小孢子發(fā)育過程中細胞外形的變化和內容物積累情況與I2-KI染色法相似，細胞內容物能被醋酸洋紅淺染但不適宜指示其成分。采用兩種固定液固定，在鄭麥366小孢子發(fā)育的不同時期，均可見到紅色的細胞核，且隨發(fā)育進程推進，細胞核的染色程度加重，二核期少量存在的細胞內容物對細胞核觀察影響不大，三核期大量內容物與細胞核染色程度差別較小，難以同時觀察到三個清晰的細胞核，開花期內容物充實，能清晰看到兩個梭型精核和一個圓形營養(yǎng)核，在單核期和二核期采用FAA固定液固定細胞核清晰度較高，在三核期和開花期采用卡諾氏固定液固定細胞核清晰度較高；在BNS366小孢子細胞核染色程度變淺，大部分小孢子僅有一個細胞核，僅少數(shù)細胞可見兩個細胞核，三核期多數(shù)小孢子內有比二核期縮小的細胞核，少數(shù)小孢子內觀察不到細胞核，開花期絕大部分小孢子不能被深染，細胞核消失不見，個別小孢子內可見一個比三核期繼續(xù)縮小的細胞核，兩種固定液固定之間無顯著差異。

圖3 FAA固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的醋酸洋紅染色結果Fig.3 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with acetate carmine when fixed with FAA

圖4 卡諾氏固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的醋酸洋紅染色結果Fig.4 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with acetate carmine when fixed with carnoys

以上結果表明，采用醋酸洋紅染色法觀察到的鄭麥366和BNS366小孢子發(fā)育進程與I2-KI染色法的基本一致，其優(yōu)勢在于對各時期細胞核的指示效果較好。采用兩種固定液固定，對不同時期發(fā)育小孢子的顯微觀察效果存在差異，在單核期和二核期，采用FAA固定液固定效果較好，在三核期和開花期，采用卡諾氏固定液固定效果較好。

2.1.3 對DAPI法染色效果的影響

由圖5和圖6可知，采用兩種固定液固定，經(jīng)DAPI法染色后觀察到的鄭麥366和BNS366小孢子發(fā)育過程中細胞外形的變化和內容物積累情況與上述兩種染色法也基本一致，不同之處在于細胞內容物積累情況僅能通過略顯白色區(qū)域判斷。DAPI染色法觀察到的細胞學變化與醋酸洋紅染色法相似，但DAPI法染色后細胞核發(fā)白高亮，與細胞質略顯白色背景之間形成強烈反差，細胞核清晰度明顯高于醋酸洋紅法。與FAA固定液固定相比，采用卡諾氏固定液固定，小孢子細胞核清晰度較低，且在二核期和三核期出現(xiàn)細胞質區(qū)域色調偏紅的現(xiàn)象。這些結果表明，在與前兩種染色法觀察到的小孢子發(fā)育規(guī)律基本吻合的前提下，DAPI染色法比醋酸洋紅染色法在清晰指示細胞核情況方面的優(yōu)勢更強，采用FAA固定液固定，小孢子細胞核清晰度較高，細胞圖像色調正常，效果更可靠。

圖5 FAA固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結果Fig.5 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with DAPI when fixed with FAA

圖6 卡諾氏固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結果Fig.6 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with DAPI when fixed with carnoys

2.2 花粉育性與自交結實率比較

在鄭麥366開花期取樣，分別采用兩種固定液固定，經(jīng)3種染色方法對花粉染色后，統(tǒng)計花粉育性，并與成熟期自交結實率進行比較分析。結果表明，采用FAA固定液固定，I2-KI(99.07%)和DAPI(97.47%)染色法以及采用卡諾氏固定液固定，I2-KI(95.59%)、醋酸洋紅(93.43%)和DAPI染色法(94.86%)染色的花粉可育率基本一致，高于采用FAA固定液固定、醋酸洋紅染色法染色的花粉可育率(72.15%)和自交結實率(70.83%)。

3 討 論

采用I2-KI、醋酸洋紅和DAPI染色法染色，均可以清楚觀察到BNS366敗育時期在單核期到二核期，這與賀曉敏等[7]的研究結果相一致。BNS366的近等基因系鄭麥366則表現(xiàn)出正?？捎←湹男℃咦影l(fā)育細胞學特征。這表明本試驗模型細胞學現(xiàn)象準確可靠，可以進一步開展細胞學觀察效果的比較研究。

固定液成分不同，其固定效果也不同，存在引起細胞學觀察效果差異的可能。FAA固定液組成成分(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林=18∶1∶1)中促使材料收縮的乙醇和福爾馬林的相對比例較高，對小麥小孢子內容物及細胞核等細胞學特征的高保真固定均有利。劉子涵等[8]和趙卜等[11]采用FAA固定液固定不同時期的小麥花藥，I2-KI法和DAPI法染色后可分別清晰指示淀粉積累和細胞核狀況，醋酸洋紅染色后則由于內容物也可以被淺染，造成細胞質和細胞核反差小，導致細胞核不易觀察。本試驗結果顯示，采用FAA固定液固定，I2-KI和DAPI染色法染色，細胞圖像均清晰明了，在單核期和二核期，細胞內容物尚不豐富的條件下，醋酸洋紅染色法可以較好地指示細胞核情況，在三核期之后細胞圖像清晰度不理想，與前人研究結果基本一致?？ㄖZ氏固定液組成成分(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中促使材料膨脹的冰醋酸含量較高，具有軟化細胞壁的作用[12]，有助于小孢子內容物的釋放，降低其對細胞核的遮擋效應。王小利等[13]和錢煥煥等[14]采用卡諾氏固定液固定小麥穗，I2-KI法淀粉染色效果基本正常，醋酸洋紅法也存在細胞內大量內容物影響細胞核清晰度的現(xiàn)象，與FAA固定液條件下小孢子顯微觀察效果相似，但由于前人一般在某一種固定液條件下開展研究，難以在兩種固定液之間進行比較分析，DAPI染色的細胞核模糊且在有些樣品細胞質區(qū)域色調偏紅，推測樣品特殊性和固定液種類與這種現(xiàn)象的發(fā)生均可能有關，這需要在同一樣品體系下，采用FAA和卡諾氏固定液經(jīng)上述3種染色法染色后對小孢子發(fā)育細胞學特征進行觀察和比較研究，對此目前尚未見報道。本試驗條件下，與FAA固定液固定相比，采用卡諾氏固定液固定，I2-KI法染色效果較淺，但不影響對淀粉積累情況的判斷，醋酸洋紅法染色可以清晰顯示細胞核情況，在單核期和二核期細胞核清晰度較低，但在三核期之后較高，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，DAPI法染色細胞圖像略模糊且色調偏紅，與已有研究結果基本吻合。這表明樣品固定液種類確實與小孢子顯微觀察效果關系密切，染色法不同，適宜采用的樣品固定液不同，即使同一染色法在小麥小孢子不同發(fā)育階段，適宜的樣品固定液也不同，對于I2-KI、單核期和二核期醋酸洋紅和DAPI染色法均以采用FAA固定液較適宜，對于三核期和開花期醋酸洋紅染色法來說，采用卡諾氏固定液較好。

花粉育性檢測結果往往需要與自交結實率進行相關性分析，以驗證花粉育性檢測手段的準確性[10]。本研究中，與自交結實率相比，除采用FAA固定液固定、醋酸洋紅染色法染色外，采用兩種固定液固定，經(jīng)3種染色方法檢測到的花粉可育率一致偏高。原因可能是自交結實率來自整穗統(tǒng)計結果，而花粉可育率統(tǒng)計來自穗中部第1、第2位小花，即來自強勢部位強勢小花，進一步改進花藥取樣方法可能有助于解決二者不一致的問題，對此尚需開展進一步研究。采用FAA固定液固定、醋酸洋紅染色的花粉可育率較低且與自交結實率一致，可能是FAA固定液對樣品的高保真固定不利于開花期小孢子細胞內容物釋放，細胞核與細胞質反差較小，細胞圖像清晰度較低，凡不能看清細胞核特征的花粉粒均被計為不育花粉，導致可育花粉計數(shù)偏低所致。